Articolo metodologico

Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine

DOI:

10.3791/64488

⸱

19 maggio 2023

 ,  ,  ,  , 
1Hematopoietic Stem Cell Biology and Medical Innovation (HSCBMI), Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un protocollo passo-passo per l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.

Abstract

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La capacità di auto-rinnovamento e il potenziale di differenziazione multi-lineage sono generalmente considerati come le caratteristiche distintive delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Tuttavia, numerosi studi hanno suggerito che esiste eterogeneità funzionale nel compartimento HSC. Recenti analisi a singola cellula hanno riportato cloni HSC con diversi destini cellulari all'interno del compartimento HSC, che sono indicati come cloni HSC distorti. I meccanismi alla base di risultati eterogenei o scarsamente riproducibili sono poco compresi, soprattutto per quanto riguarda la durata dell'auto-rinnovamento quando le frazioni HSC purificate vengono trapiantate mediante immunocolorazione convenzionale. Pertanto, stabilire un metodo di isolamento riproducibile per le HSC a lungo termine (LT-HSC) e le HSC a breve termine (ST-HSC), definite dalla durata del loro auto-rinnovamento, è fondamentale per superare questo problema. Utilizzando uno screening imparziale multi-step, abbiamo identificato un fattore di trascrizione, Hoxb5, che potrebbe essere un marker esclusivo di LT-HSC nel sistema ematopoietico del topo. Sulla base di questa scoperta, abbiamo stabilito una linea di topi reporter Hoxb5 e isolato con successo LT-HSC e ST-HSC. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di LT-HSC e ST-HSC utilizzando il sistema di reporter Hoxb5 . Questo metodo di isolamento aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi di auto-rinnovamento e le basi biologiche di tale eterogeneità nel compartimento HSC.

Introduzione

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Le cellule staminali ematopoietiche (HSC), che possiedono capacità di auto-rinnovamento e multipotenza, risiedono all'apice della gerarchia ematopoietica 1,2. Nel 1988, Weissman e colleghi hanno dimostrato per la prima volta che l'isolamento delle HSC di topo potrebbe essere ottenuto utilizzando la citometria a flusso3. Successivamente, una frazione definita da una combinazione di marcatori di superficie cellulare, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, è stata riportata per contenere tutte le HSC nei topi

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.

1. Precondizionamento dei topi riceventi

  1. Preparare topi congeniti maschi C57BL / 6 di età compresa tra 8 e 10 settimane come topi riceventi. Il numero di topi riceventi dipende dal protocollo sperimentale. In genere prepariamo 10-20 topi per ogni condizione.
    1. Nutrire i topi con acqua sterilizzata integrata con enrofloxacina (170 mg / L). Poiché i topi riceventi irradiati sono altamente suscettibili alle infezioni, mantenere le gabbie il più pulite possibile.
      NOTA: L'integrazione con antibi....

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Risultati

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In precedenza, la capacità di auto-rinnovamento è stata misurata utilizzando saggi di trapianto competitivi, in cui si ritiene che le HSC del donatore mantengano la loro capacità di auto-rinnovamento solo se si osservano cellule donatrici multi-laudio nel sangue periferico ricevente17. Inoltre, diversi rapporti definiscono le LT-HSC come cellule che continuano a produrre cellule del sangue periferico diversi mesi dopo il secondo trapianto di midollo osseo10,18

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Discussione

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Tradizionalmente, le HSC definite dai marcatori di superficie cellulare sono state preparate per studiare le funzioni delle HSC, come la capacità di auto-rinnovamento e la multi-potenza 19,20,21. Tuttavia, la frazione HSC immunofenotipicamente definita (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contiene due popolazioni HSC discrete: LT-HSCs e ST-HSCs

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse associati a questo studio.

Ringraziamenti

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Riconosciamo con gratitudine Hiroshi Kiyonari per la cura degli animali e per aver fornito topi riceventi a RIKEN BDR, così come Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi per la gestione del laboratorio presso l'Università di Kobe. Gli autori apprezzano molto anche il continuo supporto per questo lavoro. Masanori Miyanishi è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, dalla Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, dalla Life Science Foundation of Japan, dalla Takeda Science Foundation, dalla Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders e da AMED-PRIM....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Striscia da 0,2 mL da 8 provette, tappo a cupolaSSIbio3230-00
0,5M EDTA pH 8,0IinvtrogenAM9260G
100 &; m Cell StrainerFalcon352360
Siringa da insulina 30GBD326668
40 & micro; m Cell StrainerFalcon352340
Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL, con filtro cellulare Tappo a scattoFALCON352235
Soluzione colorante di vitalità a 7 AADBioLegend420404
96 pozzetti U-BottomFALCON351177
Anti-APC-MicroBeadsMilteny biotec130-090-855
Aspiratore con trappola palloneBiosanFTA-1
B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2)BioLegend103232
B220-Biotina (RA3-6B2)BioLegend103204
B220-BV786 (RA3-6B2)BD Biosciences563894
B6. Topi congenici CD45.1Sankyo Labo ServiceN/A
Baytril 10%BAYER341106546
BD FACS Aria II sistema di ordini speciali BDN/A
Tampone colorante brillanteBD566349
CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70)BioLegend101222
CD11b-Biotina (M1/70)BioLegend101204
CD11b-BUV395 (M1/70)BD Biosciences563553
CD11b-BV711 (M1/70)BD Biosciences563168
CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34)Invitrogen56-1271-82
CD150-BV421 (TC15-12F12.2)BioLegend115943
CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93)Invitrogen56-0161-82
CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34)BD Biosciences560230
CD34-FITC (RAM34)Invitrogen11034185
CD3-Alexa Fluor 700 (17A2)BioLegend100216
CD3ε -Biotina (145-2C11)BioLegend100304
CD3ε -BV421 (145-2C11)BioLegend100341
CD45.1/CD45.2 topi congeniciN/AN/AAllevati nel nostro laboratorio
CD45.1-FITC (A20)BD Biosciences553775
CD45.2-PE (104)BD Biosciences560695
CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5)BioLegend100430
CD4-Biotina (GK1.5)BioLegend100404
CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7)BioLegend100730
CD8a-Biotina (53-6.7)BioLegend100704
Tubo da centrifuga 15mlNICHIRYO00-ETS-CT-15
Provetta da centrifuga 50mlNICHIRYO00-ETS-CT-50
c-Kit-APC-eFluor780 (2B8)Invitrogen47117182
D-PBS (-) senza Ca e Mg, liquido Nacalai14249-24
Siero fetale bovinoThermo Fisher10270106
Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10)eBioscience46135182
FlowJo versione 10BD Biosciences 
Gmmacell 40 ExactorBest theratronicsN/A
Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5)BioLegend108422
Gr-1-Biotin (RB6-8C5)BioLegend108404
Hoxb5-tri-mTopi ciliegia (sfondo C57BL/6J) N/AN/AAllevato nel nostro laboratorio
IgG da siero di ratto, grado tecnico, >=80% (SDS-PAGE), soluzione acquosa tamponataSigma-AldrichI8015-100MG
isofluranoPfizer4987-114-13340-3 
Kimwipes S200NIPPON PAPER CRECIA 6-6689-01
Colonne LSMilteny biotec130-042-401
Tampone di lisi BD555899
MACS  MultiStandMilteny biotec130-042-303
Micropiastra per coltura tissutale (per cella di adesione) 6WellIWAKI3810-006
Separatore MidiMACSMilteny biotec130-042-302
Gabbie per torte di topiNatsume SeisakushoKN-331
Centrifuga refrigerata multiusoTOMYEX-125
NARCOBIT-E (II)Natsume SeisakushoKN-1071-I
NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136)BioLegend108728
Penicillina-Streptomicina Soluzione Mistanacalai26253-84
Malta in Porcellana φ 120 mm con pestelloAsone6-549-03
Provetta LoBind per proteine 1,5 mLEppendorf22431081
Sca-I-BUV395 (D7)BD Biosciences563990
Lama per bisturi in acciaio inossidabileFastGeneFG-B2010
Streptavidin-BUV737BD Biosciences612775
SYTOX-redInvitrogenS34859
Tailveiner Resrain Resrain for Mice standardBraintreeTV-150 STD
TCRb-BV421 (H57-597)BioLegend109230
Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119)BioLegend116220
Ter-119-Biotina (TER-119)BioLegend116204
Terumo 5ml Siringa Luer-Slip concentricaTERUMOSS-05LZ
Terumo Ago ipodermico 23G x 1TERUMONN-2325-R
https://www.flowjo.com/solutions/flowjo

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
  2. Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.

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HSC a lungo termineHSC a breve terminetopi reporter Hoxb5citometria a flussoisolamento del midollo osseomeccanismi di autorinnovamentosmistamento cellularecellule lineage negativedifferenziazione multi lineage

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