Estrazione, etichettatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani

Gli elementi funzionali primari dell'ovaio umano sono i follicoli, che governano la crescita e lo sviluppo degli ovociti. I protocolli per l'isolamento delle cellule follicolari sono stati ben stabiliti nel contesto della fecondazione in vitro , ma questi sono appropriati solo per la raccolta di cellule da follicoli luteinizzati nel punto di prelievo ovocitario¹. Abbiamo sviluppato un protocollo che consente l'isolamento di popolazioni cellulari discrete da follicoli antrali in diversi stadi di sviluppo che derivano da ovaie native o tessuto ovarico xenotrapiantato². Sebbene vi sia consenso sul fatto che i contributi delle cellule residenti nel follicolo alla coltivazione dell'ovocita siano molto importanti, pochi studi hanno identificato ed estratto prospetticamente i sottotipi fenotipici unici presenti nei follicoli dello stadio antrale. Una comprensione più profonda della gerarchia di differenziazione e della trasduzione del segnale tra cellule specializzate durante le diverse fasi di sviluppo potrebbe ampliare la nostra comprensione della fisiologia ovarica in condizioni omeostatiche e patologiche. Inoltre, la discriminazione dei sottotipi cellulari discreti e i loro contributi molecolari alla crescita/maturazione del follicolo possono fornire un mezzo per generare surrogati ex vivo che ricostruiscono la funzione ovarica per favorire la maturazione degli ovociti e/o trattare la disfunzione endocrina.

Ogni tipo di cellula unica all'interno dell'ovaio contribuisce alla complessa funzione del follicolo, che funziona efficacemente come un mini-organo discreto per favorire la crescita e la maturazione dell'ovocita che contiene. L'ovocita, il fulcro del follicolo, è direttamente avvolto da uno strato continuo di cellule della granulosa (GC), con le cellule della teca (TC) che formano uno strato secondario di cellule che si combinano con l'ovocita e i GC per comporre l'unità follicolare. Sebbene classificati in due gruppi, GC e TC contengono numerosi sottotipi. I GC sono classificati in base alla loro posizione all'interno del follicolo; I GC che circondano l'ovocita rispetto a quelli adiacenti alla membrana basale sono designati rispettivamente come GC oophorous e murali e questi sottotipi mostrano firme trascrittomiche uniche. I TC hanno numerosi sottotipi che funzionano per fornire supporto steroidogenico, metabolico e strutturale. Le cellule endoteliali, perivascolari e immunitarie svolgono un ruolo centrale nel mantenimento della normale fisiologia ovarica. Lo stroma ovarico serve non solo come substrato per la crescita del follicolo, ma probabilmente fornisce anche una fonte di progenitori che danno origine ai TC. Questo complesso multistrato di sottotipi cellulari all'interno dell'ovaio è ciò che consente la sua funzione sia come organo endocrino che riproduttivo.

Questo articolo presenta un protocollo per l'identificazione e la purificazione di cellule granulosa, teca, stromale, endoteliali ed ematopoietiche dai follicoli antrali. Abbiamo utilizzato questo protocollo per isolare queste cellule ovariche e analizzarle utilizzando il sequenziamento a singola cellula, seguito da colorazioni specifiche nei follicoli di diversi stadi di sviluppo. Il protocollo fornisce una metodologia semplice che è replicabile e consentirà l'analisi ad alta risoluzione sia della fisiologia che della patologia dell'ovaio.

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso Weill Cornell Medicine. Tutti gli esperimenti di xenotrapianto, utilizzando tessuto ovarico, sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Entrambe le ovaie sono state isolate da un donatore di organi cerebralmente morto di 14 anni senza storia di radio / chemioterapia e nessuna storia documentata di condizioni endocrine o riproduttive. Il comitato di revisione istituzionale (IRB) della Weill Cornell Medicine ha approvato la raccolta di tessuti e l'approvazione da parte della famiglia del donatore di organi è stata ottenuta a seguito del consenso informato sull'uso del tessuto.

1. Raccolta e manipolazione del tessuto ovarico

1. Raccogliere le ovaie intere e il tessuto associato e risciacquare in soluzione salina sterile.
2. Usando una pinzetta sterile, posizionare le ovaie in un contenitore sterile. Versare una soluzione fredda sterile, tamponata e tamponata (ad esempio, terreno L-15 di Leibovitz) nel contenitore. Assicurarsi che il tessuto sia completamente coperto con il liquido.
3. Chiudere il contenitore e sacchettarlo due volte con sacchetti di plastica sterili. Trasportare il contenitore sul ghiaccio all'interno di una scatola isolata (ad esempio, polistirolo). Trasferire i campioni al laboratorio che elaborerà le ovaie il prima possibile, preferibilmente in un tempo non superiore a 5 h ^3,4.

2. Elaborazione del tessuto ovarico

NOTA: Assicurarsi che tutti i reagenti e gli strumenti siano preparati prima che il tessuto arrivi in laboratorio per ridurre il più possibile l'intervallo ischemico. I tamponi possono essere preparati fino a 1 settimana prima del congelamento e refrigerati fino all'uso.

1. Preparazioni per la lavorazione ovarica e il congelamento
   1. Impostare strumenti chirurgici sterilizzati nell'armadio di biosicurezza in preparazione per la lavorazione dei tessuti: un bisturi numero 21; un bisturi numero 11; forbici curve sottili e affilate; una pinza lunga (~ 150 mm di lunghezza); e due pinze medie (~ 110 mm di lunghezza).
   2. Preparare 100 ml di terreno di trattamento tissutale (vedere la tabella dei materiali): terreno L-15 di Leibovitz contenente soluzione antibiotico-antimicotica e filtrato utilizzando un filtro da 0,2 μm. Mantenere il mezzo refrigerato.
   3. Etichettare i crioviali, aggiungere 1,5 mL di soluzione congelante (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun flaconcino e conservarlo a 4 °C.
   4. Avere a disposizione una piastra a 6 pozzetti a portata di mano per l'uso.
2. All'arrivo del tessuto
   1. Spruzzare il contenitore con una soluzione di etanolo al 70%, pulire accuratamente e posizionarlo all'interno dell'armadio di biosicurezza.
   2. Indossando guanti sterili, aprire il contenitore. Porre l'ovaia in una capsula di Petri sterile e versare un mezzo refrigerato (dal punto 2.1.2) per idratare il tessuto. Assicurarsi che l'ovaio sia semi-immerso nel mezzo.
   3. Rimuovere eventuali punti di sutura o altro materiale e sezionare il tessuto circostante residuo lontano dall'ovaio.

3. Isolamento dei follicoli antrali

1. Identificare i singoli follicoli per l'isolamento. Nella scelta dei follicoli sani, escludere eventuali follicoli pieni di sangue, scuri o non simmetrici, poiché è probabile che siano atretici.
2. Isolare i follicoli antrali scelti da tutto l'ovaio usando bisturi, mantenendo intatto l'antro asportando il tessuto corticale che comprende il follicolo.
3. Posizionare ciascun follicolo antrale intatto asportato in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti. Se necessario per scopi descrittivi, utilizzare un righello posto sotto il piatto per determinare il diametro del follicolo.
4. Usando un bisturi, taglia in due il follicolo antrale intatto per accedere alla cavità antrale e aggiungi 4 ml di mezzo di distacco enzimatico delle cellule. Incubare la piastra in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ e 37 °C per 10 minuti.
5. Ripetere l'estrazione di ulteriori follicoli antrali, se necessario.

4. Isolamento delle cellule residenti del follicolo

1. Dopo l'incubazione, aggiungere 4 ml di terreno disponibile contenente il 20% di FBS e lavare mediante pipettaggio ripetuto e vigoroso del mezzo sui follicoli bisecati con una micropipetta P1.000.
2. Raccogliere il mezzo e passarlo attraverso un filtro da 100 μm.
3. Centrifugare il surnatante filtrato a 300 × g e 4 °C per 3 min. Aspirare il surnatante e riservare il pellet cellulare (arricchito con GC) sul ghiaccio per l'etichettatura e la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS).
4. Porre il tessuto rimanente in una miscela di collagenasi (100 U/mL) e dispasi (1 U/mL) diluita in una soluzione salina bilanciata (ad esempio, Hanks) e incubare per 30 minuti al 5% di CO₂ e 37 °C, interrompendo meccanicamente il tessuto mediante triturazione e pipettaggio vigoroso (cioè 10-15 passaggi attraverso la punta del pipet) due volte dopo 10 minuti e 20 minuti.
5. Recuperare i fluidi contenenti il tessuto, lavare tramite pipettaggio attraverso una punta di micropipetta P1.000 e filtrare attraverso un filtro da 100 μm.
6. Centrifugare a 300 × g e 4 °C per 3 min. Aspirare il surnatante e mettere da parte il pellet cellulare (arricchito con TC e cellule di stroma) sul ghiaccio per l'etichettatura e FACS.

5. Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza

1. Risospendere i pellet cellulari in soluzione bloccante (PBS + 0,1% FBS) e incubare per 10 minuti a 4 °C.
2. Centrifugare a 300 × g e 4 °C per 3 minuti e aspirare il surnatante.
3. Risospendere i pellet cellulari in soluzione bloccante contenente anticorpi direttamente coniugati (vedere Tabella 1 per le combinazioni di anticorpi appropriate per identificare GC e TC) e incubare su ghiaccio per 10 minuti.
4. Lavare e centrifugare le celle a 300 × g e 4 °C per 3 min. Risospendere le cellule in tampone FACS contenente 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) ed eseguire la sospensione cellulare attraverso uno strumento FACS per catturare una piccola popolazione di cellule (500-1.000) utilizzando l'intensità di fluorescenza degli anticorpi coniugati con fluorofori per il gating.
5. Per l'identificazione di sottopopolazioni uniche, utilizzare le seguenti strategie di gating:
   1. Per la purificazione dei GC, disegnare un cancello attorno alle cellule CD45+ (Figura 1B) ed escludere questa popolazione dalla popolazione CD99⁺ (Figura 1A e Figura 1C); quindi, suddividere ulteriormente la frazione CD99+ rimanente in frazioni PVRL^+/- (Figura 1A e Figura 1C).
   2. Per la purificazione di TC e stroma, eliminare la popolazione totale ENG+ (Figura 1A) o CD55+ (Figura 1D) per escludere la frazione endoteliale CD34+ (Figura 1E) e distinguere le cellule steroidogeniche (ANPEP⁺) e non steroidogeniche (^ANPEP-). Fare attenzione a compensare il sanguinamento tra i fluorofori che sono vicini negli spettri di emissione.
6. Per convalidare la purezza della frazione cellulare ordinata, eseguire il 5% del volume totale acquisito attraverso lo strumento FACS e assicurarsi che le celle popolino le porte previste e siano presenti con una purezza del >95%.

6. Elaborazione del tessuto corticale ovarico

1. Taglia in due il resto dell'ovaio e asporta il midollo usando forbici sottili e bisturi curvi, facendo attenzione a evitare danni alla corteccia ovarica.
2. Continuare a elaborare e assottigliare la corteccia ovarica raschiando delicatamente fino a quando rimane un midollo minimo. Assicurarsi di utilizzare la forza minima necessaria.
   NOTA: Lo spessore del tessuto corticale deve essere compreso tra 1 mm e 1,5 mm.
3. Dividere il tessuto corticale in strisce larghe 2-3 mm lungo la lunghezza dell'ovaio.

7. Congelamento lento del tessuto ovarico

1. Preparazione per il congelamento
   1. Introdurre una striscia corticale in ciascun flaconcino criogenico refrigerato contenente una soluzione congelante.
   2. Agitare i flaconcini criogenici contenenti le strisce corticali su una piastra rotante per 20 minuti a 4 °C.
2. Congelamento lento del tessuto ovarico⁵
   1. Introdurre i crioviali contenenti tessuto ovarico in un congelatore programmabile impostato a partire da 0 °C.
   2. Raffreddare ad una velocità di 2 °C/min fino a -7 °C.
   3. Mantenere i crioviali a questa temperatura per 10 minuti.
   4. Formazione di cristalli di ghiaccio nucleati toccando ogni crioviale con una punta di cotone che è stata brevemente immersa nell'azoto liquido (LN₂).
   5. Raffreddare ad una velocità di 0,3 °C/min fino a quando la temperatura del campione raggiunge -40°C.
   6. Aumentare la velocità di raffreddamento a 10 °C/min fino a quando la temperatura del campione raggiunge -140 °C.
   7. Trasferire i crioviali per la conservazione in LN₂.

Abbiamo isolato i follicoli dalla superficie dell'ovaio e li abbiamo trattati enzimaticamente per isolare i GC e le cellule di teca e stroma che circondano la cavità antrale. Le cellule sono state raccolte e le frazioni cellulari sono state selezionate dai follicoli antrali (diametri compresi tra 0,5 mm e 4 mm) mediante FACS a purezza del >95% (Figura 1).

Per etichettare e purificare frazioni cellulari uniche all'interno dei follicoli antrali umani, abbiamo combinato la digestione enzimatica con lo smistamento citometrico a flusso. In precedenza abbiamo identificato proteine di superficie che marcano specificamente le frazioni residenti nel follicolo2. Abbiamo dimostrato che CD99 (rosso in Figura 1A) etichetta specificamente i GC e PVRL1 (giallo nella Figura 1A) è sempre più localizzato nel compartimento GC opforico man mano che i follicoli antrali aumentano di dimensione2. Abbiamo anche dimostrato che gli anticorpi contro l'endoglina (ENG, verde in Figura 1A) o CD55 (Figura 1D) delimitano specificamente tutti gli stroma e i TC e che l'alanina aminopeptidasi (ANPEP, Figura 1E) è specificamente espressa dai TC androgeni 2,6.

Le cellule sono state marcate con un anticorpo diretto contro CD99 per identificare i GC e gli anticorpi contro CD45 sono stati utilizzati per escludere le cellule ematopoietiche (Figura 1B, C). Gli anticorpi contro PVRL1 hanno permesso la separazione della popolazione GC in compartimenti oophorous e murali (Figura 1C). Dopo digestione enzimatica con collagenasi/dispasi, i preparati cellulari marcati con anticorpi contro CD55 (o in alternativa ENG), CD34 e ANPEP hanno permesso la cattura di tutti i TC stroma/TCs (CD55+) e/o androgeni (ANPEP+), con l'esclusione delle cellule endoteliali (CD34+) dalle popolazioni TC (Figura 1D,E). Utilizzando questo pannello e un protocollo di dissociazione enzimatica graduale, abbiamo etichettato e purificato le cellule ematopoietiche, endoteliali, granulosa (oophorous e murale) e teca (stromali e androgeni) dai follicoli antrali delle ovaie appena resecate.

Figura 1: Marcatura e purificazione di cellule specifiche del lignaggio da follicoli antrali umani. (A) Micrografia rappresentativa che mostra i compartimenti GC (CD99+ PVRL+/-) e TC (ENG+) all'interno dei follicoli umani allo stadio antrale; Le caselle dei tratti bianche sono ingrandite a destra. (B-E) Grafici di ordinamento rappresentativi che identificano i GC come cellule CD45- CD99+ PVRL1+/- (a e b) e generiche (CD34- CD55+) e androgene (CD34- CD55+ ANPEP+) (C,D). Le popolazioni recintate sono condivise tra (B,C) e (D,E); i controlli non colorati sono mostrati a sinistra in (B-E). Barra della scala = (A) 100 μm. Abbreviazioni: GC = cellula granulosa; TC = cellula teca; PVRL = nectina; ANPEP = alanina aminopeptidasi; Nuc = nuclei; SSC = dispersione laterale; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Elenco degli anticorpi che possono essere utilizzati per identificare GC, TC e stroma ovarico. Abbreviazioni: GC = cellula granulosa; TC = cellula teca.

Tutti gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.