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Articolo metodologico

Creazione di un modello di ratto silicosi attraverso l'esposizione di tutto il corpo alla silice respirabile

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DOI:

10.3791/64467

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28 ottobre 2022

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1Hebei Key Laboratory for Organ Fibrosis Research, School of Public Health, North China University of Science and Technology

In questo articolo

Sommario

Questo studio descrive una tecnica per stabilire un modello di ratto di silicosi con l'inalazione di silice attraverso tutto il corpo in una camera di inalazione. I ratti con silicosi potrebbero imitare da vicino il processo patologico della silicosi umana in modo semplice, economico e con una buona ripetibilità.

Abstract

La causa principale della silicosi è l'inalazione di silice nell'ambiente di lavoro. Nonostante alcune differenze anatomiche e fisiologiche, i modelli di roditori continuano ad essere uno strumento essenziale per lo studio della silicosi umana. Per la silicosi, il classico processo patologico deve essere inducibile attraverso l'inalazione di particelle di quarzo appena generate, il che significa indurre specificamente malattie professionali umane. Questo studio ha descritto una tecnica per stabilire e imitare efficacemente il processo di evoluzione dinamica patologica della silicosi. Inoltre, la tecnica ha avuto una buona ripetibilità senza alcun intervento chirurgico. Il sistema di esposizione per inalazione è stato fabbricato, convalidato e utilizzato per studi tossicologici sull'inalazione di particelle respirabili. I componenti critici erano i seguenti: (1) generatore di polveri SiO2 a secco sfuso regolato con un regolatore del flusso d'aria; (2) camera di esposizione per inalazione di 0,3 m3 per tutto il corpo in grado di ospitare fino a 3 ratti adulti; (3) un sistema di monitoraggio e controllo per regolare la concentrazione di ossigeno, la temperatura, l'umidità e la pressione in tempo reale; e (4) una barriera e un sistema di smaltimento dei rifiuti per proteggere i tecnici di laboratorio e l'ambiente. In sintesi, il presente protocollo riporta l'inalazione attraverso tutto il corpo e la camera di inalazione ha creato un modello silicotico di ratto affidabile, ragionevole e ripetibile con bassa mortalità, meno lesioni e più protezione.

Introduzione

La silicosi, causata dall'inalazione di silice, è la malattia professionale più grave in Cina, rappresentando oltre l'80% del numero totale di segnalazioni di malattie professionali ogni anno1. L'eziologia della silicosi è chiara e può essere prevenuta e controllata, ma non è disponibile un metodo di trattamento efficace2. Molti farmaci si sono dimostrati efficaci negli studi di base, ma hanno effetti clinici imprecisi 3,4. Pertanto, i meccanismi patologici e fisiologici della silicosi devono ancora essere esplorati.

Molti studi hanno utilizzato un'infusione una tantum di silice nella trachea di ratti o topi per studiare la patogenesi della silicosi 5,6. Sebbene questi modelli silicotici di roditori potessero essere ottenuti in breve tempo7, questi metodi presentavano ancora delle sfide, come traumi animali e un'elevata mortalità. Alcuni studi hanno coinvolto l'instillazione di silice immagazzinata nei polmoni per indurre una reazione polmonare non specifica, ma non hanno menzionato i noduli silicotici nei topi8. Inoltre, lontano dalla silicosi acuta, l'esposizione cronica alla silice negli ambienti di lavoro ha indotto un'infiammazione polmonare significativamente più bassa e ha elevato i livelli di marcatori anti-apoptotici, piuttosto che di marcatori pro-apoptotici, nei polmoni9. Pertanto, è necessario un modello animale affidabile, ragionevole e ripetibile per esplorare ulteriormente la patogenesi della silicosi.

Il presente studio descrive un metodo per imitare il processo patologico dei pazienti con silicosi attraverso l'inalazione di silice attraverso tutto il corpo, particelle erogate dall'aria in una camera di inalazione, che comprendeva un generatore di silice erogato dall'aria, una camera per tutto il corpo e un sistema di smaltimento dei rifiuti. Questo metodo è semplice, facile da usare e imita efficacemente il processo di evoluzione dinamica patologica della silicosi. Inoltre, molti possibili meccanismi e la patogenesi della silicosi sono identificati utilizzando questo metodo 10,11,12. Si prevede che il protocollo proposto aiuterà ulteriori indagini nel campo correlato della ricerca sulla silicosi.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo la Guida del National Institutes of Health degli Stati Uniti per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e approvati dal Comitato per l'etica della North China University of Science and Technology (codice protocollo LX2019033 e 2019-3-3 di approvazione). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti Wistar maschi, di 3 settimane di età. Tutti i ratti sono stati tenuti in gabbie statiche con trucioli di legno. Gli animali sono stati mantenuti in un ciclo luce/buio di 12 ore/12 ore e sono stati forniti di cibo e acqua ad libitum. Gli esperimenti di follow-up sono stati condotti dopo 1 settimana di alimentazione adattativa.

1. Preparazione dell'animale

  1. All'arrivo, alloggia tutti i ratti in una stanza specifica priva di agenti patogeni (SPF).
  2. Dividi in modo casuale i ratti sani in due gruppi (n = 10): ratti di controllo che inalano aria pura e ratti con silicosi che inalano silice.

2. Preparazione della silice

ATTENZIONE: La polvere di silice inalata dal corpo umano può danneggiare i polmoni. Pertanto, le persone devono indossare tute, guanti medici e maschere protettive (N95) durante le operazioni.

  1. Macinare le particelle di silice (vedi Tabella dei materiali) con una malta d'agata per 1,5 ore prima di ogni esposizione. Questo perché il quarzo appena fratturato produce maggiori quantità di specie di ossigeno attivo rispetto al quarzoinvecchiato 13 e la silice con un diametro di 1-5 μm è la più patogeno.
  2. Pesare la silice (30 g) utilizzando una bilancia elettronica dopo la macinazione, metterla in un contenitore di vetro e cuocerla a 180 °C per 6 ore in un essiccatore elettrico a riscaldamento (vedi Tabella dei materiali) per eliminare gli agenti patogeni dalla superficie delle particelle di silice.

3. Esposizione alla silice per i ratti

  1. Collegare l'iniezione e i sistemi di generazione disponibili in commercio (vedere la tabella dei materiali) e inserire la silice (30 g) nel generatore. Controllare se la tubazione di connessione è normale, il cavo di alimentazione è collegato e l'alimentazione è normale.
    1. Controllare manualmente il livello dell'acqua della torre di spruzzatura e dell'umidificatore del dispositivo di trattamento dei gas di scarico (vedi Tabella dei materiali) e aggiungere acqua se è insufficiente (non fino alla linea standard).
    2. Aggiungere acqua di rubinetto alla torre di spruzzatura del dispositivo di trattamento dei gas di scarico e acqua distillata all'umidificatore (Figura 1).
  2. Accendere il dispositivo di scarico dei gas di scarico (vedere la tabella dei materiali) e l'interruttore della fonte d'aria per verificare se l'interno dell'armadio di schermatura è in uno stato di pressione negativa.
    1. Verificare che la miscelazione di liquidi, polveri, valvole di controllo del flusso di gas puro e valvola di scarico delle acque reflue sotto la camera di inalazione siano chiuse.
  3. Mettere un totale di 10 ratti nella camera di inalazione (vedere la tabella dei materiali) e chiudere lo scomparto di inalazione e le porte dell'armadio schermate.
  4. Impostare i seguenti parametri sperimentali sul quadro strumenti o nel computer: pressione dell'armadio: da -50 a -30 Pa; concentrazione di ossigeno: 21%; temperatura dell'armadio: 26-30 °C; umidità: 30%-70%; velocità di ingresso della polvere: 2,0-2,5 mL/min; e concentrazione di polvere dell'armadio: 60 ± 5 mg/m3.
    NOTA: Osservare continuamente i dati sperimentali e lo stato dell'apparecchiatura durante l'esperimento. L'allarme di guasto dell'apparecchiatura ha richiesto un'elaborazione tempestiva.
    1. Esporre ogni animale alla silice continuamente per 3 ore al giorno, 5 giorni alla settimana, e consentire agli animali del gruppo di controllo di inalare aria pura.
  5. Al termine dell'esperimento, chiudere la valvola di controllo del flusso di gas miscelato e aprire la valvola di flusso del gas puro. Iniettare continuamente il gas puro nella camera di inalazione.
    NOTA: Nel presente studio, il flusso di gas puro (7,0-7,5 m3/h) è stato iniettato per almeno 20 minuti fino a quando il gas velenoso nella camera di inalazione è stato completamente sostituito.
    1. Chiudere la valvola del flusso d'aria pura, aprire la porta, far uscire i ratti e rimandarli nella stanza priva di agenti patogeni.
  6. Rimuovere la rastrelliera per topi e i componenti del tubo di derivazione in sequenza e posizionarli nel lavandino per la pulizia. Dopo il risciacquo, chiudere la valvola di pulizia automatica e aprire il portello.
    1. Pulisci la parete interna con un panno pulito o accendi il gas puro per asciugare il serbatoio. Infine, effettuare la disinfezione. Dopo la pulizia e la disinfezione con etanolo al 75%, chiudere la saracinesca di scarico e, appena possibile, aprire leggermente la porta della cabina di inalazione per far evaporare l'umidità, in modo che l'interno della cabina di inalazione rimanga asciutto.
  7. Controllare la concentrazione di silice nell'armadio con un campionatore atmosferico completo seguendo le istruzioni del produttore (vedi Tabella dei materiali) due volte alla settimana per garantire la stabilità della concentrazione di silice durante l'esperimento. Calibrare il campionatore atmosferico prima del campionamento.
    1. Per la determinazione gravimetrica è possibile utilizzare una bilancia analitica digitale a piatto singolo. La concentrazione di silice calcolata è stata di 65 mg/m3 (Figura 1 e Tabella 1).
      NOTA: Pesare la carta da filtro prima e dopo l'assorbimento della silice. La concentrazione di silice è stata calcolata utilizzando la seguente formula12:
      figure-protocol-1
      dove W2 = peso della carta da filtro dopo il campionamento, W1 = peso della carta da filtro prima del campionamento e V = volume dell'aria.

4. Acquisizione e fissazione dei tessuti polmonari

  1. Sopprimere i ratti mediante iniezione intraperitoneale di pentobarbital (100 mg/kg di peso corporeo) e lidocaina (4 mg/kg di peso corporeo). Valutare la morte per perdita del battito cardiaco14.
  2. Alla fine dell'esperimento, fissare il polmone inferiore destro, il rene, il fegato, la milza e l'osso con paraformaldeide al 4% per almeno 24 ore, incorporare in paraffina e tagliare in sezionida 5 μm 7,15.

5. Colorazione con ematossilina ed eosina (H&E)

  1. Deparaffinizzare le sezioni di paraffina nello xilolo (vedere Tabella dei materiali) due volte per 10 minuti ogni16 e reidratare in etanolo al 100%, etanolo al 95%, etanolo al 90%, etanolo all'80%, etanolo al 70% e acqua distillata per 3 minuti ciascuna.
  2. Colorare le sezioni con ematossilina (vedere la tabella dei materiali) per 5 minuti, quindi lavare le sezioni con acqua10.
  3. Mettere le sezioni in alcool cloridrico al 2% e poi in acqua distillata fino a quando il colore non cambia in blu.
  4. Colorare le sezioni con eosina per 1 minuto, disidratarle con etanolo al 95%, renderle trasparenti con xilene, sigillarle con gomma neutra e osservare al microscopio ottico12.

6. Colorazione immunoistochimica

  1. Lavare regolarmente le sezioni di paraffina con acqua.
  2. Esporre gli antigeni ad alta pressione (60 kPa) e ad alta temperatura (100 °C) per 80 s e poi bloccare con un bloccante della perossidasi endogena (3%) per 15 min per eliminare le perossidasi endogene7.
  3. Incubare i campioni con anticorpi diretti contro CD68 (diluizione 1:200 - aggiungere 4 μL di CD68 a 396 μL di diluente anticorpale; vedere Tabella dei materiali) a 4 °C per una notte.
  4. Incubare i campioni con un anticorpo secondario (polimero IgG anti-topo di capra coniugato con HRP; vedere la tabella dei materiali) a 37 °C per 30 minuti, quindi lavare i campioni con 1x PBS.
  5. Visualizzare l'immunoreattività con la 3,3-diaminobenzidina (DAB; vedere la tabella dei materiali). Dopo aver applicato DAB sul tessuto, osservare la colorazione del tessuto al microscopio ottico10.
    NOTA: Il tempo di colorazione variava da pochi secondi a pochi minuti in base al tempo di colorazione del tessuto. La procedura di colorazione è stata interrotta mettendo le sezioni in acqua. In questo studio, la colorazione marrone del tessuto ha rappresentato l'espressione positiva di CD68. Tutti gli anticorpi sono stati diluiti in 1x PBS.

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Risultati

Utilizzando il metodo proposto, sono stati esplorati alcuni potenziali meccanismi e la patogenesi della silicosi nei ratti. Lo schema della camera di inalazione è mostrato in Figura 1. La camera era costituita da un generatore di silice erogato ad aria, da una camera a corpo intero e da un sistema di smaltimento dei rifiuti, come descritto in precedenza17. Le funzioni polmonari, i livelli di fattori infiammatori nel siero e nel polmone, la deposizione di collagene e l...

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Discussione

Essendo la principale causa di silicosi, la silice svolge un ruolo decisivo nello stampaggio. Le particelle di silice inalate dai pazienti con pneumoconiosi sono particelle di silice fresca e libera prodotte dal taglio meccanico. La silice può generare specie reattive dell'ossigeno direttamente sulle superfici delle particelle appena scisse o indirettamente attraverso il suo effetto sui macrofagi25. Pertanto, la macinazione delle particelle di silice è di grande importanza. Nel protocollo proposto...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla National Natural Science Foundation of China (82003406), dalla Natural Science Foundation of Hebei Province (H2022209073) e dal Science and Technology Project del Dipartimento dell'Educazione dell'Hebei (ZD2022127).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Rilevatore d'aria (campionatore atmosferico compressivo)Qingdao Xuyu Environmental Protection Technology Co. LTD
Tavoloanatomico  Non è consigliata alcuna marca specifica.
Anticorpo di CD68Abcamab201340
DABZSGB-BIOZLI-9018
Essiccatore elettrico a soffiaggio d'ariaShanghai Yiheng Scientific Instrument Co., LTD
Bilancia elettronicaOHRUS
Macchina per l'inclusioneleica
Dispositivo di scarico dei gas di scarico  HOPE Industria e Commercio Co. Ltd.
Sistemi di generatori HOPE Industria e Commercio Co. Ltd.
Guanti (guanti da laboratorio sottili)Il secco medical
Ematossilina e eosinaBaSO Diagnostics Inc.BA4025
HOPE MED 8050 apparecchio di controllo dell'esposizioneHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Camera di inalazione HOPE Industria e Commercio Co. Ltd.
Siringa  Non è consigliata alcuna marca specifica.
Microscopio ottico olympus
Oggetto scivoloshitai
PV-6000 (HRP-coniugato capra anti-topo IgG polimero)Beijing Zhongshan Jinqiao Biotechnology Co. Ltds5631
Biossido di silicioSigma-Aldrich
AffettatriceleicaRM2255
Dispositivo di trattamento dei gas di scaricoHOPE Industry and Trade Co. Ltd.
Wet boxCooperativa di prodotti in plastica Fabbrica
XylolTianjin Yongda Chemical Reagent Co., LTD
per iniezione

Riferimenti

  1. Li, J., et al. The burden of pneumoconiosis in China: an analysis from the Global Burden of Disease Study. BMC Public Health. 22 (1), 1114(2019).
  2. The Lancet Respiratory Medicine. The world is failing on silicosis. The Lancet. Respiratory Medicine. 7 (4), 283(2019).
  3. Li, T., Yang, X., Xu, H., Liu, H. Early identification, accurate diagnosis, and treatment of silicosis. Canadian Respiratory Journal. 3769134, (2022).
  4. Adamcakova, J., Mokra, D. New insights into pathomechanisms and treatment possibilities for lung silicosis. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 4162(2021).
  5. Li, Y., et al. Thalidomide alleviates pulmonary fibrosis induced by silica in mice by inhibiting ER stress and the TLR4-NF-κB pathway. International Journal of Molecular Sciences. 23 (10), 5656(2022).
  6. Zhang, E., et al. Exosomes derived from bone marrow mesenchymal stem cells reverse epithelial-mesenchymal transition potentially via attenuating Wnt/β-catenin signaling to alleviate silica-induced pulmonary fibrosis. Toxicology Mechanisms and Methods. 31 (9), 655-666 (2021).
  7. Li, S., et al. N-Acetyl-Seryl-Asparyl-Lysyl-Proline regulates lung renin angiotensin system to inhibit epithelial-mesenchymal transition in silicotic mice. Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 408(2020).
  8. Walters, E. H., Shukla, S. D. Silicosis: Pathogenesis and utility of animal models of disease. Allergy. 76 (10), 3241-3242 (2021).
  9. Langley, R. J., Mishra, N. C., Peña-Philippides, J. C., Hutt, J. A., Sopori, M. L. Granuloma formation induced by low-dose chronic silica inhalation is associated with an anti-apoptotic response in Lewis rats. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A. 73 (10), 669-683 (2010).
  10. Jin, F., et al. Ac-SDKP Attenuates activation of lung macrophages and bone osteoclasts in rats exposed to silica by inhibition of TLR4 and RANKL signaling pathways. Journal of Inflammation Research. 14, 1647-1660 (2021).
  11. Xu, H., et al. A new anti-fibrotic target of Ac-SDKP: inhibition of myofibroblast differentiation in rat lung with silicosis. PloS One. 7 (7), e40301(2012).
  12. Li, S., et al. Ac-SDKP increases α-TAT 1 and promotes the apoptosis in lung fibroblasts and epithelial cells double-stimulated with TGF-β1 and silica. Toxicology and Applied Pharmacology. 369, 17-29 (2019).
  13. Vallyathan, V., Shi, X. L., Dalal, N. S., Irr, W. Generation of free radicals from freshly fractured silica dust. Potential role in acute silica-induced lung injury. The American Review of Respiratory Disease. 138 (5), 1213-1219 (1988).
  14. Khoo, S. Y., Lay, B. P. P., Joya, J., et al. Local anesthetic refinement of pentobarbital euthanasia reduces abdominal writhing without affecting immunohistochemical endpoints in rats. Lab Anim. 2018 (52), 152-162 (2018).
  15. Chooi, K. F., Rajendran, D. B. K., Phang, S. S. G., Toh, H. H. A. The dimethylnitrosamine induced liver fibrosis model in the rat. Journal of Visualized Experiments. 112 (112), (2016).
  16. Valentin, J., Frobert, A., Ajalbert, G., Cook, S., Giraud, M. -N. Histological quantification of chronic myocardial infarct in rats. Journal of Visualized Experiments. 118 (118), (2016).
  17. Zhang, H., et al. silicosis decreases bone mineral density in rats. Toxicology and Applied Pharmacology. 348, 117-122 (2018).
  18. Zhang, B., et al. Targeting the RAS axis alleviates silicotic fibrosis and Ang II-induced myofibroblast differentiation via inhibition of the hedgehog signaling pathway. Toxicology Letters. 313, 30-41 (2019).
  19. Li, S., et al. Silica perturbs primary cilia and causes myofibroblast differentiation during silicosis by reduction of the KIF3A-repressor GLI3 complex. Theranostics. 10 (4), 1719-1732 (2020).
  20. Gao, X., et al. Pulmonary silicosis alters microRNA expression in rat lung and miR-411-3p exerts anti-fibrotic effects by inhibiting MRTF-A/SRF signaling. Molecular therapy. Nucleic Acids. 20, 851-865 (2020).
  21. Cai, W., et al. Differential expression of lncRNAs during silicosis and the role of LOC103691771 in myofibroblast differentiation induced by TGF-β1. Biomedicine & Pharmacotherapy. 125, (2020).
  22. Cai, W., et al. Transcriptomic analysis identifies upregulation of secreted phosphoprotein 1 in silicotic rats. Experimental and Therapeutic. 21 (6), (2021).
  23. Li, Y., et al. Minute cellular nodules as early lesions in rats with silica exposure via inhalation. Veterinary Sciences. 9 (6), 251(2022).
  24. Mao, N., et al. Glycolytic reprogramming in silica-induced lung macrophages and silicosis reversed by Ac-SDKP treatment. International Journal of Molecular Sciences. 22 (18), 10063(2021).
  25. Hamilton, R. F., Thakur, S. A., Holian, A. Silica binding and toxicity in alveolar macrophages. Free Radical Biology and Medicine. 44 (7), 1246-1258 (2008).
  26. Park, R., et al. Exposure to crystalline silica, silicosis, and lung disease other than cancer in diatomaceous earth industry workers: a quantitative risk assessment. Occupational and Environmental. 59 (1), 36-43 (2002).
  27. Honnons, S., Porcher, J. M. In vivo experimental model for silicosis. Journal of Environmental Pathology, Toxicology and. 19 (4), 391-400 (2000).
  28. Lakatos, H. F., et al. Oropharyngeal aspiration of a silica suspension produces a superior model of silicosis in the mouse when compared to intratracheal instillation. Experimental Lung Research. 32 (5), 181-199 (2006).
  29. Li, B., et al. A suitable silicosis mouse model was constructed by repeated inhalation of silica dust via nose. Toxicology Letters. 353, 1-12 (2021).
  30. Hoy, R. F., Chambers, D. C. Silica-related diseases in the modern world. Allergy. 75 (11), 2805-2817 (2020).
  31. Davis, G. S. Pathogenesis of silicosis: current concepts and hypotheses. Lung. 164 (3), 139-154 (1986).
  32. Moss, O. R., James, R. A., Asgharian, B. Influence of exhaled air on inhalation exposure delivered through a directed-flow nose-only exposure system. Inhalation Toxicology. 18 (1), 45-51 (2006).

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