L'avanzamento dello studio della follicologenesi preantrale richiede metodi efficienti di isolamento del follicolo dalle singole ovaie. Qui viene presentato un protocollo meccanico semplificato per l'isolamento del follicolo dalle ovaie bovine utilizzando un tritatutto tissutale e un omogeneizzatore. Questo metodo consente la raccolta di un gran numero di follicoli preantrali vitali da una singola ovaia.
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Articolo metodologico
Isolamento di piccoli follicoli preantrali dall'ovaio bovino utilizzando una combinazione di frammentazione, omogeneizzazione e filtrazione seriale
In questo articolo
Sommario
Abstract
Comprendere l'intero processo della follicologenesi dei mammiferi è fondamentale per migliorare le tecnologie di riproduzione assistita nel bestiame, negli esseri umani e nelle specie in via di estinzione. La ricerca è stata per lo più limitata ai follicoli antrali e ai grandi follicoli preantrali a causa della difficoltà nell'isolamento dei follicoli preantrali più piccoli, specialmente nei grandi mammiferi come le specie bovine. Questo lavoro presenta un approccio efficiente per recuperare un gran numero di piccoli follicoli preantrali da un singolo ovaio bovino. La corteccia delle singole ovaie bovine è stata tagliata in cubi da 500 μm utilizzando un trinciatutto di tessuto e omogeneizzata per 6 minuti a 9.000-11.000 giri / min utilizzando una sonda da 10 mm. I detriti di grandi dimensioni sono stati separati dall'omogenato usando un panno di formaggio, seguito da una filtrazione seriale attraverso filtri cellulari da 300 μm e 40 μm. Il contenuto trattenuto nel filtro da 40 μm è stato risciacquato in un piatto di ricerca, dove i follicoli sono stati identificati e raccolti in una goccia di mezzo. La vitalità dei follicoli raccolti è stata testata tramite colorazione blu tripano. Questo metodo consente l'isolamento di un gran numero di piccoli follicoli preantrali vitali da un singolo ovaio bovino in circa 90 minuti. È importante sottolineare che questo metodo è interamente meccanico ed evita l'uso di enzimi per dissociare il tessuto, che può danneggiare i follicoli. I follicoli ottenuti utilizzando questo protocollo possono essere utilizzati per applicazioni a valle come l'isolamento dell'RNA per RT-qPCR, l'immunolocalizzazione di proteine specifiche e la coltura in vitro .
Introduzione
I follicoli ovarici sono le unità funzionali dell'ovaio, responsabili della produzione del gamete (ovocita) e degli ormoni critici per la funzione riproduttiva e la salute generale. I follicoli primordiali si formano nell'ovaio durante lo sviluppo fetale o nel periodo neonatale a seconda della specie1 e costituiscono la riserva ovarica di una femmina. La crescita follicolare inizia con l'attivazione dei follicoli primordiali che lasciano il pool di riposo ed entrano nella fase di crescita. La follicologenesi preantrale, che comprende tutti gli stadi follicolari prima dello sviluppo dell'antro, è un processo altamente dinamico che richiede cambi....
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Protocollo
Le ovaie bovine (Bos taurus) sono state prelevate da un mattatoio locale e trasportate al laboratorio entro 6 ore dalla raccolta. A causa del gran numero di animali lavorati nella struttura, l'età, la razza e lo stadio del ciclo di estro degli animali sono sconosciuti. Poiché in questi esperimenti non sono stati utilizzati animali vivi, non è stato richiesto un protocollo approvato per la cura e l'uso degli animali.
1. Preparazione delle attrezzature e dei reagenti
- Coprire una sezione larga 2 piedi di un banco da laboratorio con carta da banco.
- Procurarsi un manico di bisturi, una lama sterile p....
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Risultati
Panoramica e passaggi critici
Utilizzando questo protocollo, i piccoli follicoli preantrali bovini possono essere isolati in modo affidabile dalle singole ovaie in numeri sperimentalmente rilevanti. Da un totale di 30 repliche, sono stati ottenuti in media 41 follicoli per replica, con un intervallo da 11 a 135 follicoli (Figura 4A). In 14 repliche, i follicoli sono stati caratterizzati per lo stadio di sviluppo come precedentemente descritto26 mis.......
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Discussione
Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile per recuperare i follicoli preantrali in fase iniziale, in particolare nelle fasi primarie e secondarie, dall'ovaio bovino. Questo protocollo si basa sui precedenti rapporti 20,25,30,34,35,36 e fornisce ottimizzazioni che si traducono nell'isolamento di un numero significativo di follicoli da una singola ovaia........
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo progetto è stato parzialmente finanziato dal progetto multi-stato USDA W4112 e dal premio UC Davis Jastro Shields a SM.
Gli autori vorrebbero estendere il loro apprezzamento a Central Valley Meat, Inc. per aver fornito le ovaie bovine utilizzate in tutti gli esperimenti. Gli autori ringraziano anche Olivia Silvera per l'assistenza nell'elaborazione delle ovaie e nell'isolamento del follicolo.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 5-3/4 "Soda Lime monouso in vetro Pasteur pipetta | Duran Wheaton Kimble | 63A54 | Pipetta Pasteur che può essere utilizzata per rimuovere i follicoli dai detriti durante la ricerca all'interno della capsula di Petri |
| 16% Paraformaldeide | Microscopia elettronica Scienze | 15710 | diluito al 4%; fissazione dei follicoli per l'immunocolorazione |
| 20 ml Luer-lock Siringa | Fisher Scientific | Z116882-100EA | Siringa utilizzata con l'ago da 18 G per rimuovere i follicoli dal 40 μ Filtro cellulare m |
| #21 Lama sterile per bisturi | Fisher Scientific | 50-365-023 | Utilizzato per tagliare le ovaie e rimuovere la medula |
| 40 μ m Filtro cellulare | Fisher Scientific | 22-363-547 | Utilizzato per filtrare il filtrato dal 300 μ Filtro cellulare m |
| 104 mm Imbuto in plastica | Fisher Scientific | 10-348C | Le dimensioni possono variare, ma assicurarsi che la garza sia tagliata in modo appropriato e che l'omogeneizzato ovarico non fuoriesca oltre |
| 300 μ m Filtro cellulare | pluriSelect | 43-50300-03 | Utilizzato per filtrare il filtrato dalla garza |
| 500 mL di fiaschetta Erlenmeyer Fisher | Scientific | FB500500 | Imbuto e pallone utilizzati per raccogliere il filtrato dalla tela di formaggio... |
| Aghi sterili Air-Tite 18 G | Thermo Fisher Scientific | 14-817-151 | 18 G offre una pressione sufficiente per rimuovere i follicoli dal 40 μ Filtro cellulare |
| m Aghi sterili Air-Tite 27 G 13 mm | Fisher Scientific | 14-817-171 | Aghi che possono essere utilizzati per manipolare eventuali detriti in cui sono bloccati i follicoli |
| BD Hoechst 33342 Soluzione | Fisher Scientific | BDB561908 | Colorazione fluorescente del DNA |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030-100G | Componente dei mezzi di lavaggio del follicolo |
| microscopia elettronica | tela di formaggio | 71748-00 | Prima fase di filtraggio dell'omogenato ovarico destinata a rimuovere i detriti di tessuto di grandi dimensioni |
| Lame di rasoio di sicurezza classiche a doppio taglio | Spada Wilkinson | N/A | Lame di rasoio che si adattano al meglio al tritatessuti McIlwain e non si smussano rapidamente |
| Anticorpo secondario asino-anti-coniglio, Alexa Fluor 488 | Fisher Scientific | A-21206 | Anticorpo secondario per l'immunocolorazione |
| Eisco Latex Pipette Bulbi Fisher | Scientific | S29388 | Bulbo di gomma da utilizzare con le pipette Pasteur |
| HEPES Buffer | Sigma-Aldrich | H3375 | Componente del mezzo di lavaggio dei follicoli |
| Omogeneizzatore | VWR | 10032-336 | Omogeneizzare il tessuto ovarico per rilasciare i follicoli |
| ImageJ/Fiji | NIH | v2.3.1 | Software utilizzato per l'analisi della fluorescenza-immunolocalizzazione |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella | 10184 | Utilizzato per tagliare il tessuto ovarico abbastanza piccolo per l'omogeneizzazione |
| Microscopio - Stereoscopio | Olympus | SZX2-ILLT | Microscopio da dissezione utilizzato per la ricerca e la raccolta di follicoli dal filtrato |
| Microscopio - Nikon invertito | Diaphot 300 | utilizzato per la visualizzazione in campo chiaro ad alto ingrandimento di follicoli isolati | |
| Microscopio - ECHO invertito | Revolve R4 | Microscopio invertito utilizzato per la visualizzazione in campo chiaro ed epifluorescenza ad alto ingrandimento di follicoli isolati | |
| Olio minerale | Sigma-Aldrich | M8410-1L | Olio per coprire le gocce di terreno di lavaggio dei follicoli per prevenire l'evaporazione durante la ricerca |
| Aminoacidi non essenziali (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Componente del terreno di lavaggio dei follicoli |
| Siero d'asino normale | Jackson ImmunoResearch | 017-000-001 | Reagente per tampone bloccante immunocolorazione |
| Nunc Piatti a 4 pozzetti per FIV | Thermo Fisher Scientific 144444 | Piatti a 4 pozzetti per l'isolamento e il lavaggio dei follicoli | |
| di penicillina-streptomicina 100x | Gibco | 15-140-122 | Componente del mezzo di lavaggio dei follicoli |
| Piastra di Petri 60 mm OD x 13,7 mm | Ted Pella | 10184-04 | Piastra di Petri che si adatta al meglio al McIlwain Tissue Chopper |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Fisher Scientific | BP665-1 | Tampone di lavaggio per ovaie e follicoli |
| Tagliere in plastica | Fisher Scientific | 09-002-24A | Tagliere di dimensioni sufficienti per tagliare in sicurezza ovaie |
| Polivinilpirrolidone (PVP) | Fisher Scientific | BP431-100 | L'aggiunta di PVP (0,1% p/v) al PBS impedisce ai follicoli di attaccarsi alla piastra o l'uno all'altro |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher Scientific | P36930 | Terreno di montaggio per cellule o tessuti marcati in fluorescenza |
| Qiagen RNeasy Micro Kit | Qiagen | 74004 | Kit di pulizia della colonna di RNA |
| R | The R Foundation | v4.1.2 | Software di analisi statistica |
| Rabbit-Anti-Human Cx37/GJA4 Anticorpo policlonale | Abcam | ab181701 | Cx37 anticorpo primario per immunocolorazione |
| Kit di trascrizione inversa RevertAid RT | di sintesi di cDNA | Thermo Fisher Scientific | K1691 |
| Rstudio | RStudio, PBC | v2021.09.2 | Software di analisi statistica |
| Soluzione di idrossido di sodio (1N/Certificato) | Fisher Scientific | SS266-1 | Utilizzato per aumentare il pH dei terreni a 7,6-7,8 |
| Piruvato di sodio (NaPyr) | Gibco | 11360-070 | Componente del liquido di lavaggio dei follicoli |
| Piastra di Petri quadrata 100 mm x 15 mm | Thermo Fisher Scientific | 60872-310 | Le piastre di Petri grigliate consentono un'identificazione più efficiente dei follicoli |
| SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725271 | Mastermix per reazioni PCR |
| Filtro filettato Steritop per flacone | Sigma-Aldrich | S2GPT02RE | Utilizzato per sterilizzare il terreno di lavaggio dei follicoli |
| Colorazione per gel di DNA sicura per SYBR | Thermo Fisher Scientific | S33102 | Colorazione di prodotti PCR visivi su gel di agarosio |
| TCM199 con Hank' s Sali | Gibco | 12-350-039 | Componente del terreno di lavaggio dei follicoli |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | Detergente per tampone di permeabilizzazione immunocolorante |
| Reagente Trizol | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Reagente per l'isolamento dell'RNA |
| Soluzione di tripano blu, 0,4% | Gibco | 15-250-061 | Utilizzato per testare la vitalità dei follicoli isolati |
| Tween 20 | Detergente per tampone di lavaggio immunocolorante | ||
| Piastra riscaldante Universal | WTA | 20931 | Piastra calda per mantenere i follicoli a 38,5 gradi C durante la ricerca al microscopio |
| Wiretrol II Micropipette calibrate | Drummond | 50002-005 | Micropipette in vetro per manipolare i follicoli |
Riferimenti
- Fortune, J. E., Yang, M. Y., Allen, J. J., Herrick, S. L. Triennial reproduction symposium: The ovarian follicular reserve in cattle: What regulates its formation and size. Journal of Animal Science. 91 (7), 3041-3050 (2013).
- Fair, T., Hulshof, S. C., Hyttel, P., Greve, T., Boland, M.
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Ristampe e permessi
