Un protocollo di compensazione efficace per lo studio dello sviluppo delle sementi nel pomodoro (Solanum lycopersicum L.)

Il pomodoro (S. lycopersicum L.) è una delle colture orticole più importanti in tutto il mondo, con una produzione di 186,8 milioni di tonnellate di frutti carnosi da 5,1 milioni di ettari nel 2020¹. Appartiene alla grande famiglia delle Solanacee con circa 2.716 specie², tra cui molte colture commercialmente importanti come melanzane, peperoni, patate e tabacco. Il pomodoro coltivato è una specie diploide (2n = 2x = 24) con una dimensione del genoma di circa 900 Mb³. Per molto tempo, sono stati fatti grandi sforzi verso l'addomesticamento e l'allevamento del pomodoro selezionando tratti desiderabili da Solanum spp selvatico. Ci sono oltre 5.000 accessioni di pomodoro elencate nel Tomato Genetics Resource Center e più di 80.000 germoplasma di pomodori sono conservati in tutto il mondo⁴. La pianta di pomodoro è perenne nella serra e si propaga per semi. Un seme di pomodoro maturo è costituito da tre compartimenti principali: un embrione adulto, un endosperma di tipo cellulare residuo e un rivestimento di semi duri ^5,6 (Figura 1A). Dopo la doppia fecondazione, lo sviluppo dell'endosperma di tipo cellulare precede lo sviluppo degli zigoti. A ~ 5-6 giorni dopo la fioritura (DAF), il proembrione bicellulare viene osservato per la prima volta quando l'endosperma è costituito da sei a otto nuclei⁷. In Solanum pimpinellifolium, l'embrione si avvicina alla sua dimensione finale dopo 20 DAF e i semi sono vitali per la germinazione dopo 32 DAF⁸. Man mano che l'embrione si sviluppa, l'endosperma viene gradualmente assorbito e solo una piccola quantità di endosperma rimane nel seme. L'endosperma residuo è costituito da endosperma micropilare che circonda la punta della radicola, e endosperma laterale nel resto del seme ^9,10. Il rivestimento esterno del seme è sviluppato dall'epidermide esterna ispessita e lignificata del tegumento e, con gli strati morti dei resti di tegumento, formano un guscio duro per proteggere l'embrione e l'endosperma⁵.

Figura 1: Rappresentazione schematica di un seme maturo in Solanum lycopersicum e Arabidopsis thaliana. (A) Anatomia longitudinale di un seme di pomodoro maturo. (B) Anatomia longitudinale di un seme maturo di Arabidopsis. Un seme di pomodoro maturo è circa 70 volte più grande di un seme di Arabidopsis. Barre della scala = (A) 400 μm, (B) 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La produzione di semi di pomodoro di alta qualità dipende dalla coordinazione tra l'embrione, l'endosperma e i componenti materni del seme¹¹. La dissezione di geni e reti chiave nello sviluppo dei semi richiede una registrazione fenotipica profonda e completa dei semi mutanti. Le tecniche convenzionali di embedding-sectioning, come la sezione semisottile e la sezione paraffina, sono ampiamente applicate ai semi di pomodoro per osservare le strutture locali e più fini dell'embrione^12,13,14,15. Tuttavia, l'analisi dello sviluppo del seme da sezioni sottili è solitamente laboriosa e manca di risoluzione spaziale dell'asse z. In confronto, la pulizia dei tessuti è un metodo rapido ed efficiente per individuare la fase di sviluppo dei difetti embrionali che hanno maggiori probabilità di verificarsi¹⁶. Il metodo di compensazione riduce l'opacità del tessuto interno omogeneizzando l'indice di rifrazione con uno o più agenti biochimici¹⁶. La pulizia dell'intero tessuto consente l'osservazione di una struttura di tessuto vegetale senza distruggerne l'integrità e la combinazione di tecnologia di clearing e imaging tridimensionale è diventata una soluzione ideale per ottenere informazioni sulla morfologia e sullo stato di sviluppo di un organo vegetale^17,18. Nel corso degli anni, le tecniche di disboscamento dei semi sono state utilizzate in varie specie vegetali, tra cui Arabidopsis thaliana, Hordeum vulgare e Beta vulgaris 19,20,21,22,23. Tra questi, la tecnologia di eliminazione degli ovuli a montaggio intero è stata un approccio efficiente per studiare lo sviluppo dei semi di Arabidopsis, grazie alle sue piccole dimensioni, 4-5 strati della cellula del rivestimento del seme e l'endosperma di tipo nucleare^24,25. Con il continuo aggiornamento di diverse miscele di compensazione, come l'emergere della soluzione²⁶ di Hoyer, le strutture interne dell'ovulo d'orzo sono state visualizzate con un alto grado di chiarezza, sebbene il suo endosperma costituisca la maggior parte dei semi. L'embriogenesi della barbabietola da zucchero può essere osservata mediante pulizia combinata con trattamento sottovuoto e ammorbidimento con acido cloridrico¹⁹. Tuttavia, a differenza delle specie sopra menzionate, non sono state riportate osservazioni embriologiche mediante protocolli di eliminazione nei semi di pomodoro. Ciò impedisce un'indagine dettagliata sullo sviluppo embrionale e delle sementi dei pomodori.

L'idrato di cloralio è comunemente usato come soluzione di compensazione che consente ai tessuti e alle cellule immersi di essere visualizzati su diversi piani ottici e preserva sostanzialmente le cellule o i componenti tissutali^27,28,29. Il protocollo di clearing a base di cloralio idrato è stato utilizzato con successo per la pulizia completa dei semi per osservare l'embrione e l'endosperma di Arabidopsis^21,28. Tuttavia, questa soluzione di compensazione non è efficiente nella pulizia dei semi di pomodoro, che sono più impermeabili dei semi di Arabidopsis. Le barriere fisiche includono: (1) il tegumento del pomodoro ha quasi 20 strati cellulari da 3 a 15 DAF 30,31, (2) l'endosperma del pomodoro è di tipo cellulare, non di tipo nucleare 32, e (3) i semi di pomodoro sono circa 70 volte più grandi in termini di dimensioni^33,34 e (4) producono grandi quantità di mucillagine del rivestimento del seme^, che blocca la penetrazione dei reagenti di compensazione e influenza la visualizzazione delle cellule embrionali.

Pertanto, questo rapporto presenta un metodo di pulizia ottimizzato a base di idrato di cloralio per la pulizia a montaggio intero dei semi di pomodoro in diverse fasi, che consente l'imaging profondo del processo di sviluppo dell'embrione (Figura 2).

1. Preparazione delle soluzioni

1. Preparare il fissativo FAA aggiungendo 2,5 ml di formaldeide al 37%, 2,5 ml di acido acetico glaciale e 45 ml di etanolo al 70% in una provetta da centrifuga da 50 ml. Vortex e conservarlo a 4 °C. Preparare il fissativo FAA appena prima dell'uso.
   ATTENZIONE: il 37% di formaldeide è corrosivo e potenzialmente cancerogeno se esposto o inalato. Il fissativo deve essere eseguito in una cappa aspirante indossando adeguati dispositivi di protezione individuale.
2. Preparare la soluzione di pulizia aggiungendo 5 ml di glicerolo al 100%, 40 g di idrato di cloralio e 10 ml di acqua distillata in una bottiglia di vetro da 100 ml avvolta con carta stagnola. Sciogliere utilizzando un agitatore magnetico per una notte a temperatura ambiente. La soluzione preparata può essere conservata a 4 °C per un massimo di 6 mesi.
   ATTENZIONE: L'idrato di cloralio è cancerogeno e ha un odore pungente. Eseguire l'esperimento in una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione individuale appropriati. L'idrato di cloralio è facile da deliqueselezionare nell'aria e non deve essere conservato in grandi quantità. La soluzione di compensazione può decomporsi se esposta alla luce e deve essere tenuta lontana dalla luce.
3. Preparare la soluzione disinfettante aggiungendo 10 ml di ipoclorito di sodio al 6%, 40 ml di acqua distillata e 50 μL di Tween-20 in una provetta da centrifuga da 50 ml. Vortice e conservarlo a temperatura ambiente. Preparare la soluzione disinfettante appena prima dell'uso.
   NOTA: Il contenuto effettivo di cloro dell'ipoclorito di sodio che è stato posto per lungo tempo può diminuire e il contenuto di ipoclorito di sodio al 6% può essere aumentato in base alla situazione reale.

2. Raccolta dei semi

1. Seminare semi di pomodoro (S. lycopersicum L. cv. Micro-Tom, vedi Tabella dei materiali) in vasche quadrate da 8 cm × 8 cm × 8 cm piene di una miscela 1:1 di terreno nutriente per fiori e substrato (v/v) (vedi Tabella dei materiali) e crescere in una stanza di crescita con periodi di luce/buio di 16/8 ore a 24 ± 2 °C (giorno) e 18 ± 2 °C (notte), 60% -70% di umidità relativa e un'intensità luminosa di 4.000 Lux. Circa 6 settimane dopo, le piante sono entrate nella fase di fioritura.
2. Tagga la data di fioritura dei fiori indipendenti all'antesi (l'angolo di apertura dei petali è di 90°) e registra il giorno dopo la fioritura (DAF).
3. Raccogli i frutti da 3 a 23 piante di pomodoro DAF e mettili immediatamente sul ghiaccio. Dividere i frutti (semi o embrioni) da 3 a 23 DAF in frutti precoci (3-10 DAF), medi (11-16 DAF) e tardivi (17-23 DAF) (semi o embrioni).
   NOTA: Non raccogliere troppi frutti alla volta e assicurarsi che i semi in ciascun frutto vengano spogliati entro 1 ora per ulteriori trattamenti.
4. Per i primi frutti, rompere il frutto e metterlo su un vetrino, e raccogliere i semi freschi con cura con una pinza di precisione sotto lo stereomicroscopio (vedi Tabella dei materiali) con un ingrandimento da 1x a 4x. Per i frutti medi e tardivi, rompere il frutto e raccogliere direttamente i semi freschi usando una pinza di precisione.

3. Eliminazione dei semi a base di cloralio idrato

NOTA: I protocolli convenzionali³⁵ e ottimizzati sono stati confrontati in questo studio per la loro efficienza di eliminazione dei semi.

1. Compensazione utilizzando un protocollo convenzionale
   1. Porre immediatamente i semi freschi (ottenuti nella fase 2.4) in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente 1,5 mL di fissativo FAA e incubare su uno shaker orbitale (5 rpm, vedi Tabella dei materiali) per 4 ore a temperatura ambiente.
   2. Disidratare questi semi in una serie di etanolo del 70%, 95% e 100% di etanolo (v / v) per 1 ora ciascuno su uno shaker orbitale (5 rpm).
   3. Mettere i semi in 3-5 gocce di soluzione limpida (~ 100 μL) sul vetrino e coprire delicatamente il campione con un vetrino. Sostituire la diapositiva con una singola diapositiva concava (vedere Tabella dei materiali) per i semi medi e tardivi.
   4. Conservare questi vetrini o singoli vetrini concavi a temperatura ambiente per 30 minuti (3 DAF), 2 ore (6 DAF), 1 giorno (9 DAF), 3 giorni (12 DAF) o 7 giorni (da 14 a 22 DAF) a seconda delle fasi di sviluppo del materiale di seme (più giovani sono i materiali, maggiore è la velocità di pulizia).
   5. Osservare i campioni con un microscopio a contrasto di interferenza differenziale (DIC) dotato di una fotocamera digitale (vedi Tabella dei materiali) con ingrandimento 10x, 20x e 40x. Regola e ottimizza la luminosità della luce trasmessa, il cursore DIC e l'apertura del condensatore in tempo reale per ogni campione e acquisisci immagini.
2. Cancellazione utilizzando il protocollo ottimizzato
   1. Introdurre i semi freschi (ottenuti nella fase 2.4) direttamente in una provetta da centrifuga da 2 mL contenente 1,5 mL di soluzione disinfettante (fase 1.3).
      NOTA: Il numero di semi raccolti nella provetta da centrifuga da 2 ml varia a seconda dello stadio di sviluppo dei semi. I dettagli sono elencati nella tabella 1.
   2. Incubare i campioni su uno shaker orbitale (30 rpm) a temperatura ambiente per 3-50 minuti fino a quando il contorno del rivestimento più interno del seme è chiaramente visibile. Eliminare la soluzione disinfettante.
      NOTA: Il tempo di incubazione richiesto dipende dalla fase di sviluppo del seme (più tardi sono i semi, più lungo sarà il tempo di incubazione). I dettagli sono elencati nella tabella 1.
   3. Per i semi medi e tardivi, trasferire i semi su un vetrino e rimuovere la mucillagine del seme con una pinza e un ago da dissezione sotto uno stereomicroscopio con un ingrandimento da 1x a 4x. Trasferire nuovamente i semi nel tubo della centrifuga originale usando una pinza.
      NOTA: Questo passaggio non è necessario per i semi precoci.
   4. Lavare i semi 5 volte con 1,5 ml di acqua deionizzata, 10 s ogni volta. Scartare l'acqua deionizzata.
   5. Aggiungere una soluzione di compensazione di 2 × volume dei semi, seguita da un trattamento sotto vuoto da 0 a 50 minuti (Tabella 1) con una pompa per vuoto (vedi Tabella dei materiali). Il trattamento del vuoto intermittente viene eseguito con ogni trattamento sottovuoto per 10 minuti distanziati a intervalli di 10 minuti.
   6. Sostituire con una soluzione di compensazione fresca di 2 × il volume dei semi. Tenere la provetta da centrifuga da 2 mL contenente i semi a temperatura ambiente e al riparo dalla luce per 30-7 giorni per facilitare la pulizia (Tabella 1). Durante l'incubazione, per gli embrioni tardivi, sostituire quotidianamente la soluzione di clearing con soluzione fresca e sottoporre i semi a trattamento sottovuoto per 10 minuti.
   7. Preparare i semi eliminati su vetrini o vetrini a concavo singolo e osservare con il microscopio DIC dotato di una fotocamera digitale con ingrandimento 10x, 20x e 40x. Regola e ottimizza la luminosità della luce trasmessa, il cursore DIC e l'apertura del condensatore in tempo reale per ogni campione e acquisisci immagini.

Quando i semi di pomodoro sono stati eliminati utilizzando un metodo convenzionale come in Arabidopsis, le cellule endospermatiche dense hanno bloccato la visualizzazione dei primi embrioni di pomodoro a 3 DAF e 6 DAF (Figura 3A, B). Con l'aumentare del volume totale dell'embrione, un embrione globulare era appena distinguibile a 9 DAF (Figura 3C). Tuttavia, poiché la dimensione del seme ha continuato ad aumentare, la sua permeabilità è diminuita, risultando in un embrione cardiaco sfocato a 12 DAF (Figura 3D). Dal 13 ° DAF in poi, la mucillagine e il rivestimento delle sementi sono diventati gradualmente più densi, impedendo la penetrazione degli agenti chiarificatori. Il contorno dell'embrione all'interno di 14-19 semi DAF era estremamente sfocato anche quando il tempo di trattamento è stato esteso a 7 giorni (Figura 3E-G). In 22 semi DAF, la struttura interna del seme era completamente invisibile (Figura 3H).

Pertanto, la procedura convenzionale di pulizia a base di cloralio idrato è stata ottimizzata per consentire l'eliminazione efficiente dei semi di pomodoro. I dettagli su tutti i passaggi sono elencati nella Tabella 1. In primo luogo, le fasi di fissazione FAA e disidratazione dell'etanolo, che sono spesso richieste nelle procedure di compensazione convenzionali, sono state omesse dal protocollo. Mentre la fissazione FAA è generalmente utilizzata per preservare la struttura morfologica e i componenti cellulari dal decadimento, è stato riscontrato (in questo studio) che la struttura interna dei semi di pomodoro non era facilmente deformata ed era ben conservata nonostante l'assenza di fissazione FAA e disidratazione dell'etanolo.

In secondo luogo, la mucillagine del rivestimento del seme prodotta dalle cellule epidermiche del rivestimento del seme è molto prominente dal 13 DAF in poi (Figura 4). La mucillagine dei semi ricca di polisaccaridi ha mostrato un'elevata viscosità e una permeabilità significativamente bassa35,36. Le prove iniziali per rimuoverlo senza distruggere il rivestimento del seme usando pinze sottili e aghi al microscopio da dissezione purtroppo fallirono. Questo perché il rivestimento del seme è fragile e strettamente collegato alla mucillagine. Inoltre, l'esistenza di pigmento nel rivestimento del seme porta ulteriormente al declino della qualità dell'immagine in campo chiaro37. Per ovviare a questo problema, i semi sono stati trattati con una soluzione disinfettante di ipoclorito di sodio all'1,2% e 0,1% di Tween 20. L'effetto sbiancante dell'ipoclorito di sodio consente una chiara identificazione del rivestimento interno del seme e crea un ambiente relativamente sterile che ha permesso di conservare i campioni per lungo tempo. L'uso del detergente Tween 20 potrebbe abbassare la tensione superficiale e aumentare la permeabilità ai semi. Ancora più importante, dopo questo passaggio, la maggior parte della mucillagine aderente può essere staccata dal seme senza danneggiare il rivestimento del seme (Figura 4). D'ora in poi, i semi trattati sono stati raggruppati in una provetta da centrifuga da 2 ml e sono stati incubati a temperatura ambiente in uno shaker orbitale (30 giri / min).

In terzo luogo, il trattamento sotto vuoto è stato utilizzato per accelerare la penetrazione della soluzione di compensazione agli embrioni nelle fasi intermedie e tardive. Infine, poiché i semi di pomodoro sono particolarmente più grandi dopo 12 DAF, i vetrini convenzionali sono stati sostituiti con vetrini singoli concavi durante l'imaging DIC.

Dopo il trattamento secondo il protocollo di pulizia ottimizzato, i semi di pomodoro hanno mostrato una trasparenza soddisfacente in tutte le fasi di sviluppo testate (Figura 5A-L). In contrasto con i contorni cellulari sfocati ottenuti utilizzando protocolli convenzionali, erano visibili strati cellulari distinti del rivestimento del seme a 3 DAF (Figura 5A). Le cellule endospermatiche erano più distinguibili a 5 DAF (Figura 5B). L'embrione a forma di bastoncino è apparso a 7 DAF, e poi l'embrione ha raggiunto lo stadio globulare a 9 DAF e lo stadio cardiaco a 11 DAF (Figura 5C-E). Durante queste fasi di sviluppo, i contorni delle cellule all'interno dell'embrione erano più chiaramente visibili. Rispetto al metodo convenzionale, il protocollo ottimizzato ha prodotto immagini di qualità significativamente migliore dalla fase cardiaca alla fase embrionale matura. Quando lo sviluppo embrionale raggiunse lo stadio iniziale del siluro a 13 DAF, lo stadio centrale del siluro a 14 DAF, lo stadio tardivo del siluro a 15 DAF, lo stadio di cotiledone precoce a 16 DAF, lo stadio di cotiledone piegato a 19 DAF e 21 DAF e l'embrione maturo a 23 DAF, il grado del ricciolo di cotiledoni e meristema apicale di tiro è stato catturato molto facilmente (Figura 5F-L ). Tuttavia, oltre 23 DAF, non è stato possibile visualizzare i dettagli nell'embrione, anche quando il trattamento di compensazione è stato prolungato a oltre 1 settimana.

Figura 2: Diagramma di flusso del protocollo convenzionale e del protocollo ottimizzato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Immagini di contrasto di interferenza differenziale degli ovuli di S. lycopersicum trattati con il metodo di compensazione convenzionale. (A) Un ovulo con sacco embrionale sfocato a 3 DAF. (B) Sacco embrionale con cellule endospermatiche visibili (punte di freccia) a 6 DAF. (C) Un embrione globulare appena distinguibile a 9 DAF. Un embrione sfocato a (D) 12, (E) 14, (F) 16 e (G) 19 DAF. (H) La struttura interna del seme è completamente invisibile a 22 DAF. Barre della scala = 25 μm; em = embrione; es = sacco embrionale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Disinfezione dei semi di S. lycopersicum in diversi stadi di sviluppo. Le immagini in alto (A1-F1) sono i semi striati dei frutti in via di sviluppo in (A1) 11, (B1) 12, (C1) 14, (D1) 16, (E1) 18 e (F1) 21 DAF, mentre le immagini in basso (A2-F2) sono semi trattati con soluzione disinfettante. In A2-F2, il contorno interno del rivestimento del seme può essere identificato chiaramente. Barre della scala = 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Immagini di contrasto di interferenza differenziale di embrioni di S. lycopersicum eliminati utilizzando il protocollo ottimizzato. (A-L) Immagini al microscopio DIC dell'ovulo di pomodoro con sacco embrionale visibile a (A) 3 DAF e (B) 5 DAF, (C) un embrione a forma di bastoncino a 7 DAF, (D) un embrione globulare a 9 DAF, (E) un embrione cardiaco a 11DAF, (F) un embrione di siluro precoce a 13 DAF, (G) un embrione di siluro medio 14 DAF, (H) un embrione di siluro tardivo a 15 DAF, (I) un embrione di cotiledone precoce a 16 DAF, un embrione di cotiledone piegato a (J) 19 DAF e (K) 21 DAF e (L) un embrione maturo a 23 DAF. Barre della scala = 50 μm; em = embrione; sc = rivestimento di seme; en = endosperma; es = sacco embrionale; hy = ipocotile; co = cotiledone; r = radicola; sa = sparare apicale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Ottimizzazione del protocollo per migliorare l'efficacia di eliminazione nei semi di pomodoro. 1 = Operazioni batch, osservazione di un gran numero di semi contemporaneamente; i semi sono stati posti in una provetta da centrifuga da 2 ml. 2 = disinfezione con NaClO:dH2O:Tween-20, in proporzioni di 200:800:1 (v/v); Tutti i passaggi sono stati eseguiti su uno shaker orbitale con scuotimento a 30 giri / min. 3 = Tutti i passaggi sono stati eseguiti al microscopio da dissezione con pinza e aghi da dissezione se non diversamente specificato. 4 = I semi sono stati lavati con acqua distillata dopo ogni passaggio. 5 = Compensazione con glicerolo:cloralio idrato:dH 2 O, in proporzioni di 1:8:2(v/p/v). 6 = Ogni trattamento sottovuoto è durato 10 minuti ed è stato distanziato a intervalli di 10 minuti. 7 = Sostituire con una soluzione di pulizia fresca e conservare i semi lontano dalla luce a temperatura ambiente; per i semi da 17 DAF a 23 DAF, sostituire la soluzione di pulizia con una soluzione fresca e aspirare per 10 minuti ogni giorno durante il periodo di incubazione.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.