aLa rabbia è un'encefalite virale acuta, progressiva. L'agente eziologico a forma di proiettile appartiene al genere Lyssavirus, di cui almeno 17 causano la rabbia in tutto il mondo (tranne che in Antartide). Il virus della rabbia è il membro più importante di questi diversi virus a RNA. Tutti i mammiferi sono suscettibili, con pipistrelli e mesocarnivori che sono serbatoi significativi. La trasmissione avviene principalmente dopo un morso. Come agenti neurotropi per eccellenza, i virioni progrediscono centripetamente dopo la deposizione tramite assoni dalla periferia al sistema nervoso centrale (SNC) per la replicazione, quindi alle ghiandole salivari, e vengono escreti nella saliva. A livello globale, i cani sono responsabili del maggior numero di morti umane per rabbia, causando decine di migliaia di morti all'anno. Considerando le dimensioni zoonotiche, i metodi di laboratorio sono essenziali per la ricerca applicata e la notifica, la prevenzione e il controllo delle malattie nell'uomo, negli animali domestici e nella fauna selvatica. L'obiettivo di questa raccolta di nove articoli correlati è quello di introdurre metodi che forniscano introspezione all'insorgenza della rabbia, al rilevamento, alla patobiologia, all'epidemiologia, alla gestione e al miglioramento dei farmaci biologici.
Come viene valutata la rabbia? La rabbia dovrebbe essere una malattia soggetta a notifica, con un'adeguata raccolta, analisi e interpretazione epidemiologica dei dati. Oggi, la maggior parte dei casi viene segnalata dalla sorveglianza passiva, basata su animali che espongono le persone. Anche se potrebbe sembrare ragionevolmente semplice immaginare la cattura, la contenzione, la sedazione e l'eutanasia sicure di un sospetto clinico (ad esempio, un cane che morde per la diagnosi di rabbia), questo non è così facile per alcuni animali selvatici. Ad esempio, Taiwan era un'area considerata "indenne" dalla rabbia, originariamente basata su un'ampia sorveglianza degli animali domestici. Tuttavia, riconoscendo l'importanza di altri serbatoi di animali, gli investigatori dell'isola hanno rivolto la loro attenzione alla fauna selvatica. Come descritto da Hsu et al., la raccolta mirata di pipistrelli moribondi e morti offre l'opportunità di rilevare specie uniche di lyssavirus a Taiwan1. Tali sforzi hanno ampliato l'ampiezza tassonomica di questo genere virale e hanno fornito uno schema ragionevole per altre valutazioni in Asia.
Quali tessuti sono necessari per la diagnosi di lyssavirus? Oltre alla derivazione di metodi di sorveglianza pertinenti e alla corretta identificazione delle specie, la selezione sicura e appropriata dei tessuti è fondamentale per la diagnosi sensibile e specifica della rabbia. Fin dalXIX secolo, il sistema nervoso centrale (SNC) è stato apprezzato come tessuto primario. Gli animali sono stati soppressi, le loro carcasse sono state inviate al laboratorio, i teschi sono stati aperti, i cervelli sono stati rimossi e le parti sono state esaminate al microscopio per le inclusioni virali. Tuttavia, la spedizione di animali interi non è pratica, in particolare con mammiferi di grandi dimensioni come il bestiame. Inoltre, non tutte le aree del cervello sono ugualmente utili per la diagnosi. Jarvis et al. descrivono metodi di necroscopia sicuri e pratici sia per i piccoli che per i grandi mammiferi che minimizzano il rischio di esposizione e riducono i tempi di lavorazione2. L'applicazione di tali raccomandazioni di biosicurezza e la concentrazione sul tronco encefalico e sul cervelletto miglioreranno le pratiche per la moderna sorveglianza di laboratorio della rabbia animale.
Quali opzioni vengono utilizzate per il rilevamento dell'antigene virale? Per la diagnosi di routine del lyssavirus, dalla metà del XXsecolo è stato utilizzato un test con anticorpi fluorescenti diretti (DFA) per l'osservazione delle inclusioni virali nel tessuto del SNC. Sebbene altamente sensibile e specifico, il test DFA richiede un microscopio a fluorescenza e utilizza l'acetone come fissativo tissutale. Patrick et al. riportano l'uso di un test immunoistochimico rapido diretto (drit) che si basa sulla raccolta del tronco encefalico, la fissazione in formalina delle impronte tissutali, l'uso di anticorpi monoclonali o policlonali coniugati alla biotina e il rilevamento di inclusioni virali mediante microscopia ottica, in meno di 1 ora3. Il drit ha una sensibilità e una specificità simili a quelle del test DFA ed è adatto per una sorveglianza di laboratorio decentralizzata e avanzata in condizioni di campo. Per le impostazioni con risorse limitate, un saggio a flusso lineare (LFA) è un altro metodo per la diagnosi rapida che richiede competenze tecniche minime, come riportato da Mauti et al.. Le strisce reattive positive dal campo possono essere inviate a un laboratorio centrale per la conferma4.
Oltre al rilevamento dell'antigene, altri metodi sono adatti per la diagnosi del lyssavirus? I test DFA, drit e LFA sono utili per la rilevazione di antigeni virali nei tessuti post mortem del SNC. Tuttavia, i tessuti cerebrali possono essere decomposti. Inoltre, nei casi umani sospetti, i test ante mortem sono più desiderabili e possono includere campioni clinici alternativi come il liquido cerebrospinale. Pertanto, i saggi molecolari sono molto utili per rilevare piccole quantità di acidi nucleici virali. Marston et al. e Wang et al. descrivono una tecnica di reazione a catena della polimerasi in tempo reale e nidificata, rispettivamente, che è rapida, sensibile e specifica 5,6. Tale attenzione ai dettagli per ridurre al minimo la contaminazione del campione e un'adeguata progettazione del primer consentono una diagnosi primaria in tutto lo spettro dei lyssavirus divergenti.
Una volta diagnosticata, la microscopia convenzionale è adeguata per le moderne intuizioni sulla patobiologia del lyssavirus? L'uso di soli metodi microscopici bidimensionali può comportare la mancanza di elementi critici in vivo nel contesto e nella complessità. Tuttavia, utilizzando obiettivi a lunga distanza di lavoro libero, i tessuti infetti da virus possono essere visualizzati mediante microscopia a scansione laser confocale convenzionale ad alte risoluzioni, come dettagliato da Zaeck et al., per visualizzare la distribuzione dei patogeni e apprezzare meglio i dettagli sulla patogenesi virale, la diffusione, il tropismo e la neuroinvasione7.
Esistono alternative per misurare la potenza del vaccino antirabbico? Gli attuali metodi per misurare la potenza del vaccino antirabbico richiedono un gran numero di roditori da laboratorio. Tuttavia, i costi, gli intervalli di confidenza e i problemi di benessere richiedono un'alternativa. La glicoproteina del virus della rabbia suscita anticorpi neutralizzanti il virus dopo la vaccinazione. Come comunicato da Jallet e Tordo, un test ELISA in vitro può essere utilizzato al posto degli animali per misurare il contenuto relativo dei vaccini contro il virus della rabbia, utilizzando anticorpi monoclonali altamente specifici8.
È possibile ottenere un'inferenza sul consumo orale di esche per vaccini da parte della fauna selvatica utilizzando i biomarcatori? Oltre alla vaccinazione parenterale dell'uomo e degli animali domestici, la vaccinazione orale dei mesocarnivori selvatici è operativa dagli anni '70. Oltre a misurare l'immunogenicità del vaccino o l'efficacia risultante tra le popolazioni di volpi, procioni, puzzole, ecc. mediante il rilevamento dei casi, i biomarcatori possono essere utilizzati per dedurre il contatto e il consumo di esche cariche di vaccini. Storicamente, il rilevamento della tetraciclina incorporata dalle esche veniva effettuato nelle ossa o nei denti degli animali. Un'alternativa alla raccolta di tali tessuti duri è la misurazione sierologica di un diverso biomarcatore, come l'acido iofenossico. Berentsen et al. riportano le analisi di tali derivati nel siero delle manguste, un importante serbatoio naturale in Asia, che è stato introdotto nella regione dei Caraibi9. Dopo il consumo di esche contenenti questo biomarcatore da parte delle manguste in cattività, hanno estratto gli acidi iofenossici in acetonitrile e analizzato i sieri animali mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa. Un'adeguata marcatura è stata rilevata per diverse settimane dopo il consumo di esche e tali derivati potrebbero essere adatti per la valutazione sul campo dell'assorbimento di esche cariche di vaccini negli animali in libertà.
In parte a causa della pandemia di COVID-19 in corso, si prevede un miglioramento dei metodi virologici per migliorare la sorveglianza del lyssavirus, la scoperta di agenti patogeni, la diagnosi di conferma e la caratterizzazione delle varianti. Leggere le diverse tecniche nella letteratura peer-reviewed è in genere il primo passo per un individuo interessato. Tuttavia, l'osservazione diretta di una sequenza di passaggi e l'ascolto del contesto da parte di un operatore esperto, rimuove le sfumature e le interpretazioni errate. I protocolli di laboratorio e sul campo attuali e futuri relativi alla rabbia, come raccomandato dall'OIE e dall'OMS, potrebbero beneficiare di ulteriori raccolte di metodi visivi per assistere i nuovi ricercatori, soprattutto nei paesi in via di sviluppo.