Imaging della coclea invecchiata con microscopia a fluorescenza a foglio di luce

Summary

È stato sviluppato un microscopio a foglio di luce per visualizzare e digitalizzare l'intera coclea.

Abstract

La sordità è la menomazione sensoriale più comune, che colpisce circa il 5% o 430 milioni di persone in tutto il mondo secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità¹. L'invecchiamento o presbiacusia è una causa primaria di perdita dell'udito neurosensoriale ed è caratterizzata da danni alle cellule ciliate, ai neuroni gangliari spiralati (SGN) e alla stria vascolare. Queste strutture risiedono all'interno della coclea, che ha una complessa anatomia a forma di spirale di tessuti membranosi sospesi nel fluido e circondati da osso. Queste proprietà rendono tecnicamente difficile indagare e quantificare i cambiamenti istopatologici. Per rispondere a questa esigenza, abbiamo sviluppato un microscopio a foglio luminoso (TSLIM) in grado di visualizzare e digitalizzare l'intera coclea per facilitare lo studio delle relazioni struttura-funzione nell'orecchio interno. Le sezioni seriali ben allineate dell'intera coclea si traducono in una pila di immagini per il rendering tridimensionale (3D) del volume e la segmentazione delle singole strutture per la visualizzazione 3D e l'analisi quantitativa (cioè lunghezza, larghezza, superficie, volume e numero). Le coclee richiedono passaggi di elaborazione minimi (fissazione, decalcificazione, disidratazione, colorazione e pulizia ottica), tutti compatibili con la successiva imaging ad alta risoluzione mediante scansione e microscopia elettronica a trasmissione. Poiché tutti i tessuti sono presenti nelle pile, ogni struttura può essere valutata singolarmente o in relazione ad altre strutture. Inoltre, poiché l'imaging utilizza sonde fluorescenti, l'immunoistochimica e il legame del ligando possono essere utilizzati per identificare strutture specifiche e il loro volume o distribuzione 3D all'interno della coclea. Qui abbiamo usato TSLIM per esaminare le coclee di topi anziani per quantificare la perdita di cellule ciliate e neuroni gangliari a spirale. Inoltre, sono state utilizzate analisi avanzate (ad esempio, analisi dei cluster) per visualizzare le riduzioni locali dei neuroni ganglio spirale nel canale di Rosenthal lungo il suo volume 3D. Questi approcci dimostrano la capacità della microscopia TSLIM di quantificare le relazioni struttura-funzione all'interno e tra le coclee.

Introduction

La coclea è l'organo sensoriale periferico per l'udito nei mammiferi. Ha una complessa anatomia a spirale di cellule sensoriali e di supporto ripetute che sono anatomicamente specializzate per rilevare le vibrazioni sonore e trasmetterle al cervello per la percezione dell'udito. I principali elementi sensoriali sono le cellule ciliate interne ed esterne e le loro fibre nervose innervanti i cui corpi cellulari compongono il ganglio a spirale, che risiede all'interno del canale di Rosenthal (Figura 1). Queste strutture sensoriali e neurali sono disposte tonotopicamente in modo tale che i suoni ad alta frequenza siano trasdotti nella base co....

Protocol

Tutte le procedure e l'uso di animali vivi sono stati esaminati e approvati (ID protocollo # 2010-38573A) dal Comitato istituzionale di cura e uso dell'Università del Minnesota (IACUC) e gli investigatori che utilizzano questi animali sono stati accuratamente addestrati e testati dai veterinari delle risorse animali di ricerca (RAR) prima di avere accesso alle strutture per animali. In questo studio sono stati utilizzati topi maschi e femmine.

1. Rimozione della coclea per la fissazione e l'elaborazione dei tessuti per l'imaging

1. Eutanasia di un topo usando l'inalazione di CO₂ . Decapitare il topo con le....

Results

Poiché il tema di questo numero speciale è l'imaging degli effetti dell'invecchiamento nella coclea, verranno utilizzate come esempi una coclea giovane (3 mesi, HS2479, topo ceppo CBA) e di età (23 mesi, HS2521, topo ceppo C57). Va notato che TSLIM è in grado di visualizzare una varietà di campioni, tra cui coclee di esseri umani, mammiferi, altri roditori e pesci, nonché altri organi come il cervello.

Johnson et al. ¹³ hanno pubblicato un articolo sugli SGN in topi CBA.......

Discussion

Il sezionamento ottico mediante microscopia a foglio di luce per l'esame delle strutture cocleari non è meccanicamente distruttivo come altri metodi istologici più tradizionali e fornisce una visione digitale completa delle strutture cocleari l'una rispetto all'altra. Metodi precedenti come i preparati superficiali dell'organo di Corti¹⁴ hanno fornito una mappa della perdita di cellule ciliate lungo la lunghezza della membrana basilare, ma la perdita di SGN non poteva essere valutata poiché il tes.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Software di rendering 3D Amira	ThermoFisher Scientific		Indirizzo: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433
benzil benzoato (W213810)	Sigma-Aldrich, Inc.		Indirizzo: Casella postale, 14508, St. Louis, MO 68178
Bondic	Bondic		Indirizzo: 235 Industrial Parkway S., Unità 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada
Etanolo 95% e 100%	Università del Minnesota		Indirizzo: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455
Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA)  (E5134)	Sigma-Aldrich, Inc.		Indirizzo: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Programma grafico LabVIEW e Vision	National Instruments		Indirizzo: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504
salicilato di metile (M6742)	Sigma-Aldrich, Inc.		Indirizzo: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178
Microscopio di dissezione Olympus MVX10	Olympus Corp		Indirizzo: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034
Isotiocinato di rodamina B, (283924)	Sigma-Aldrich, Inc.		Indirizzo: Casella postale, 14508, St. Louis, MO 68178
Cella flurometrica Starna (3-G-20)	Celle Starna Indirizzo		: Casella postale 1919, Atascadero, CA 82423