Presentiamo un protocollo passo-passo per l'isolamento di cellule staminali ematopoietiche a lungo termine (LT-HSCs) e HSCs a breve termine (ST-HSCs) utilizzando il sistema reporter Hoxb5.
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Articolo metodologico
Metodo di isolamento per cellule staminali ematopoietiche a lungo e breve termine
In questo articolo
Sommario
Abstract
La capacità di auto-rinnovamento e il potenziale di differenziazione multi-lineage sono generalmente considerati come le caratteristiche distintive delle cellule staminali ematopoietiche (HSC). Tuttavia, numerosi studi hanno suggerito che esiste eterogeneità funzionale nel compartimento HSC. Recenti analisi a singola cellula hanno riportato cloni HSC con diversi destini cellulari all'interno del compartimento HSC, che sono indicati come cloni HSC distorti. I meccanismi alla base di risultati eterogenei o scarsamente riproducibili sono poco compresi, soprattutto per quanto riguarda la durata dell'auto-rinnovamento quando le frazioni HSC purificate vengono trapiantate mediante immunocolorazione convenzionale. Pertanto, stabilire un metodo di isolamento riproducibile per le HSC a lungo termine (LT-HSC) e le HSC a breve termine (ST-HSC), definite dalla durata del loro auto-rinnovamento, è fondamentale per superare questo problema. Utilizzando uno screening imparziale multi-step, abbiamo identificato un fattore di trascrizione, Hoxb5, che potrebbe essere un marker esclusivo di LT-HSC nel sistema ematopoietico del topo. Sulla base di questa scoperta, abbiamo stabilito una linea di topi reporter Hoxb5 e isolato con successo LT-HSC e ST-HSC. Qui descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento di LT-HSC e ST-HSC utilizzando il sistema di reporter Hoxb5 . Questo metodo di isolamento aiuterà i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi di auto-rinnovamento e le basi biologiche di tale eterogeneità nel compartimento HSC.
Introduzione
Le cellule staminali ematopoietiche (HSC), che possiedono capacità di auto-rinnovamento e multipotenza, risiedono all'apice della gerarchia ematopoietica 1,2. Nel 1988, Weissman e colleghi hanno dimostrato per la prima volta che l'isolamento delle HSC di topo potrebbe essere ottenuto utilizzando la citometria a flusso3. Successivamente, una frazione definita da una combinazione di marcatori di superficie cellulare, Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−, è stata riportata per contenere tutte le HSC nei topi
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali descritti sono stati approvati dal RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research.
1. Precondizionamento dei topi riceventi
- Preparare topi congeniti maschi C57BL / 6 di età compresa tra 8 e 10 settimane come topi riceventi. Il numero di topi riceventi dipende dal protocollo sperimentale. In genere prepariamo 10-20 topi per ogni condizione.
- Nutrire i topi con acqua sterilizzata integrata con enrofloxacina (170 mg / L). Poiché i topi riceventi irradiati sono altamente suscettibili alle infezioni, mantenere le gabbie il più pulite possibile.
NOTA: L'integrazione con antibi....
- Nutrire i topi con acqua sterilizzata integrata con enrofloxacina (170 mg / L). Poiché i topi riceventi irradiati sono altamente suscettibili alle infezioni, mantenere le gabbie il più pulite possibile.
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Risultati
In precedenza, la capacità di auto-rinnovamento è stata misurata utilizzando saggi di trapianto competitivi, in cui si ritiene che le HSC del donatore mantengano la loro capacità di auto-rinnovamento solo se si osservano cellule donatrici multi-laudio nel sangue periferico ricevente17. Inoltre, diversi rapporti definiscono le LT-HSC come cellule che continuano a produrre cellule del sangue periferico diversi mesi dopo il secondo trapianto di midollo osseo10,18
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Discussione
Tradizionalmente, le HSC definite dai marcatori di superficie cellulare sono state preparate per studiare le funzioni delle HSC, come la capacità di auto-rinnovamento e la multi-potenza 19,20,21. Tuttavia, la frazione HSC immunofenotipicamente definita (Lineage−c-Kit+Sca-1+CD150+CD34−/loFlk2−) contiene due popolazioni HSC discrete: LT-HSCs e ST-HSCs
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse associati a questo studio.
Ringraziamenti
Riconosciamo con gratitudine Hiroshi Kiyonari per la cura degli animali e per aver fornito topi riceventi a RIKEN BDR, così come Hitomi Oga, Kayoko Nagasaka e Masaki Miyahashi per la gestione del laboratorio presso l'Università di Kobe. Gli autori apprezzano molto anche il continuo supporto per questo lavoro. Masanori Miyanishi è stato supportato dalla Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Numbers JP17K07407 e JP20H03268, dalla Mochida Memorial Foundation for Medical and Pharmaceutical Research, dalla Life Science Foundation of Japan, dalla Takeda Science Foundation, dalla Astellas Foundation for Research on Metabolic Disorders e da AMED-PRIM....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Striscia da 0,2 mL da 8 provette, tappo a cupola | SSIbio | 3230-00 | |
| 0,5M EDTA pH 8,0 | Iinvtrogen | AM9260G | |
| 100 &; m Cell Strainer | Falcon | 352360 | |
| Siringa da insulina 30G | BD | 326668 | |
| 40 & micro; m Cell Strainer | Falcon | 352340 | |
| Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 mL, con filtro cellulare Tappo a scatto | FALCON | 352235 | |
| Soluzione colorante di vitalità a 7 AAD | BioLegend | 420404 | |
| 96 pozzetti U-Bottom | FALCON | 351177 | |
| Anti-APC-MicroBeads | Milteny biotec | 130-090-855 | |
| Aspiratore con trappola pallone | Biosan | FTA-1 | |
| B220-Alexa Fluor 700 (RA3-6B2) | BioLegend | 103232 | |
| B220-Biotina (RA3-6B2) | BioLegend | 103204 | |
| B220-BV786 (RA3-6B2) | BD Biosciences | 563894 | |
| B6. Topi congenici CD45.1 | Sankyo Labo Service | N/A | |
| Baytril 10% | BAYER | 341106546 | |
| BD FACS Aria II sistema di ordini speciali | BD | N/A | |
| Tampone colorante brillante | BD | 566349 | |
| CD11b-Alexa Fluor 700 (M1/70) | BioLegend | 101222 | |
| CD11b-Biotina (M1/70) | BioLegend | 101204 | |
| CD11b-BUV395 (M1/70) | BD Biosciences | 563553 | |
| CD11b-BV711 (M1/70) | BD Biosciences | 563168 | |
| CD127-Alexa Fluor 700 (A7R34) | Invitrogen | 56-1271-82 | |
| CD150-BV421 (TC15-12F12.2) | BioLegend | 115943 | |
| CD16/CD32-Alexa Fluor 700 (93) | Invitrogen | 56-0161-82 | |
| CD34-Alexa Fluor 647 (RAM34) | BD Biosciences | 560230 | |
| CD34-FITC (RAM34) | Invitrogen | 11034185 | |
| CD3-Alexa Fluor 700 (17A2) | BioLegend | 100216 | |
| CD3ε -Biotina (145-2C11) | BioLegend | 100304 | |
| CD3ε -BV421 (145-2C11) | BioLegend | 100341 | |
| CD45.1/CD45.2 topi congenici | N/A | N/A | Allevati nel nostro laboratorio |
| CD45.1-FITC (A20) | BD Biosciences | 553775 | |
| CD45.2-PE (104) | BD Biosciences | 560695 | |
| CD4-Alexa Fluor 700 (GK1.5) | BioLegend | 100430 | |
| CD4-Biotina (GK1.5) | BioLegend | 100404 | |
| CD8a-Alexa Fluor 700 (53-6.7) | BioLegend | 100730 | |
| CD8a-Biotina (53-6.7) | BioLegend | 100704 | |
| Tubo da centrifuga 15ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-15 | |
| Provetta da centrifuga 50ml | NICHIRYO | 00-ETS-CT-50 | |
| c-Kit-APC-eFluor780 (2B8) | Invitrogen | 47117182 | |
| D-PBS (-) senza Ca e Mg, liquido | Nacalai | 14249-24 | |
| Siero fetale bovino | Thermo Fisher | 10270106 | |
| Flk2-PerCP-eFluor710 (A2F10) | eBioscience | 46135182 | |
| FlowJo versione 10 | BD Biosciences | ||
| Gmmacell 40 Exactor | Best theratronics | N/A | |
| Gr-1-Alexa Fluor 700 (RB6-8C5) | BioLegend | 108422 | |
| Gr-1-Biotin (RB6-8C5) | BioLegend | 108404 | |
| Hoxb5-tri-mTopi ciliegia (sfondo C57BL/6J) | N/A | N/A | Allevato nel nostro laboratorio |
| IgG da siero di ratto, grado tecnico, >=80% (SDS-PAGE), soluzione acquosa tamponata | Sigma-Aldrich | I8015-100MG | |
| isoflurano | Pfizer | 4987-114-13340-3 | |
| Kimwipes S200 | NIPPON PAPER CRECIA | 6-6689-01 | |
| Colonne LS | Milteny biotec | 130-042-401 | |
| Tampone di lisi | BD | 555899 | |
| MACS MultiStand | Milteny biotec | 130-042-303 | |
| Micropiastra per coltura tissutale (per cella di adesione) 6Well | IWAKI | 3810-006 | |
| Separatore MidiMACS | Milteny biotec | 130-042-302 | |
| Gabbie per torte di topi | Natsume Seisakusho | KN-331 | |
| Centrifuga refrigerata multiuso | TOMY | EX-125 | |
| NARCOBIT-E (II) | Natsume Seisakusho | KN-1071-I | |
| NK-1.1-PerCP-Cy5.5 (PK136) | BioLegend | 108728 | |
| Penicillina-Streptomicina Soluzione Mista | nacalai | 26253-84 | |
| Malta in Porcellana φ 120 mm con pestello | Asone | 6-549-03 | |
| Provetta LoBind per proteine 1,5 mL | Eppendorf | 22431081 | |
| Sca-I-BUV395 (D7) | BD Biosciences | 563990 | |
| Lama per bisturi in acciaio inossidabile | FastGene | FG-B2010 | |
| Streptavidin-BUV737 | BD Biosciences | 612775 | |
| SYTOX-red | Invitrogen | S34859 | |
| Tailveiner Resrain Resrain for Mice standard | Braintree | TV-150 STD | |
| TCRb-BV421 (H57-597) | BioLegend | 109230 | |
| Ter-119-Alexa Fluor 700 (TER-119) | BioLegend | 116220 | |
| Ter-119-Biotina (TER-119) | BioLegend | 116204 | |
| Terumo 5ml Siringa Luer-Slip concentrica | TERUMO | SS-05LZ | |
| Terumo Ago ipodermico 23G x 1 | TERUMO | NN-2325-R |
Riferimenti
- Weissman, I. L., Shizuru, J. A. The origins of the identification and isolation of hematopoietic stem cells, and their capability to induce donor-specific transplantation tolerance and treat autoimmune diseases. Blood. 112 (9), 3543-3553 (2008).
- Majeti, R., Park, C. Y., Weissman, I. L.
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Ristampe e permessi
