Microcampionamento nell'analisi mirata delle proteine basate sulla spettrometria di massa di proteine a bassa abbondanza

Sommario

Viene presentato un protocollo per la determinazione di biomarcatori a bassa abbondanza da campioni di siero essiccati esemplificati con il peptide di rilascio della progastrina biomarcatore (ProGRP). Le sfere magnetiche rivestite di anticorpi sono utilizzate per la pulizia selettiva e l'arricchimento di un peptide ProGRP proteotipico. Il peptide catturato viene successivamente analizzato mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem.

Abstract

Questo articolo presenta un protocollo con descrizioni dettagliate per un'efficiente pulizia dei campioni di proteine a bassa abbondanza da campioni essiccati. Questo viene eseguito utilizzando la proteolisi basata su perline prima della determinazione della cattura dell'affinità del peptide proteotipico e della spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida (LC-MS / MS). La procedura può essere applicata sia a campioni essiccati convenzionali utilizzando schede cartacee (ad esempio, macchie di sangue essiccato [DBS] e macchie di siero essiccato [DSS]), sia a campioni raccolti con metodi di campionamento più recenti come il microcampionamento volumetrico assorbente (VAMS). Oltre a descrivere questa procedura, la preparazione di perle di tripsina e perline rivestite di anticorpi è presentata in modo passo-passo in questo lavoro. I vantaggi della procedura presentata sono la proteolisi efficiente in termini di tempo utilizzando perline e la pulizia robusta selettiva utilizzando l'acquisizione di affinità peptidica. L'attuale procedura descrive la determinazione del biomarcatore del carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) a bassa abbondanza, peptide di rilascio della progastrina (ProGRP), nel siero essiccato (sia DSS che VAMS). Procedure dettagliate per la preparazione delle perline facilitano l'implementazione del flusso di lavoro in nuove applicazioni o altri laboratori. È dimostrato che i risultati possono dipendere dal materiale di campionamento; per il presente progetto, sono state osservate intensità di segnale più elevate per i campioni raccolti utilizzando VAMS rispetto ai DSS.

Introduzione

Il microcampionamento esiste da oltre 100 anni da quando Ivar Bang ha descritto il monitoraggio del glucosio dalle DBS nel 1913¹. Dopo che Guthrie e Susi hanno introdotto le DBS nel 1963 per la determinazione della fenilalanina nei neonati², la tecnica è diventata sempre più diffusa. I primi rapporti di DBS per il campionamento e la conservazione delle proteine sono stati fatti nei primi anni 1970^3,4, e un decennio dopo, nel 1980^, abbiamo trovato il primo rapporto di spettrometria di massa (MS) per la determinazione delle proteine da DBS⁵. Nonostante questa introduzione precoce, è stato solo dopo la fine del secolo che la determinazione della SM delle proteine da DBS e altre tecniche di microcampionamento è diventata più diffusa.

In un contesto clinico, è interessante determinare le proteine nella diagnosi e nel follow-up delle malattie, nonché per il monitoraggio del trattamento e scopi di doping. Questa determinazione mirata degli analiti proteici da parte della SM da piccole quantità di campioni essiccati è ancora impegnativa e spesso richiede un'ampia preparazione del campione prima dell'analisi.

La determinazione quantitativa mirata delle proteine da parte della SM viene comunemente eseguita applicando l'approccio bottom-up, digerendo le proteine ai peptidi prima dell'analisi. Questa procedura produce una miriade di peptidi, il che rende difficile l'analisi diretta del campione biologico digerito. Un modo per aggirare questo è applicare una fase di pulizia dell'affinità selettiva prima dell'analisi della SM prima o dopo la digestione ^6,7,8. In questo modo, la proteina di interesse (o il suo peptide proteotipico, se la fase di cattura dell'affinità viene eseguita dopo la digestione) viene isolata selettivamente dalla matrice del campione prima dell'analisi, fornendo limiti di rilevazione inferiori⁹.

Il microcampionamento con schede DBS presenta alcuni vantaggi rispetto ai campioni di sangue convenzionali, tra cui un basso volume di campione, un campionamento meno invasivo e una maggiore stabilità di conservazione. Tuttavia, la matrice del campione è diversa e può introdurre altre sfide nell'analisi (ad esempio, matrice del campione essiccata rispetto alla matrice del campione liquido e sangue capillare rispetto al siero o al plasma)^10,11. Un'altra sfida che si osserva con le DBS è il cosiddetto effetto ematocrito, in cui l'ematocrito del sangue colpisce il volume del campione ulteriormente elaborato per l'analisi e quindi introduce variabilità interindividuale nell'analisi¹². Le unità di microcampionamento più recenti, come VAMS introdotte nel 2014¹³, affrontano questo problema raccogliendo un volume fisso di sangue invece di una goccia di sangue.

Questo protocollo descrive una configurazione per l'analisi di biomarcatori a bassa abbondanza da microcampioni essiccati. Dopo l'eluizione, il campione essiccato viene digerito e, successivamente, il peptide proteotipico viene isolato mediante cattura dell'affinità peptidica. L'analita modello è il biomarcatore SCLC ProGRP. Poiché ProGRP non può essere determinato in modo affidabile dal sangue intero, il siero è stato utilizzato come matrice del campione. Vengono mostrati i risultati rappresentativi sia dei DSS che dei campioni di siero raccolti utilizzando VAMS.

Protocollo

Il siero di donatori di sangue sani è stato utilizzato per la preparazione di soluzioni standard. L'uso di siero da donatori di sangue sani è stato eseguito in stretta conformità con la legge norvegese. Il consenso informato è stato ottenuto da tutti i soggetti. I campioni di siero sono stati analizzati utilizzando metodi in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Il protocollo descritto è una versione modificata del metodo descritto nel precedente lavoro¹⁴. Una panoramica della composizione dei tamponi e delle soluzioni e di come prepararli è disponibile nella Tabella supplementare S1, mentre la Tabella dei materiali contiene materiali, attrezzature e reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione di sfere magnetiche rivestite di anticorpi

1. Calcola la quantità di anticorpi necessaria per preparare il numero desiderato di perline. Utilizzare 1 mg di anticorpi per 50 mg di sfere magnetiche.
   NOTA: Tipicamente, negli esperimenti successivi vengono utilizzati 20 μL di una sospensione di perline da 20 mg/ml per campione (vedere punto 5.1).
2. Calcolare il volume degli anticorpi necessario per preparare il numero desiderato di perline.
   NOTA: Il volume dell'anticorpo dipende dalla concentrazione di anticorpi e deve essere calcolato per ciascun anticorpo.
3. Trasferire il volume desiderato di soluzione anticorpale in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 5 ml. Ad esempio, se la soluzione anticorpale contiene 1 mg/mL di anticorpo, utilizzare 0,4 mL per preparare 1,0 mL di sospensione di sfere (20 mg di perle/mL con 1 mg di anticorpo/50 mg di perle).
   NOTA: Gli anticorpi devono essere in un tampone privo di ammine. Utilizzare provette per microcentrifuga a basso legame proteico per tutte le soluzioni contenenti proteine per evitare la perdita di analita dovuta all'adsorbimento.
4. Aggiungere una piccola barra di agitazione magnetica alla soluzione anticorpale e regolare il pH a 2,5 in caso di agitazione continua. Utilizzare un pHmetro con un microelettrodo per misurare il pH e regolare il pH aggiungendo gradualmente volumi definiti di 1,0 M HCl (iniziare aggiungendo porzioni di 10 μL di 1,0 M HCl e ridurre il volume quando il pH si avvicina a 2,5). Registrare il volume totale di 1,0 M HCl necessario per regolare il pH a 2,5.
5. Rimuovere il micro elettrodo e incubare l'anticorpo acidificato sul ghiaccio su un agitatore magnetico per 1 ora.
   NOTA: Il trattamento acido dell'anticorpo viene eseguito per promuovere il corretto orientamento degli anticorpi sul tallone. La concentrazione di HCl può essere ridotta a 0,5 M o 0,2 M HCl, a seconda della concentrazione tampone nella soluzione anticorpale.
6. Neutralizzare la soluzione anticorpale. Utilizzare un pHmetro con un microelettrodo per misurare il pH e regolare il pH a 7 aggiungendo gradualmente volumi definiti di 1,0 M NaOH (iniziare con una porzione di 10 μL e ridurre il volume quando il pH si avvicina a 7). Registrare il volume totale di 1,0 M NaOH aggiunto.
   NOTA: la concentrazione di NaOH deve essere uguale alla concentrazione di HCl utilizzata al punto 1.4. NaOH è altamente corrosivo; utilizzare dispositivi di protezione, compresi guanti e protezioni per gli occhi adeguate.
7. Calcolare il volume desiderato di perline magnetiche attivate da utilizzare.
   NOTA: In genere, si consiglia di utilizzare perline da 20 mg / ml quando si esegue l'accoppiamento su piccola scala. Dovrebbe essere usato un minimo di 5 mg di perline.
8. Mescolare accuratamente la sospensione magnetica a sfere su un miscelatore a vortice e prelevare un volume contenente la quantità desiderata di sospensione del tallone. Ad esempio, per preparare 1 mL di sospensione di perline, prelevare un volume contenente 20 mg di perline (667 μL se la concentrazione di perle è 30 mg/ml).
9. Posizionare la sospensione del tallone su un rack magnetico per 1 minuto e rimuovere il surnatante. Lavare le perle 2 volte con lo stesso volume di Tipo 1 H₂O (667 μL se si utilizza una soluzione di perline da 30 mg/ml per preparare 1 mL di perle rivestite di anticorpi da 20 mg/ml). Mescolare utilizzando un miscelatore a vortice dopo ogni aggiunta di soluzione di lavaggio e posizionare sulla griglia magnetica per 1 minuto prima di rimuovere il surnatante.
10. Aggiungere quanto segue alle sfere magnetiche: anticorpo trattato con acido, tampone borato 0,5 M (pH 9,5) (1/5 del volume totale poiché la concentrazione finale dovrebbe essere 0,1 M; questo equivale a 0,2 ml per preparare 1 ml di sospensione di perline) e tampone di accoppiamento per l'accoppiamento degli anticorpi (per preparare 1 ml di sfere magnetiche rivestite di anticorpi, il volume del tampone di accoppiamento deve essere uguale a 1 ml - volume di anticorpo trattato con acido - 0,2 ml di tampone borato). Mescolare usando un mixer a vortice.
    NOTA: Il volume dell'anticorpo trattato con acido è uguale al volume della soluzione anticorpale (0,4 mL in preparazione di 1 mL di sospensione di sfere utilizzando una soluzione anticorpale da 1 mg/ml) + il volume di 1,0 M HCl utilizzato per regolare il pH a 2,5 + il volume di 1,0 M NaOH utilizzato per regolare il pH a 7).
    NOTA: La composizione del tampone borato 0,5 M (pH 9,5) e del tampone di accoppiamento per l'accoppiamento degli anticorpi è riportata nella tabella supplementare S1.
11. Ruotare a temperatura ambiente durante la notte utilizzando un miscelatore di campioni end-over-end, preferibilmente con rotazione e vibrazione reciproche.
12. Centrifugare per 10 min a 239 × g. Posizionare il tubo sul magnete per 2 minuti e rimuovere il surnatante.
13. Lavare le perle 2 x 2 ore e una volta durante la notte ruotando nel tampone di stoccaggio per le sfere di anticorpi a temperatura ambiente utilizzando un miscelatore di campioni end-over-end. Utilizzare lo stesso volume del volume totale nel passaggio 1.10. Posizionare il tubo sul magnete per 1 minuto e rimuovere il surnatante tra un lavaggio e l'altro.
    NOTA: La composizione del buffer di stoccaggio per le sfere anticorpali è disponibile nella tabella supplementare S1.
14. Conservare nel tampone desiderato (ad esempio, lo stesso tampone del punto 1.13) utilizzando la concentrazione di sfere desiderata (tipicamente 20 mg/ml). Conservare in frigorifero.

2. Preparazione di 2 ml di perle immobilizzate di tripsina (20 mg/mL di perle)

1. Aggiungere 20 ml di 1 mM HCl a 2 ml di perline di agarosio attivate dal NHS per lavare le perle.
2. Mescolare e centrifugare a 2.655 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante.
3. Aggiungere 20 mL di tampone fosfato 0,1 M (pH 7,8). Mescolare con un miscelatore a vortice e centrifugare a 2.655 × g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante.
   NOTA: La composizione del tampone fosfato 0,1 M (pH 7,8) è riportata nella tabella supplementare S1.
4. Aggiungere 2 ml di tripsina da 20 mg/ml (sciolta in tampone di accoppiamento freddo per l'accoppiamento della tripsina).
   NOTA: La composizione del tampone di accoppiamento per l'accoppiamento della tripsina può essere trovata nella tabella supplementare S1. Conservare il tampone in frigorifero.
5. Incubare per 25 minuti a 22 °C e 1.100 giri/min utilizzando un miscelatore a temperatura controllata. Centrifugare a 2.655 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante.
6. Aggiungere 2 mL di tampone di modifica per la preparazione delle perle di tripsina e incubare per 20 minuti a 22 °C e 1.100 giri/min utilizzando un miscelatore a temperatura controllata. Centrifugare a 2.655 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante.
   NOTA: La composizione del tampone di modifica per la preparazione delle perle di tripsina si trova nella tabella supplementare S1. Conservare il tampone in frigorifero.
7. Aggiungere 10 mL di tampone bloccante per la preparazione delle perle di tripsina e incubare per 10 minuti a 22 °C e 1.100 giri/min utilizzando un miscelatore a temperatura controllata. Centrifugare a 2.655 × g per 5 min. Rimuovere il surnatante.
   NOTA: La composizione del tampone bloccante per la preparazione delle perle di tripsina si trova nella tabella supplementare S1. Conservare il tampone in frigorifero.
8. Aggiungere 2 ml di tampone di conservazione, mescolare con un mixer a vortice e conservare in frigorifero fino all'uso.
   NOTA: la composizione del buffer di stoccaggio per le sfere di tripsina è disponibile nella tabella supplementare S1. Conservare il tampone in frigorifero.

3. Campionamento DSS/VAMS e successiva estrazione del siero essiccato

1. Preparare gli standard spruzzando il siero con ProGRP (o la proteina di interesse) al livello appropriato. Mantenere il volume di picco ≤ l'1% del volume totale.
   NOTA: Qui, una soluzione madre di 295 μg/mL ProGRP in acqua è stata utilizzata per la preparazione di standard sierici a spillo.
2. Mescolare gli standard su un miscelatore a vortice.
3. Applicare 10 μL di siero (standard a spillo) su schede DBS o consentire la raccolta di 10 μL di siero mediante VAMS (10 μL) utilizzando le linee guida del produttore. Per DSS, assicurarsi che il punto sia all'interno del cerchio tratteggiato.
4. Lasciare asciugare all'aria a temperatura ambiente per almeno 2 ore.
5. Ritagliare l'intero punto e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 2 ml o rimuovere il VAMS dal supporto e metterlo in una provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 2 ml.
6. Aggiungere 1.000 μL di soluzione di bicarbonato di ammonio (ABC) da 100 mM. Estrarre il siero essiccato dallo spot/VAMS per 1 ora a 22 °C utilizzando un miscelatore a temperatura controllata a 1.000 giri/min.
7. Trasferire l'estratto in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 ml per la proteolisi triptica.

4. Digestione degli estratti di DSS/VAMS

1. Utilizzare 30 μL di perle di tripsina (come preparato nella sezione 2) per campione. Trasferire un volume contenente perle di tripsina per tutti i campioni in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 ml, centrifugare a 2.655 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante.
2. Lavare le perle di tripsina 2 volte con 1 mL di ABC freddo da 50 mM, prima di riassumere nello stesso volume che è stato pipettato. Centrifugare a 2.655 × g per 5 minuti e rimuovere il surnatante tra una fase e l'altra.
3. Aggiungere 30 μL di perle di tripsina lavate a ciascun estratto DSS / VAMS per avviare la digestione.
4. Incubare per 2 ore a 37 °C e 1.000 giri/min utilizzando un miscelatore a temperatura controllata o simile. Centrifugare a 2.655 × g per 5 minuti e trasferire il surnatante (non le perline) in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 2,0 ml.
5. Aggiungere 25 μL di soluzione standard interna (IS) da 14 ng/mL contenente il peptide marcato con isotopi stabili (SIL) ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂] in una soluzione ABC da 100 mM.

5. Cattura del peptide ProGRP proteotipico mediante sfere magnetiche rivestite di anticorpi

1. Usare 20 μL di perle rivestite di anticorpi (20 mg/ml come preparato nel paragrafo 1) per estrazione. Trasferire tutte le sfere rivestite di anticorpi in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 ml, posizionare sul magnete per 1 minuto e rimuovere il tampone di stoccaggio.
2. Lavare le sfere rivestite di anticorpi magnetici con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, contenente lo 0,05% di polisorbato 20 e 2 x 1 mL di PBS prima di risospendere nello stesso volume che è stato pipettato. Mescolare su un miscelatore a vortice e posizionare sul magnete per 1 minuto tra gli scambi tampone.
   NOTA: PBS contiene 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 e 1,8mM KH₂PO₄. Si consiglia di preparare la soluzione a una concentrazione 10x per una maggiore stabilità. Per la composizione di 100 mL di 10x PBS, vedere la Tabella supplementare S1. La diluizione del 10x PBS 10x raggiungerà un pH di ~ 7,4.
3. Aggiungere 20 μL di sospensione di sfere magnetiche lavate a ciascuna provetta di microcentrifuga a basso legame proteico contenente un estratto DSS/VAMS digerito e IS. Eseguire l'immunoestrazione per 1 ora utilizzando un miscelatore di campioni end-over-end a temperatura ambiente.
4. Lavare le sfere magnetiche utilizzando le seguenti soluzioni: 500 μL di PBS con polisorbato allo 0,05% (v/v) 20, 400 μL di PBS, 300 μL di Tris HCl da 10 mM (pH 7,4) e 300 μL di 100 mM ABC.
   1. Dopo l'aggiunta di ciascuna soluzione di lavaggio, rimuovere il tubo di microcentrifuga a basso legame proteico con perline e soluzione di lavaggio dal rack del magnete e capovolgere con attenzione fino a renderlo omogeneo. Quindi, posizionare il tubo della microcentrifuga a basso legame proteico sul magnete per 30 s, invertire per 30 s e posizionare sul magnete per 1 minuto. Rimuovere la soluzione di lavaggio.
   2. Far ruotare la sospensione rimanente usando una microcentrifuga. Posizionare sul magnete per 1 minuto e rimuovere la soluzione di lavaggio rimanente.
5. Aggiungere 15 μL di acido formico al 2% (v/v) di tipo 1 H₂O a ciascun campione e incubare per 5 minuti a 22 °C e 1.000 giri/min utilizzando un miscelatore a temperatura controllata, o simile, per eluire i peptidi catturati. Posizionare sul magnete per 1 minuto e trasferire l'eluato in una nuova provetta da microcentrifuga a basso legame proteico da 1,5 ml. Ripetere una volta e trasferire il secondo eluato nella stessa provetta di microcentrifuga a basso legame proteico del primo eluato.
6. Aggiungere 20 μL di 100 mM ABC a ciascun eluato (volume totale di 50 μL).
7. Centrifugare (microcentrifuga) e trasferire 40 μL dell'eluato in micro inserti per flaconcini di cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC).

6. Analisi mediante LC-MS/MS

1. Utilizzare un micro LC triplo quadrupolo MS con ionizzazione elettrospray per un'elevata robustezza.
2. Preparare il sistema LC-MS/MS per l'analisi spurgo le pompe con fase mobile A (20 mM FA in H 2 O e MeCN, 95:5 v/v) e B (20 mM FA in H₂O e MeCN, 5:95v/v).
3. Inserire la colonna analitica (C18, diametro interno 50 mm x 1 mm [ID], particelle 3 μm).
4. Continuare a preparare lo strumento per l'analisi seguendo le procedure di avvio per lo strumento specifico.
5. Nel software dello strumento, impostare la temperatura del forno a colonna a 25 °C e la portata a 50 μL/min (100% fase A mobile).
6. Equilibrare la colonna con la fase mobile A per almeno 15 minuti.
7. Inserire i campioni nell'autocampionatore.
8. Preparare il metodo dello strumento per l'analisi del peptide triptico specifico per ProGRP ALGNQQPSWDSEDSSNFK e del suo IS.
   NOTA: Diversi parametri del metodo sono specifici dello strumento e devono essere ottimizzati sullo strumento specifico utilizzato. I dettagli dei parametri del metodo utilizzati qui sono descritti nei passaggi da 6.9 a 6.11.
9. Per il programma gradiente in LC, utilizzare le seguenti impostazioni: portata: 50 μL/min; da tempo 0,0 a 3,0 min: 100% mobile fase A; dal tempo di 3,0 a 18,0 min: eseguire un gradiente lineare da 0% a 50% fase mobile B; dal tempo 18.0 a 18.1 min: aumentare la fase mobile B dal 50% al 100%; dal tempo 18.1 al 20.0 min: 100% mobile fase B; dal tempo 20.0 al 20.1 min: diminuire la fase mobile B dal 100% allo 0%; da 20,1 a 30 min: 100% mobile fase A per riequilibrare la colonna (utilizzare almeno 10 volumi di colonna).
10. Per le impostazioni MS/MS, eseguire MS/MS in modalità positiva utilizzando le impostazioni dello strumento che garantiscono una ionizzazione efficiente. Per seguire questo protocollo, utilizzare una tensione di spruzzo di +4.000 V, una temperatura capillare riscaldata di 270 °C, azoto come gas di lamiera (5 unità arbitrarie) e argon (2 mTorr) per la frammentazione della dissociazione indotta da collisione (CID). Se lo strumento lo consente, dirigere il flusso LC per sprecare i primi 2 minuti (0-2 min) e l'ultimo 1 min (29-30 min) della corsa, anziché nel MS.
11. Utilizzare transizioni di monitoraggio delle reazioni selezionate (SRM) per (A) il peptide della firma (ALGNQQPSWDSEDSSNFK): 1.005,45→913,3, 1.005,45→1.028,3 e 1.005,45→1.398,5 e (B) il peptide IS SIL (ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_¹³C₆_¹⁵N₂]): 1.009,45→921,3, 1.009,45→1.036,3 e 1.009,45→1.406,5. Utilizzare l'energia di collisione ottimizzata (35 V in questo protocollo) per tutte le transizioni monitorate.
12. Preparare una sequenza contenente i campioni da eseguire utilizzando il software disponibile per il sistema LC-MS/MS. Impostare il volume di iniezione su 10 μL.
    NOTA: assicurarsi di aggiungere campioni vuoti e campioni di controllo qualità in base alle esigenze.
13. Premere "Esegui sequenza" nel software dello strumento per avviare la sequenza.
14. Monitorare l'area di picco del peptide triptico ALGNQQPSWDSEDSSNFK catturato per affinità, specifico per ProGRP, e del suo peptide IS SIL.
    NOTA: La selezione e la conferma del peptide di firma, ALGNQQPSWDSEDSSNFK, sono descritte altrove¹⁴.

Risultati

Una panoramica del flusso di lavoro analitico utilizzando sia il campionamento DSS che VAMS è mostrata nella Figura 1. Ad eccezione delle differenze nel metodo di campionamento, le procedure sono identiche. Le immagini del siero campionato utilizzando i due metodi di campionamento possono essere viste nella Figura 2.

Entrambe le forme di campionamento (VAMS e DSS) sono adatte per il campionamento di siero contenente ProGRP. Questo può essere visto dalla Figura 3 dove sono mostrati i cromatogrammi MS del peptide proteotipico e del peptide IS SIL dal campionamento DSS e VAMS. Inoltre, è incluso il cromatogramma MS dopo l'analisi di un campione di controllo costituito da 10 μL di campione di siero liquido a spillo trattato nello stesso modo dei campioni essiccati. Quest'ultimo è stato diluito nello stesso volume del volume della soluzione di estrazione DSS/VAMS, sottoposto a digestione utilizzando perline di tripsina e ripulito mediante cattura di affinità peptidica.

Confrontando il campionamento VAMS e DSS (Figura 4), VAMS fornisce un rapporto di area peptide/IS proteotipico più elevato rispetto al DSS. Ciò indica che potrebbe esserci una perdita della proteina bersaglio ProGRP nella carta utilizzata per DSS (cellulosa pura). Quando si confronta con un campione di controllo, in cui il siero non viene essiccato prima di ulteriori lavorazioni e analisi (Figura 4), si mostra che VAMS fornisce rapporti di area simili a quelli del campione di controllo (test t a due code, p≤ 0,65), indicando che non vi è alcuna perdita per il materiale di campionamento, mentre DSS fornisce un rapporto di area significativamente inferiore (test t a due code, p≤ 0,005), indicando la perdita del materiale di campionamento.

Una breve valutazione è stata eseguita utilizzando VAMS. La linearità è stata mostrata da 10 a 1.000 ng/mL (R² = 0,9996), con un limite di rilevazione (LOD, S/N = 3) di 6,7 ng/mL. Il LOD è considerato soddisfacente in quanto l'analisi è stata eseguita su un triplo quadrupolo piuttosto vecchio (2008) con una colonna ID di 1 mm. Anche la ripetibilità di tutti i livelli con un S/N > 10 è stata considerata soddisfacente con un RSD compreso tra il 7% e il 17% (n = 3), utilizzando la correzione IS.

La cattura di affinità può essere eseguita sia prima che dopo la fase di digestione catturando la proteina di interesse o il suo peptide proteotipico. La procedura attuale descrive la cattura dell'affinità peptidica. Un vantaggio di questo approccio rispetto alla cattura proteica è che viene catturato solo il peptide di interesse e si ottiene una pulizia del campione ancora più efficiente. Questo è illustrato nella Figura 5, che mostra un cromatogramma a scansione completa più complesso con più rumore dopo la cattura delle proteine rispetto alla cattura del peptide. I campioni analizzati in Figura 5 non vengono campionati utilizzando il campionamento DSS o VAMS; Tuttavia, il siero è anche la matrice del campione e la cattura dell'affinità viene eseguita utilizzando lo stesso anticorpo utilizzato per la cattura del peptide nella procedura descritta.

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro analitico utilizzando sia il campionamento DSS che VAMS. Abbreviazioni: DSS = macchia di siero essiccato; VAMS = microcampionamento volumetrico ad assorbimento; LC-MS/MS = cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Immagini di siero campionate con metodi diversi . (A) Scheda di cellulosa DBS e (B) VAMS. Abbreviazioni: DBS = macchia di sangue essiccato; VAMS = microcampionamento volumetrico ad assorbimento. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Cromatogrammi MS rappresentativi del peptide proteotipico e del peptide IS SIL dopo campionamento DSS e VAMS, nonché per un campione di siero a spillo aggiunto direttamente nella soluzione di estrazione. I cromatogrammi MS mostrano 10 μL di campioni di siero arricchiti con 1,5 μg/ml di ProGRP e applicati a (A) VAMS, (B) alla scheda di campionamento della cellulosa (per DSS) o (C) direttamente al tampone di estrazione (campione di controllo). Venticinque microlitri di peptide 14 ng / mL IS SIL aggiunto a tutti i campioni prima della cattura dell'affinità peptidica. Abbreviazioni: DSS = macchia di siero essiccato; VAMS = microcampionamento volumetrico ad assorbimento; MS = spettrometria di massa; ProGRP = peptide che rilascia progastrina; IS = standard interno; SIL = marcato con isotopi stabili. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Risultati rappresentativi del rapporto di area ALGNQQPSWDSEDSSNFK/IS per campioni di siero con ProGRP e applicati (10 μL) a VAMS, DSS o direttamente alla soluzione di estrazione (campione di controllo). La concentrazione di ProGRP è di 1,5 μg/ml, n = 4 per ciascuna condizione; 25 μL di peptide 14 ng/mL IS SIL vengono aggiunti a tutti i campioni prima della cattura dell'affinità peptidica. *indica che il rapporto di area è significativamente diverso dai campioni applicati al VAMS (test t a due code, p≤ 0,005). Le barre di errore sono ± deviazione standard. Abbreviazioni: DSS = macchia di siero essiccato; VAMS = microcampionamento volumetrico ad assorbimento; ProGRP = peptide che rilascia progastrina; IS = standard interno; SIL = marcato con isotopi stabili. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Confronto tra cromatogrammi di picco di base (analisi Orbitrap a scansione completa) dopo estrazione di proteine intatte (blu) ed estrazione di peptidi epitopici proteotipici (rosso). I cromatogrammi ionici estratti del peptide epitopo proteotipico (ALGNQQPSWDSEDSSNFK, m/z 1005.45) sono mostrati sulla destra. Come campione è stato utilizzato il siero picchiato con 150 ng ^mL-1 ProGRP. Questa figura è ristampata da Levernæs et ^al.14. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella supplementare S1: Panoramica della composizione dei tamponi e delle soluzioni e di come prepararli. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Il protocollo descritto contiene informazioni su come condurre diversi passaggi importanti nell'analisi di biomarcatori a bassa abbondanza da microcampioni essiccati (DSS e VAMS), compresa la preparazione di perle di tripsina e perle magnetiche rivestite di anticorpi. Sulla base dell'esperienza precedente, trattiamo sempre l'anticorpo con acido prima dell'immobilizzazione delle sfere per migliorare l'orientamento degli anticorpi¹⁵.

Uno dei passaggi critici di questa procedura è la selezione del formato di microcampionamento più adatto. In primo luogo, si deve considerare se l'analita in questione può essere determinato dal sangue intero, o se la concentrazione è influenzata dalle cellule del sangue e deve essere determinata nel siero o nel plasma (come per l'analita modello, ProGRP).

Entrambi gli approcci basati su carta e polimeri presentano vantaggi e limiti; per ProGRP, VAMS offre un chiaro vantaggio rispetto al recupero dell'analita dopo l'estrazione dal campionatore. Tuttavia, questo può probabilmente essere ottimizzato utilizzando una soluzione di estrazione diversa per i campioni DSS. Tuttavia, questa potenziale interazione tra l'analita e il materiale di campionamento è importante da prendere in considerazione in quanto potrebbe comportare una maggiore variazione analitica e limiti di rivelazione più elevati. Poiché l'IS utilizzato è un peptide SIL e aggiunto per la prima volta dopo la digestione, IS corregge le fasi successive alla digestione (ad esempio, estrazione di affinità e analisi LC-MS / MS). La correzione IS non è possibile per l'estrazione da DSS/VAMS e la fase di digestione.

Nella procedura vengono utilizzati due tipi di perle: perle di tripsina per la digestione dopo l'estrazione del campione di siero dal campionatore e perle magnetiche rivestite di anticorpi per la cattura del peptide proteotipico dopo la digestione. Uno dei motivi principali per l'utilizzo di perle di tripsina, oltre ad accelerare la digestione, è quello di ridurre al minimo l'attività residua della tripsina nel campione durante la cattura dell'affinità. Questo è importante per evitare la proteolisi triptica del mAb durante la cattura di affinità.

Le perle di agarosio sono state utilizzate per la preparazione delle perle di tripsina, mentre le perle magnetiche sono state utilizzate per la preparazione delle perle rivestite di anticorpi. Le perle di agarosio sono meno costose delle perle magnetiche, ma hanno una limitazione che la separazione delle perle dalla soluzione richiede la centrifugazione. Ciò rende la separazione di perline e surnatante meno efficiente rispetto a quando si utilizzano perline magnetiche. Inoltre, l'automazione del flusso di lavoro è difficile utilizzando perline di agarosio. Tuttavia, sono disponibili perline magnetiche attivate dal NHS che possono essere utilizzate per un flusso di lavoro di preparazione dei campioni più snello e automatizzabile.

Il microcampionamento è una tendenza importante nella bioanalisi sia dei farmaci che dei biomarcatori. Una sfida con l'approccio attuale è la quantità limitata di volume del campione (10 μL), che può essere di particolare importanza nella determinazione di analiti di abbondanza molto bassa come ProGRP (pg / mL-basso ng / mL livello). Tuttavia, questa sfida può essere aggirata utilizzando apparecchiature analitiche all'avanguardia. Per questi analiti a bassa abbondanza, la scelta della preparazione del campione è fondamentale e la pulizia selettiva del campione attraverso la cattura di affinità basata sugli anticorpi è spesso necessaria. Poiché è stato dimostrato che la cattura peptidica fornisce estratti più puliti e limiti di rilevazione inferiori rispetto alla cattura proteica (utilizzando lo stesso anticorpo)¹⁴, il presente metodo si concentra su questo approccio in combinazione con il microcampionamento. Un altro vantaggio dell'approccio di cattura del peptide è che il peptide IS SIL corregge anche la fase di cattura dell'affinità.

In questo lavoro, un anticorpo mirato a una proteina è stato utilizzato per la cattura del peptide. Questo è un vantaggio in quanto la disponibilità di anticorpi pronti all'uso che prendono di mira le proteine è superiore rispetto agli anticorpi pronti all'uso che prendono di mira i peptidi proteotipici. Tuttavia, affinché un anticorpo antiproteico catturi in modo efficiente un peptide proteotipico, l'epitopo deve essere intatto dopo la digestione delle proteine. Inoltre, per molti anticorpi, l'epitopo esatto non è noto, rendendo noiosa la ricerca di un anticorpo anti-proteina. Ciò limita il numero di anticorpi anti-proteine disponibili applicabili per la cattura peptidica. La procedura descritta è dimostrata utilizzando il siero come matrice e ProGRP come analita bersaglio. La procedura è destinata ad essere applicabile ad altre matrici e ad altri analiti target. Invece di utilizzare un anticorpo anti-proteina disponibile in commercio per la cattura di affinità del peptide proteotipico, è possibile utilizzare anche anticorpi anti-peptidici personalizzati. L'efficienza di pulizia della cattura peptidica rispetto alla cattura proteica è illustrata nella Figura 5. Sostituendo le perle di agarosio utilizzate per la preparazione delle perle di tripsina con perle magnetiche, la procedura dovrebbe anche essere compatibile con le stazioni di lavoro robotizzate per la preparazione dei campioni sul mercato.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Acido acetico N-idrossisuccinimide estere	Carbosynt (Staad, Svizzera)	FA33719	Conservare in congelatore a temperatura inferiore a -20 gradi C
ALGNQQPSWDSEDSSNF[K_13C6 _15N2] (≥ 95%)	Innovagen (Lund, Svezia)	Non applicabile	Conservare in congelatore a temperatura inferiore a -20 ° C
Bicarbonato di ammonio BioUltra (≥ 99,5% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	09830-500G
Colonna Aquasil C18, 3 &; m, 50 mm x 1 mm	Thermo scientific (Waltham, MA, USA)	77503-051030	Colonna analitica compatibile con la benzamidina in fase mobile acquosa al 100%
(≥ 95,0%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	12072	Conservare in frigorifero a 2-6 gradi; C
Cloruro di calsio diidrato  (≥ 99% )	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	223506-500G
Centrifuga 5804	Eppendorf (Amburgo, Tyskland)	5804000010
Ospedale al radio con isoforma 1 ProGRP clonato	, Ospedale universitario di Oslo (Oslo, Norvegia)	Non applicabile	Conservare in congelatore a una temperatura inferiore a -20 ° C
Idrogenofosfato disodico diidrato (analisi professionale)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	30435-500G
Idrogenofosfato disodico dodecaidrato (analisi professionale)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06579.0500
Dynabeads M-280 tosilattivato 10 mL	Invitrogen (Carlsbad, USA)	14204	Conservare in frigorifero a 2-6 gradi; C
DynaMag-2	Invitrogen (Carlsbad, USA)	123-21D
Etanolammina (analisi professionale, ≥ 99%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	#02400
Acido formico (≥ 99% ) per LC-MS	VWR International (Radnor, PA, USA)	84865.260
FTA DMPK-C carta di cellulosa	Whatman (Kent, Regno Unito)	WB129243	DBS
Fiale per HPLC, vetro trasparente, 1,5 mL, 32 x 11,6 mm, Clean Pack	Nerliens Meszansky (Oslo, Norge)	LPP 11 09 0519
Miscelatore per campioni Hulamixer	Invitrogen (Carlsbad, USA)	101561503016	Miscelatore per campioni con miscelazione end-over-end e rotazione e vibrazione reciproche
Siero umano da donatori di sangue sani	Banca del sangue, Ullevå l, Oslo University Hospital (Oslo, Norvegia)	Non applicabile	Conservare in congelatore a temperatura inferiore a -20 ° C
Acido cloridrico fumante 37% (Assicurare per l'analisi)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.00317.1000
Sistema LC-MS/MS: Sistema Ultimate 3000 (Autocampionatore, WPS-3000TRS; Micropompa, GPL-3400M; Flow manager, FLM-3300, MIC, 1X2P-10P) e accesso TSQ Quantum. Controllato da Xcalibur 2.2 SP1.48	Thermo scientific (Waltham, MA, USA)	Non applicabile
LiChrosolv Acetonitrile hypergrade per LC-MS	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.00029.2500
LL Biotrode, elettrodo combinato in vetro	Metrohm (Herisau, Sveits)	6.0224.100
Agitatore magnetico, tipo M10	Franz Morat KG (Eisenbach, Germania)	10236
Micro inserti, vetro (31 x 6 mm, 0,1 mL)	VWR International (Radnor, PA, USA)	548-0006
MilliQ integral 3 con Q-POD	Merck Millipore (Molsheim, Francia)	ZRXQ003T0	Per la produzione di
anticorpi monoclonali acquosi di tipo 1 M18	Radium hospital, Oslo University Hospital (Oslo, Norvegia)	Non applicabile	Conservare in frigorifero a 2-6 gradi; C
Microcampionatore Neoteryx Mitra (10 μ L) 4 campionatori Clamshell	Fisher Scientific (Waltham, MA, USA)	NC1382947
perle di sefarosio attivate dal NHS 4	Sigma Aldrich a flusso rapido (St. Louis, MO, USA)	GE17-0906-01	Perle di agarosio, conservare in frigorifero a 2-6 gradi; C
Optifit, Ricarica puntali per pipette, 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	613-2911
Optifit, Ricarica puntali per pipette, 10 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	790012
Optifit, Ricarica puntali per pipette, 1.000 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	791002
Optifit, Ricarica puntali per pipette, 200 μ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	790202
Elettrodo pH in vetro	Metrohm (Herisau, Sveits)	6.0233.100
Misuratore di pH 744	Metrohm (Herisau, Sveits)	8.744.1003
Pipetta 10 mL	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725090
Pipetta m10 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725020
Pipet m100 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725050
Pipet m1.000 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725070
Pipet m20 µ L	Sartorius Biohit (Helsinki, Finlandia)	725030
Cloruro di potassio (KCl ≥ 99.9%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	P-3911
Diidrogenofosfato di potassio (analisi professionale)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.04873.0250
Proteina LoBind Eppendorf provetta 0.5 mL	Eppendorf (Hamburg, Tyskland)	525-0133 (0030 108.094)
Protein LoBind Eppendorf provetta 1,5 mL	Eppendorf (Amburgo, Tyskland)	525-0132 (0030 108.116)
Protein LoBind Eppendorf provetta 2,0 mL	Eppendorf (Amburgo, Tyskland)	525-0134 (0030 108.450)
Protein LoBind Eppendorf provetta 5,0 mL	Eppendorf (Amburgo, Tyskland)	525-0792 (0030108.302)
Forbici	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	Z186716-1EA
Sodio azide (BioUltra; ≥ 99,5%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	71289-5G
Cloruro di sodio (per analisi)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06404.1000
Sodio diidrogenofosfato monoidrato (analisi professionale)	Merck (Darmstadt, Tyskland)	1.06346.0500
Sodio idrossido (AnalaR NORMAPUR)	VWR International (Radnor, PA, USA)	28244.295
Tetraborato di sodio decaidrato (≥ 99. %)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	S9640-500G
Spectrafuge Mini centrifuga	LABNET International (Edison, NJ, USA)	C1301
Magnete di agitazione, 25 mm x 6 mm Ø, circolare	Leybold (Colonia, Germania)	666  851
Stuart Miscelatore a vortice Scientific SA8	Stuart (Staffordshire, Regno Unito)	Z648531-1EA
Provette per centrifuga SuperClear (15 mL)	VWR International (Radnor, PA, USA)	525-0150
Provette per centrifuga SuperClear (50 mL)	VWR International (Radnor, PA, USA)	525-0155
Thermomixer comfort 1,5 mL	Eppendorf (Amburgo, Tyskland)	53,55,27,831	Miscelatore a temperatura controllata
Base Trizma (grado del reagente, ≥ 99,0 %)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	T6066	Tris(idrossimetil)aminometan (tris)
Trizma HCl (grado di reagente, ≥ 99,0%)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	T3253-100G	Tris(idrossimetil)aminometan HCl (tris HCl)
Tripsina (TCPK-trattato da pancreas bovino, 10.000-15.000 unità BAEE/mg di proteine)	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	T8802	Conservare in congelatore a una temperatura inferiore a -20 ° C
Tween 20	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	P7949-500ML	polisorbato 20
pinzette	Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA)	TEM-78511-27
Tappi per fiale, bianco, 9 mm	Nerliens Meszansky (Oslo, Norge)	LPP 09 15 0981
Microcampionatore Mitra con tecnologia VAMS (Volumetric adsorptive microsampling), 10 &; L, Neoteryx a conchiglia a 4 campionatori	(Torrance, CA, USA)