Un metodo per studiare la tossicità e l'aggregazione della α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato

Summary

È necessario un modello fisiologico in vivo di α-sinucleina per studiare e comprendere la patogenesi della malattia di Parkinson. Descriviamo un metodo per monitorare la citotossicità e la formazione di aggregati di α-sinucleina utilizzando un modello di lievito umanizzato.

Abstract

La malattia di Parkinson è la seconda malattia neurodegenerativa più comune ed è caratterizzata da una progressiva morte cellulare causata dalla formazione di corpi di Lewy contenenti α-sinucleina mal ripiegata e aggregata. α-sinucleina è un'abbondante proteina presinaptica che regola il traffico delle vescicole sinaptiche, ma l'accumulo delle sue inclusioni proteiche provoca neurotossicità. Studi recenti hanno rivelato che vari fattori genetici, tra cui gli chaperoni batterici, potrebbero ridurre la formazione di aggregati di α-sinucleina in vitro. Tuttavia, è anche importante monitorare l'effetto anti-aggregazione nella cellula per applicarlo come potenziale trattamento per i pazienti. Sarebbe ideale utilizzare cellule neuronali, ma queste cellule sono difficili da gestire e richiedono molto tempo per mostrare il fenotipo anti-aggregazione. Pertanto, è necessario uno strumento in vivo rapido ed efficace per l'ulteriore valutazione dell'attività antiaggregazione in vivo. Il metodo qui descritto è stato utilizzato per monitorare e analizzare il fenotipo anti-aggregazione nel lievito umanizzato Saccharomyces cerevisiae, che esprimeva α-sinucleina umana. Questo protocollo dimostra strumenti in vivo che potrebbero essere utilizzati per monitorare la tossicità cellulare indotta da α-sinucleina, nonché la formazione di aggregati di α-sinucleina nelle cellule.

Introduction

La malattia di Parkinson (PD) è un problema serio per le società che invecchiano in tutto il mondo. L'aggregazione della α-sinucleina è strettamente associata alla malattia di Parkinson e gli aggregati proteici della α-sinucleina sono ampiamente utilizzati come biomarcatore molecolare per diagnosticare la malattia¹. α-sinucleina è una piccola proteina acida (140 amminoacidi di lunghezza) con tre domini, vale a dire la α-elica legante i lipidi N-terminale, il dominio centrale legante l'amiloide (NAC) e la coda acida C-terminale². Il misfolding della α-sinucleina può verificarsi spontaneamente e alla ....

Protocol

1. Preparazione di supporti e soluzioni

1. Preparazione dei supporti
   1. Per preparare il mezzo YPD, sciogliere 50 g di polvere YPD in dH₂O per ottenere un volume finale di 1 L. Autoclave per la sterilizzazione. Conservare a temperatura ambiente (RT).
   2. Per rendere YPD agar medio, sciogliere 50 g di polvere YPD e 20 g di agar in 1 L di dH₂O. Autoclave per la sterilizzazione. Dopo aver raffreddato, versare sulle piastre di Petri. Conservare a 4 °C.
   3. Per fare SC con raffinosio (SRd)-Ura mezzo, sciogliere 6,7 g di lievito azotato base con solfato di ammonio e senza amminoacidi in 795 ml di dH₂....

Results

L'alta espressione di α-sinucleina è nota per essere collegata alla morte delle cellule neuronali e alla malattia di Parkinson in sistemi modello di PD. Questo studio descrive tre metodi per monitorare la citotossicità della α-sinucleina e la formazione di focolai di α-sinucleina aggregata nel lievito. Qui, la α-sinucleina è stata sovraespressa nel lievito e sono stati esaminati i fenotipi della α-sinucleina wild-type e tre varianti della α-sinucleina note come mutanti familiari della malattia di Parkinson (

Discussion

Data la complessità dei vari sistemi cellulari nell'uomo, è vantaggioso utilizzare il lievito come modello per lo studio delle malattie neurodegenerative umane. Sebbene sia quasi impossibile studiare le complesse interazioni cellulari del cervello umano usando il lievito, da una prospettiva monocellulare, le cellule di lievito hanno un alto livello di somiglianza con le cellule umane in termini di omologia della sequenza genomica e processi cellulari eucariotici fondamentali ^8,13

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
piastra a 96 pozzetti	SPL	30096
Agarosio	TAESHIN	0158
Bacto Agar	BD Difco	214010
Breathe-easy	diversified biotech	BEM-1	Membrana sigillante permeabile ai gas per piastre per microtitolazione
vetri di copertura	Marienfeld		24 x 60 mm
Provetta per coltura	SPL	40014
Cuvette	ratiolab	2712120
D-(+)-Galattosio	sigma	G0625
D-(+)-Glucosio	sigma	G8270
D-(+)-Raffinosio pentaidrato	Daejung	6638-4105
Incubatore (agitazione)	Modello Labtron		: SHI1
Incubatore (statico)	Vision scientific		modello: VS-1203PV-O
LiAc	sigma	L6883
Lettore di micropiastre	Tecan	30050303 01	Modello: Pipetta multicanale Infinite 200 pro
20-200 µ L	gilson	FA10011
pipetta multicanale 2-20 & micro; L	gilson	FA10009
Microscopio Olympus	Olympus	IX-53
PEG	sigma	P4338	media mol wt 3.350
Petridish	SPL	10090
pRS426			Christianson, T. W., Sikorski, R. S., Dante, M., Shero, J. H. & Hieter, P. Vettori navetta multifunzionali per lievito ad alto numero di copie. Gene. 110 (1), 119-122 (1992).
pRS426 GAL1 promotore &alfa;-sinucleina A30P			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Le cellule di lievito forniscono informazioni sulla biologia e sulla patobiologia dell'alfa-sinucleina. Scienza. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotore &alfa;-sinucleina A53T			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Le cellule di lievito forniscono informazioni sulla biologia e sulla patobiologia dell'alfa-sinucleina. Scienza. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotore &alfa;-sinucleina E46K			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Le cellule di lievito forniscono informazioni sulla biologia e sulla patobiologia dell'alfa-sinucleina. Scienza. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
pRS426 GAL1 promotore &alfa;-sinucleina WT			Outeiro, T. F. & Lindquist, S. Le cellule di lievito forniscono informazioni sulla biologia e sulla patobiologia dell'alfa-sinucleina. Scienza. 302 (5651), 1772-1775 (2003)
Serbatoio	SPL	23050
Spettrofotometro	eppendorf	6131 05560
W303a			Presente da James Bardwell
Lievito base azotata senza aminoacidi	Difco	291940
Lievito sintetico drop-out medium integratori senza uracile	sigma	Y1501
YPD	Condalab	1547.00