Articolo metodologico
Riportiamo una camera ambientale flessibile per l'imaging time-lapse di cellule vive utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata verticalmente con rilevamento del segnale trasmesso. Le goccioline lipidiche sono state visualizzate in cellule SKOV3 trattate con acido oleico per un massimo di 24 ore con un intervallo di tempo di 3 minuti.
La microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS) è una tecnologia di imaging chimico label-free. L'imaging di cellule vive con SRS è stato dimostrato per molte applicazioni biologiche e biomediche. Tuttavia, l'imaging SRS time-lapse a lungo termine delle cellule vive non è stato ampiamente adottato. La microscopia SRS utilizza spesso un obiettivo ad immersione in acqua ad alta apertura numerica (NA) e un condensatore ad alta immersione in olio NA per ottenere immagini ad alta risoluzione. In questo caso, lo spazio tra l'obiettivo e il condensatore è solo di pochi millimetri. Pertanto, la maggior parte delle camere ambientali da palcoscenico commerciali non può essere utilizzata per l'imaging SRS a causa del loro grande spessore con una copertura di vetro rigido. Questo documento descrive la progettazione e la fabbricazione di una camera flessibile che può essere utilizzata per l'imaging di cellule vive time-lapse con rilevamento del segnale SRS trasmesso su un telaio del microscopio verticale. La flessibilità della camera si ottiene utilizzando un materiale morbido - un sottile film di gomma naturale. Il nuovo design dell'involucro e della camera può essere facilmente aggiunto a una configurazione di imaging SRS esistente. I test e i risultati preliminari dimostrano che il sistema a camera flessibile consente l'imaging SRS stabile, a lungo termine, time-lapse di cellule vive, che può essere utilizzato per varie applicazioni di bioimaging in futuro.
La microscopia ottica viene utilizzata per osservare le microstrutture dei campioni. L'imaging ottico è rapido, meno invasivo e meno distruttivo di altre tecnologie1. L'imaging delle cellule vive con microscopia ottica è sviluppato per catturare la dinamica delle cellule vive in coltura per un lungo periodo2. Diversi tipi di contrasti ottici forniscono informazioni distinte sui campioni biologici. Ad esempio, la microscopia ottica di fase mostra la sottile differenza negli indici di rifrazione nel campione3. La microscopia a fluorescenza è ampiamente utilizzata per visualizzare specifiche biomolec....
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1. Costruire l'involucro ambientale del microscopio
NOTA: Questo grande involucro ambientale del microscopio viene utilizzato per controllare la temperatura del corpo del microscopio e l'ambiente di imaging da stabilizzare a 37 °C (Figura 1A).
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Abbiamo fabbricato e assemblato il sistema a camera flessibile per l'imaging SRS time-lapse (Figura 1 e Figura 2), quindi valutato le prestazioni del sistema. La temperatura all'interno dell'involucro ambientale del microscopio ha raggiunto i 37 °C previsti entro 1 ora, il che non ha influenzato significativamente la temperatura ambiente (Figura 3A). La temperatura nella camera flessibile ha raggiunto i 37 °C in 1,5 ore ed è stata m.......
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La microscopia SRS a cellule vive time-lapse è una tecnica di imaging alternativa per il tracciamento delle molecole in modo label-free. Rispetto alla marcatura a fluorescenza, l'imaging SRS è privo di fotosbiancamento, consentendo il monitoraggio a lungo termine delle molecole. Tuttavia, ad oggi, il sistema di imaging di cellule vive su una microscopia SRS verticale non è disponibile in commercio. In questo lavoro, è stato sviluppato un sistema di imaging di cellule vive con una scatola stabile per microscopio isolato t.......
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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Vogliamo ringraziare il 2019 Undergraduate Senior Design Team (Suk Chul Yoon, Ian Foxton, Louis Mazza e James Walsh) presso la Binghamton University per la progettazione, la fabbricazione e il collaudo della scatola di custodia del microscopio. Ringraziamo Scott Hancock, Olga Petrova e Fabiola Moreno Olivas della Binghamton University per le utili discussioni. Questa ricerca è stata sostenuta dal National Institutes of Health con il numero di premio R15GM140444.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio SRS costruito in laboratorio <> | https://rdcu.be/cP6ve | ||
| amplificatore lock-in HF2LI 50 MHz | Instruments | HF2LI | |
| Thorlabs Inc | SM1D12 | ||
| Montatura a specchio cinematico | Thorlabs Inc | KM100 | |
| Telaio per microscopio | Nikon Inc | FN-1 | |
| Tavolino per microscopia motorizzato | Prior Scientific | Z-Deck | |
| Condensatore a immersione in olio (C-AA Achromat/Aplanat, NA 1.4) | Nikon Inc | MBL71405 | |
| Obiettivo a immersione in acqua (CFI75 Apo 25XC W 1300) | Nikon Inc | MRD77225 | |
| Materiali e parti per l'involucro del microscopio (31'' x 29'' x 28'' L x P x A) | |||
| Modulo riscaldatore Airtherm | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SAT-1W | |
| Controllore riscaldatore Airtherm, CO2 e monitor di umidità | World Precision Instruments (WPI) | AIRTHERM-SMT-1W | |
| Modulo mixer aria/CO2 | World Precision Instruments (WPI) | ECU-HOC-W | |
| Tubo flessibile per condotti (2-1/2'' ID, 2-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 56675K71 | |
| Vetro-mica ceramica ad alta temperatura, facile da lavorare (6'' x 6'', 1/4'' di spessore) | McMaster-Carr | 8489K62 | |
| Lastre di policarbonato (spessore 0,25'') | McMaster-Carr | 8574K286 | |
| Fogli di gomma siliconica (36'' x 36'', spessore 1/8'') | McMaster-Carr | 5827T43 | |
| Materiali e parti per la camera flessibile | |||
| Piastra riscaldante | McMaster-Carr | 31745K11 | |
| Filtro in linea ad alta purezza, 1/4 NPT | McMaster-Carr | 6645T18 | |
| Sega a tazza (diametro di taglio 1-7/8 | McMaster-Carr | 4066A34 | |
| Sega a tazza (diametro di taglio 50 mm) | McMaster-Carr | 4556A19 | |
| Tubo in gomma siliconica per alte temperature, morbido, diametro interno 2 mm, diametro esterno 5 mm | McMaster-Carr | 5054K313 | |
| Filtro in linea (1/4 NPT, 40 micron) | McMaster-Carr | 98385K843 | |
| Tubo tondo multiuso in alluminio 6061 (spessore della parete 1/8'', 4' ' OD) | McMaster-Carr | 9056K42 | |
| Multiuso 6061 Tubo tondo in alluminio (3/4'' spessore della parete, 3-3/4'' OD) | McMaster-Carr | 9056K47 | |
| Multiuso 6061 Barra in alluminio (12'' x 12'', spessore 1/4'') | McMaster-Carr | 8975K142 | |
| Multiuso 6061 Barra in alluminio (8'' x 8'', spessore 3/8' ') | McMaster-Carr | 9246K21 | |
| Revolver obiettivo (singolo) | Nikon Inc | FN-MN-H | |
| Portacampione (modificato) | Prior Scientific | HZ202 | |
| Film di gomma naturale ultrasottile (spessore 0,01'') | McMaster-Carr | 8611K13 | |
| Barattolo di vetro sigillabile sottovuoto | McMaster-Carr | 3231T44 | |
| Software | |||
| MATLAB | MathWorks | ||
| ImageJ (Fiji) | imagej.net | ||
| ScanImage | Vidrio Technologies, LLC | Software di imaging SRS | |
| Materiali per l'imaging di cellule vive | |||
| Cover piastre di coltura sterili con fondo in vetro (Dia.x H, 50 x 7 mm) | Microscopia elettronica (EMS) | 70674-02 | |
| Terreno di coltura cellulare DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| LysoSensor colorante fluorescente DND-189 | ThermoFisher Scientific | L7535 (Invitrogen) | |
| Acido oleico | MilliporeSigma | 364525 | |
| linea cellulare SKOV3 | ATCC | HTB-77 |
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