Articolo metodologico
È necessario un modello fisiologico in vivo di α-sinucleina per studiare e comprendere la patogenesi della malattia di Parkinson. Descriviamo un metodo per monitorare la citotossicità e la formazione di aggregati di α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato.
La malattia di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerativa più comune ed è caratterizzata da una progressiva morte cellulare causata dalla formazione di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina mal ripiegata e aggregata. α-sinucleina è un'abbondante proteina presinaptica che regola il traffico delle vescicole sinaptiche, ma l'accumulo delle sue inclusioni proteiche provoca neurotossicità. Studi recenti hanno rivelato che vari fattori genetici, tra cui gli chaperoni batterici, potrebbero ridurre la formazione di aggregati di α-sinucleina in vitro. Tuttavia, è anche importante monitorare l'effetto anti-aggregazione nella cellula per applicarlo come potenziale trattamento per i pazienti. Sarebbe ideale utilizzare cellule neuronali, ma queste cellule sono difficili da gestire e richiedono molto tempo per mostrare il fenotipo anti-aggregazione. Pertanto, è necessario uno strumento in vivo rapido ed efficace per l'ulteriore valutazione dell'attività antiaggregazione in vivo. Il metodo qui descritto è stato utilizzato per monitorare e analizzare il fenotipo anti-aggregazione nel lievito umanizzato Saccharomyces cerevisiae, che esprimeva α-sinucleina umana. Questo protocollo dimostra strumenti in vivo che potrebbero essere utilizzati per monitorare la tossicità cellulare indotta da α-sinucleina, nonché la formazione di aggregati di α-sinucleina nelle cellule.
La malattia di Parkinson (PD) è un problema serio per le società che invecchiano in tutto il mondo. L'aggregazione della α-sinucleina è strettamente associata alla malattia di Parkinson e gli aggregati proteici della α-sinucleina sono ampiamente utilizzati come biomarcatore molecolare per diagnosticare la malattia1. α-sinucleina è una piccola proteina acida (140 amminoacidi di lunghezza) con tre domini, vale a dire la α-elica legante i lipidi N-terminale, il dominio centrale legante l'amiloide (NAC) e la coda acida C-terminale2. Il misfolding della α-sinucleina può verificarsi spontaneamente e alla ....
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1. Preparazione di supporti e soluzioni
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L'alta espressione di α-sinucleina è nota per essere collegata alla morte delle cellule neuronali e alla malattia di Parkinson in sistemi modello di PD. Questo studio descrive tre metodi per monitorare la citotossicità della α-sinucleina e la formazione di focolai di α-sinucleina aggregata nel lievito. Qui, la α-sinucleina è stata sovraespressa nel lievito e sono stati esaminati i fenotipi della α-sinucleina wild-type e tre varianti della α-sinucleina note come mutanti familiari della malattia di Parkinson (
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Data la complessità dei vari sistemi cellulari nell'uomo, è vantaggioso utilizzare il lievito come modello per lo studio delle malattie neurodegenerative umane. Sebbene sia quasi impossibile studiare le complesse interazioni cellulari del cervello umano usando il lievito, da una prospettiva monocellulare, le cellule di lievito hanno un alto livello di somiglianza con le cellule umane in termini di omologia della sequenza genomica e processi cellulari eucariotici fondamentali 8,13
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamo James Bardwell e Tiago F. Outeiro per aver gentilmente condiviso i plasmidi contenenti α-sinucleina. Changhan Lee ha ricevuto finanziamenti dalla National Research Foundation of Korea (NRF) finanziati dal governo coreano (MSIT) (sovvenzione 2021R1C1C1011690), dal Basic Science Research Program attraverso la NRF finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione (sovvenzione 2021R1A6A1A10044950) e dal nuovo fondo di ricerca della facoltà dell'Università di Ajou.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| piastra a 96 pozzetti | SPL | 30096 | |
| Agarosio | TAESHIN | 0158 | |
| Bacto Agar | BD Difco | 214010 | |
| Breathe-easy | diversified biotech | BEM-1 | Membrana sigillante permeabile ai gas per piastre per microtitolazione |
| vetri di copertura | Marienfeld | 24 x 60 mm | |
| Provetta per coltura | SPL | 40014 | |
| Cuvette | ratiolab | 2712120 | |
| D-(+)-Galattosio | sigma | G0625 | |
| D-(+)-Glucosio | sigma | G8270 | |
| D-(+)-Raffinosio pentaidrato | Daejung | 6638-4105 | |
| Incubatore (agitazione) | Modello Labtron | : SHI1 | |
| Incubatore (statico) | Vision scientific | modello: VS-1203PV-O | |
| LiAc | sigma | L6883 | |
| Lettore di micropiastre | Tecan | 30050303 01 | Modello: Pipetta multicanale Infinite 200 pro |
| 20-200 µ L | gilson | FA10011 | |
| pipetta multicanale 2-20 & micro; L | gilson | FA10009 | |
| Microscopio Olympus | Olympus | IX-53 | |
| PEG | sigma | P4338 | media mol wt 3.350 |
| Petridish | SPL | 10090 | |
| pRS426 | Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Vettori navetta multifunzionali per lievito ad alto numero di copie. Gene. 110 (1), 119-122 (1992). | ||
| pRS426 GAL1 promotore &alfa;-sinucleina A30P | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Le cellule di lievito forniscono informazioni sulla biologia e sulla patobiologia dell'alfa-sinucleina. Scienza. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotore &alfa;-sinucleina A53T | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Le cellule di lievito forniscono informazioni sulla biologia e sulla patobiologia dell'alfa-sinucleina. Scienza. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotore &alfa;-sinucleina E46K | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Le cellule di lievito forniscono informazioni sulla biologia e sulla patobiologia dell'alfa-sinucleina. Scienza. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| pRS426 GAL1 promotore &alfa;-sinucleina WT | Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Le cellule di lievito forniscono informazioni sulla biologia e sulla patobiologia dell'alfa-sinucleina. Scienza. 302 (5651), 1772-1775 (2003) | ||
| Serbatoio | SPL | 23050 | |
| Spettrofotometro | eppendorf | 6131 05560 | |
| W303a | Presente da James Bardwell | ||
| Lievito base azotata senza aminoacidi | Difco | 291940 | |
| Lievito sintetico drop-out medium integratori senza uracile | sigma | Y1501 | |
| YPD | Condalab | 1547.00 |
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