Valutazione degli effetti delle biotossine sulle funzioni delle cellule immunitarie nel pesce zebra

Sommario

Questo protocollo descrive saggi citofluorimetrici in grado di valutare gli effetti dell'esposizione alle tossine sulle funzioni endocitiche di diverse sottopopolazioni di leucociti zebrafish. L'uso di inibitori funzionali specifici nel saggio consente la differenziazione dei meccanismi endocitici alterati.

Abstract

Una varietà di tossine biologiche può essere presente a livelli dannosi nell'ambiente acquatico. I cianobatteri sono un gruppo eterogeneo di microrganismi procarioti che producono cianotossine nell'ambiente acquatico. Queste biotossine possono essere epatotossine, dermatossine o neurotossine e possono colpire pesci e mammiferi. Ad alti livelli, questi composti sono fatali. A livelli non letali, agiscono in modo insidioso e influenzano le funzioni delle cellule immunitarie. Le biotossine prodotte dalle alghe includono la microcistina e l'anatossina A. Gli animali acquatici possono anche ingerire materiale contaminato dalla neurotossina botulinica E (BoNT/E) prodotta dal Clostridium botulinum, provocando anche la morte o la diminuzione delle funzioni immunitarie. Il pesce zebra può essere utilizzato per studiare come le tossine influenzano le funzioni delle cellule immunitarie. In questi studi, l'esposizione alle tossine può essere eseguita in vivo o in vitro. Studi in vivo espongono il pesce zebra alla tossina e quindi le cellule vengono isolate. Questo metodo dimostra come l'ambiente tissutale possa influenzare la funzione dei leucociti. Gli studi in vitro isolano prima le cellule e poi le espongono alla tossina nei pozzetti di coltura. I leucociti sono ottenuti mediante estrazione del midollo renale, seguita da centrifugazione in gradiente di densità. Il modo in cui i leucociti internalizzano i patogeni è determinato da meccanismi endocitici. I saggi di fagocitosi con citometria a flusso dimostrano se i meccanismi endocitici sono stati alterati dall'esposizione alle tossine. Mancano studi che utilizzano leucociti isolati per determinare in che modo le tossine causano disfunzioni immunitarie. Le procedure descritte in questo articolo consentiranno ai laboratori di utilizzare il pesce zebra per studiare i meccanismi che vengono influenzati quando una tossina ambientale diminuisce le funzioni endocitiche delle cellule immunitarie.

Introduzione

Esistono molti tipi di biotossine ambientali e agenti immunosoppressori. Le fioriture di alghe che contengono tossine batteriche si verificano nelle acque interne e possono anche verificarsi come biofilm¹. I cianobatteri (alghe blu-verdi) si trovano naturalmente in tutti gli ecosistemi d'acqua dolce. Le fioriture cianobatteriche sono notevolmente aumentate nei sistemi di acqua dolce². In determinati momenti, i cianobatteri possono produrre tossine dannose per gli animali acquatici e terrestri. Queste tossine possono colpire il fegato, la pelle e le mucose e/o il sistema nervoso. Due composti prodotti dai cianobatteri sono la microcistina e l'anatossina A. La microcistina è un eptapeptide ciclico³. L'anatossina A è un alcaloide⁴. La neurotossina botulinica E (BoNT/E) è un'altra tossina presente nei sistemi acquatici. È prodotto dal Clostridium botulinum e può essere ingerito dagli animali acquatici⁵.

L'esposizione alle tossine ambientali colpisce i pesci e può anche influire sulla salute degli animali e aumentare l'insorgenza di malattie⁶. Capire come queste tossine influenzano le cellule immunitarie è fondamentale per determinare i rischi associati all'esposizione a queste sostanze. Il pesce zebra è un modello eccellente per studiare gli effetti delle tossine ambientali sulle cellule immunitarie⁷. Lo sviluppo di un metodo che utilizza la citometria a flusso e i leucociti di pesce zebra è molto vantaggioso. Il pesce zebra ha rilevanza fisiologica per l'uomo e questo metodo può essere applicato a un'ampia gamma di aree di ricerca, dalla tossicologia di base e dall'immunologia alla scoperta di farmaci e alla biologia dello sviluppo. Poiché sono organismi acquatici, i pesci zebra sono particolarmente adatti per studiare gli effetti delle tossine ambientali presenti nell'acqua⁷. L'uso del pesce zebra è meno costoso rispetto ad altri modelli di vertebrati e il loro uso solleva meno preoccupazioni etiche.

I globuli bianchi, o leucociti, sono la prima linea di difesa cellulare contro gli organismi che causano malattie. L'endocitosi è il processo di una cellula che assorbe o internalizza un liquido o una particella esterna alla cellula. Ciò si ottiene quando la cellula racchiude il composto in una vescicola⁸. I leucociti usano questo processo come primo passo per uccidere gli agenti patogeni e preparare una difesa contro le malattie. La fagocitosi è un tipo di endocitosi ed è stata uno dei primi metodi utilizzati per studiare gli effetti degli inquinanti ambientali sulla salute dei pesci⁹. Il laboratorio Petrie-Hanson ha sviluppato metodi che utilizzano leucociti di pesce zebra per esaminare le biotossine per la loro potenziale capacità di interferire con le funzioni endocitiche e fagocitiche dei leucociti e di influire sulle difese immunitarie. I tipi di endocitosi inclusi in questi metodi sono la pinocitosi, la fagocitosi, la fagocitosi mediata dal recettore del calcio dipendente e la fagocitosi mediata dal recettore del mannosio. L'uso di metodi di citometria a flusso con il pesce zebra è stato descritto per la prima volta nel laboratorio Petrie-Hanson⁹ e viene utilizzato di routine per studiare le tossine acquatiche e gli agenti patogeni. Il pesce zebra mutante Rag1^-/- non ha cellule T e B¹⁰ e può essere utilizzato per studiare in modo specifico i meccanismi delle cellule immunitarie innate.

La citometria a flusso è basata su laser e può essere utilizzata per determinare le proprietà fisiche delle cellule. La dispersione diretta, o valore FSC, viene tracciata sull'asse X e rappresenta la dimensione della cella. La dispersione laterale, o SSC, è tracciata sull'asse Y e rappresenta la granularità citoplasmatica della cellula. Il grafico risultante mostra popolazioni di cellule con caratteristiche fisiche simili raggruppate insieme, con i diversi tipi di cellule che appaiono in varie posizioni su un grafico a dispersione. Queste popolazioni possono cambiare posizione sul grafico a dispersione^{al variare delle} caratteristiche fisiche delle cellule. L'uso di questa tecnica con leucociti zebrafish consente ai ricercatori di valutare i cambiamenti nelle popolazioni cellulari in risposta a vari stimoli, comprese le tossine ambientali.

Il citometro a flusso è multidimensionale e nella valutazione possono essere utilizzati diversi tipi di fluorofori per caratterizzare ulteriormente le cellule e la loro attività. Nei saggi descritti in questo protocollo, l'endocitosi è caratterizzata dalla misurazione della quantità di materiale fluorescente che una cellula ha internalizzato. Se e come l'esposizione alle tossine influisce sui meccanismi endocitici può essere determinato confrontando la capacità delle cellule esposte alle tossine di assorbire il materiale rispetto alla capacità delle cellule non esposte alle tossine utilizzando la citometria a flusso. I processi endocitici che possono essere valutati in questo modo includono la pinocitosi, l'endocitosi mediata dal recettore e la fagocitosi.

La pinocitosi è l'assorbimento di componenti solubili e non utilizza i recettori cellulari. L'assorbimento comporta il riarrangiamento citoplasmatico da parte di microfilamenti e microtubuli per formare piccoli vacuoli. Il giallo luciferasi (LY) è un colorante fluorescente utilizzato per misurare l'assorbimento di liquidi mediante pinocitosi non selettiva¹¹. L'endocitosi mediata dal recettore comporta l'assorbimento selettivo di grandi molecole. Il destrano marcato con fluoresceina (FITC) (DX) 40 può essere utilizzato per valutare questo processo. La fagocitosi è una forma di endocitosi che ingerisce particelle di dimensioni superiori a 0,5 micrometri. Questo processo viene studiato mediante procedure che utilizzano FITC-DX70 e FITC-Eschericia coli. DX40 e DX70 hanno pesi molecolari rispettivamente di 40.000 e 70.000. FITC-E. coli è il ceppo standard di laboratorio di E. coli legato a un fluoro che può essere misurato dal citometro a flusso. Molte forme dell'endocitosi mediata dal recettore richiedono il calcio come molecola di segnalazione e per il riarrangiamento citoscheletrico⁹. Un altro tipo di endocitosi mediata dal recettore è l'endocitosi mediata dal recettore del mannosio (MR). I recettori del mannosio sono proteine transmembrana che riconoscono le forme di mannano sulle superfici cellulari microbiche⁹. Per ottimizzare queste procedure, è necessario creare una curva dose-risposta con ciascuna tossina per stabilire le dosi da utilizzare. È necessario eseguire una curva di saturazione per LY, FITC-DX40, FITC-DX70 e FITC-E. coli per valutare la concentrazione corretta da utilizzare.

I meccanismi utilizzati dai leucociti per internalizzare le diverse particelle possono variare. Per suggerire quale componente del processo può essere influenzato dall'esposizione alle tossine, possono essere aggiunti inibitori per bloccare i meccanismi fagocitici. La citocalasina D (CCD) inibisce il movimento dei microtubuli e quindi la pinocitosi. La CCD non influenza l'endocitosi mediata dal recettore¹¹. L'EDTA blocca l'endocitosi mediata dal recettore del calcio (Ca²⁺). Il mannano è un ligando naturale per la risonanza magnetica. Il mannano è usato come inibitore del recettore del mannosio per valutare se la fagocitosi o la pinocitosi è mediata dal recettore del mannosio⁹.

Lo scopo di questo protocollo è dimostrare le procedure per determinare se l'esposizione alle tossine ha influenzato la capacità dei leucociti fagocitici di assorbire i patogeni. Questi protocolli possono anche discernere se uno specifico meccanismo endocitico è interessato. L'esecuzione di questi saggi sul citometro a flusso consente un'ulteriore discriminazione selezionando le popolazioni di leucociti in base alle dimensioni e alla granularità citoplasmatica per determinare se le sottopopolazioni leucocitarie sono state influenzate in modo differenziale. Questo metodo si basa sul gating elettronico delle popolazioni cellulari.

Protocollo

Questo protocollo è stato approvato dal Mississippi State University Institutional Animal Care and Use Committee (MSU-IACUC). Tutti i pesci zebra utilizzati in questo studio sono stati allevati da una colonia omozigote di pesce zebra mutante rag1^-/- precedentemente stabilita nell'incubatoio specifico privo di agenti patogeni del College of Veterinary Medicine, Mississippi State University (MSU)¹⁰. In questo incubatoio sono stati propagati anche pesci zebra di tipo selvatico. In questi studi, l'esposizione alle tossine può essere eseguita in vivo o in vitro. Studi in vivo espongono il pesce zebra alla tossina, dopodiché i leucociti vengono isolati, indicando come la tossina e il microambiente tissutale possano interagire e influenzare la funzione dei leucociti. Gli studi in vitro isolano i leucociti e poi espongono le cellule alla tossina in pozzetti di coltura.

1. Preparazione del reagente e della soluzione

1. Tampone di selezione delle cellule attivate fluorescenti (FACS): (soluzione salina bilanciata di Hanks senza calcio o magnesio (HBSS) + 0,05% di albumina sierica bovina (BSA)) (vedi Tabella dei materiali). Preparalo fresco prima dell'isolamento cellulare.
2. Terreni di coltura tissutale (MTC): utilizzare RPMI-1640 integrato con glutamax e siero fetale bovino al 10% (vedere Tabella dei materiali).
3. Citocalasina D (CCD): Preparare la soluzione madre risospendendo il prodotto disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) in 1 mL di etanolo assoluto a prova 200. Preparare la soluzione di lavoro aggiungendo 20 μL di CCD stock a 980 μL di tampone FACS, per ottenere la concentrazione finale di 2,5 μg/mL.
4. EDTA: La soluzione madre è di 1 mg/mL. Preparare la soluzione di lavoro aggiungendo 100 μl della soluzione madre a 900 μl di tampone FACS, per ottenere la concentrazione finale di 1 mM.
5. Mannan: Preparare una soluzione madre da 1 mg/mL (vedere la Tabella dei materiali). Successivamente, preparare la soluzione di lavoro aggiungendo 100 μl della soluzione madre a 900 μl di tampone FACS, per ottenere la concentrazione finale di 500 μg/mL.
6. Preparare Lucifer Yellow (10 μg/mL) (LY, un colorante fluorescente), Dextran-40 (DX-40, 500 μg/mL) e Dextran-70 (DX-70, 500 μg/mL) separatamente preparando una soluzione da 1 mg/mL di ciascuno risospendendo i reagenti disponibili in commercio (vedere la Tabella dei materiali) in acqua sterile.
7. Batteri della fluoresceina (FITC): Coltivare Escherichia coli DH5α (vedi Tabella dei materiali) agitando in 100 mL di terreno Luria Bertani (LB) integrato con 50 μg/mL di FITC durante la notte a 37 °C in un ambiente protetto dalla luce, ottenere una densità ottica (OD) di 0,8 a 540 nm.
   1. Lavare i batteri (3x) con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) mediante centrifugazione per 10 minuti a 1000 x g seguita da riscaldamento a 60 °C per 20 minuti. Lavare ancora 1 volta, quindi regolare le concentrazioni batteriche su OD₅₄₀ 0,8. Questa sarà la soluzione di serie.
   2. Preparare la soluzione di lavoro effettuando una diluizione 1:100 della soluzione madre (1 mL di stock: 99 mL di tampone FACS). Regolare la concentrazione finale a 1,8 x 10⁸ cellule/mL.

2. Cura del pesce zebra

1. Mantenere il pesce zebra in un sistema di flusso a passaggio singolo su acqua comunale declorata e nutrire a sazietà la farina di pesce ad alto contenuto proteico e l'artemia viva.
2. A 6 mesi di età, rimuovere i pesci zebra di sesso misto dalle loro vasche e trasportarli al laboratorio di ricerca per utilizzarli nell'esperimento. Questa è l'età migliore da utilizzare per l'isolamento del numero ottimale di leucociti dal midollo renale⁹.

3. Isolamento cellulare

1. Eutanasia di 10 zebrafish in tricaina (~100 mL, 4 mg/mL di tricaina metano solfonato tamponato con fosfato/litro di acqua di pesce) (vedi Tabella dei materiali) seguendo i metodi stabiliti⁹.
2. Inserire un filtro cellulare da 40 μm in una provetta da centrifuga conica da 50 mL.
3. Rimuovere i tessuti del midollo renale⁹ e metterli in una provetta C con 3 mL di terreno di coltura tissutale e omogeneizzare il tessuto utilizzando un dissociatore tissutale. Questa è la procedura preferita.
4. In alternativa, disgregare i tessuti con l'estremità di gomma di una siringa da 3 ml in un filtro cellulare. Dopo che il tessuto è stato omogeneizzato (o disgregato), versare la sospensione attraverso un filtro cellulare da 40 μm posizionato sopra una provetta conica da 50 mL.
5. Centrifugare la sospensione filtrata a 500 x g per 5 minuti a 16 °C. Versare il surnatante. Risospendere le cellule in 3 mL di MTC. Ripetere questo passaggio due volte.
6. Sovrapporre con cura le cellule su 3 mL di terreno filtrato sterile con gradiente di densità (1,077 g/mL) a temperatura ambiente.
7. Quindi, centrifugare a 800 x g per 20 minuti a 16 °C. Assicurarsi che il freno sia sull'impostazione più bassa, in modo che le celle non vengano risospese quando la centrifuga si ferma.
8. Rimuovere lo strato di buffy opaco dall'interfaccia in una provetta a fondo tondo da 14 mL.
9. Lavare le cellule aggiungendo 5 mL di MTC e mescolando con una pipetta Pasteur. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 16 °C.
10. Ripetere il passaggio, scartando il surnatante e rimettendo in sospensione il pellet cellulare in MTC per produrre circa 1 x 10⁶ cellule/mL.

4. Saggio di vitalità cellulare

1. Per monitorare la vitalità cellulare, valutare la morte cellulare utilizzando la colorazione con ioduro di propidio (PI).
   1. Aggiungere PI (200 μg/mL) alla concentrazione di 5 μL/mL di cellule da analizzare. Leggi sul canale PE/Texas Red.
      NOTA: Lo ioduro di propidio si diffonde attraverso i fori nelle membrane delle cellule morte, colorandole. La vitalità valutata è stata dell'85% per il presente studio.

5. Incubazione delle tossine

1. Aliquotare 200 μl di cellule dalla sospensione cellulare isolata in ciascun pozzetto di una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti (3 pozzetti per il controllo e 3 pozzetti per l'esposizione alle tossine). Ciò consente di eseguire le repliche in triplice copia.
2. Aggiungere 2 mL di TCM a ciascun pozzetto.
3. Aggiungere tossina (~2,5 μg/mL) ai tre pozzetti.
   NOTA: La concentrazione della tossina deve essere ottimizzata prima di iniziare l'esperimento e dipenderà dalla tossina utilizzata per il test.
4. Incubare la piastra di coltura tissutale per il tempo di esposizione desiderato. Il tempo di esposizione desiderato deve essere ottimizzato prima di iniziare l'esperimento e dipenderà dalla tossina utilizzata per il saggio. Nel presente studio, il tempo di esposizione era di ~1 ora.
5. Dopo il tempo di esposizione, posizionare la piastra di coltura tissutale sul ghiaccio per 10 minuti.
6. Pipettare le cellule in ogni pozzetto su e giù con cura per rimuovere eventuali cellule aderenti dalla piastra.
7. Rimuovere le cellule dalla piastra in una provetta da centrifuga a fondo tondo da 14 mL.
8. Centrifugare le celle a 300 x g per 5 minuti a 16 °C. Risospendere le cellule in 3 mL di tampone FACS. Ripetere il passaggio due volte.
9. Risospendere le cellule in 1,5 mL di tampone FACS.
   NOTA: Per gli studi in vivo , esporre il pesce zebra alla tossina (a una concentrazione simile a quella menzionata sopra), quindi isolare le cellule.

6. Saggio di endocitosi

1. Aliquotare 100 μL di cellule in provette per citometria a flusso da 5 mL. Etichettare le provette come segue con quattro provette replicate da ciascun pozzetto: (1) LY, (2) DX40, (3) DX70, (4) FITC-E. coli.
2. Aggiungere il colorante a fluorescenza come indicato al punto 1.6 e al punto 1.7 nelle provette appropriate: 50 μl di LY nella provetta (1), 50 μl di DX40 nella provetta (2); 50 μl DX70 alla provetta (3); 50 μL di FITC-E. coli in provetta (4).
3. Incubare per 1 ora. Aggiungere 200 μl di tampone FACS a ciascuna provetta.
4. Centrifugare le celle a 400 x g per 5 minuti a 16 °C. Versare il surnatante e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS. Ripeti questo passaggio tre volte. Eseguire l'analisi citofluorimetrica.

7. Citometria a flusso

1. Eseguire la citometria a flusso per visualizzare le popolazioni cellulari e raccogliere dati. Fare riferimento a Hohn et ^al.9 per i dettagli.
2. Identificare le popolazioni di cellule target al primo passo. Utilizzare la dispersione laterale (SSC) (di solito l'asse verticale) per rimuovere detriti e piccole cellule picnotiche sul lato sinistro e la dispersione in avanti (FSC) (di solito l'asse orizzontale) per rimuovere gli stessi detriti sul fondo del grafico.
3. Elimina le letture del doppietto (le celle contate due volte). Questa operazione viene eseguita utilizzando un gate a geometria di impulsi (FSC-H x FSC-A).
4. Determina il segnale di fondo. Eseguire il controllo della fluorescenza solo delle cellule e un controllo della fluorescenza dell'isotipo per ogni fluorocromo utilizzato, per identificare i livelli di fluorescenza di fondo.
   NOTA: Ogni fluorocromo ha il suo livello unico di fluorescenza di fondo, influenzato dall'autofluorescenza cellulare e dal legame non specifico. Questo distingue tra veri segnali positivi e fluorescenza di fondo. Quando si identificano e si controllano le popolazioni cellulari in base alla fluorescenza, questi valori di controllo vengono sottratti dal numero di eventi positivi e il numero risultante è il numero utilizzato per l'analisi.
5. Eseguire i campioni e identificare le popolazioni cellulari da controllare. Utilizzare FSC e SSC per caratterizzare morfologicamente e identificare diverse popolazioni cellulari all'interno di una miscela di cellule.
   NOTA: FSC è principalmente correlato alla dimensione della cella. Le celle più grandi disperderanno più luce nella direzione in avanti, con conseguenti valori FSC più elevati, mentre le celle più piccole disperderanno meno luce e avranno valori FSC più bassi. Celle di diverse dimensioni si raggrupperanno in cluster. Ad esempio, i linfociti, essendo più piccoli, possono apparire come un cluster separato con valori di FSC inferiori rispetto ai granulociti. La SSC è correlata alla granularità, alla complessità e alla struttura interna della cellula. Le cellule con maggiore granularità citoplasmatica avranno valori di SSC più elevati. Cellule simili si raggrupperanno insieme. Ad esempio, i neutrofili hanno granuli citoplasmatici e si raggruppano a un valore di SSC più elevato rispetto ai linfociti.
6. Eseguire tutti i campioni e, in base a FSC/SSC, applicare i gate alle popolazioni cellulari da analizzare ulteriormente. Le aree gate vengono applicate in base alla densità delle celle e alle popolazioni di interesse.
7. Tracciare le aree gate sugli istogrammi per analizzare l'intensità media di fluorescenza (MFI) di FITC in ciascun gate per la fluorescenza a 495 nm / 519 nm con il laser blu.
8. Esporta il conteggio delle celle come determinato dal software per eccellere nel programma di analisi.
9. Analizzare i dati in un pacchetto software statistico (vedi Tabella dei materiali).
10. Confrontare l'MFI di ciascuna popolazione di cellule di controllo con l'MFI di popolazioni cellulari esposte alla tossina.

8. Effetto della tossina sui meccanismi endocitici ed effetti degli inibitori CCD, EDTA e mannano sui meccanismi endocitici

NOTA: Per assorbire liquidi o particelle, il citoplasma cellulare si muove attivamente. Questo movimento richiede più elementi strutturali e percorsi di segnalazione. Le biotossine possono influenzare uno qualsiasi di questi elementi o percorsi. Il confronto degli effetti di specifici inibitori caratterizzati può essere utilizzato per aiutare a discernere come la biotossina possa agire¹¹.

1. Eseguire l'isolamento delle celle come descritto nel passaggio 3.
2. Aliquotare 100 μL di cellule in provette per citometria a flusso da 5 mL (con quattro provette replicate da ciascun pozzetto).
   NOTA: Etichettare le provette come segue: (5) CCD + LY (il CCD inibisce la pinocitosi inibendo il riarrangiamento dei microfilamenti e dei microtubuli; LY viene utilizzato per valutare l'assorbimento di liquidi mediante micropinocitosi)⁹. (6) EDTA + DX40 (EDTA blocca la fagocitosi e la micropinocitosi mediate dal recettore Ca²⁺ dipendente; misurare se l'assorbimento coinvolge un meccanismo dipendente dal calcio). (7) EDTA + DX70. (8) EDTA + FITC-E. coli. (9) Mannano + DX40 (il mannano inibisce l'assorbimento specifico da parte del recettore del mannosio, misurando l'endocitosi RM-dipendente⁹). (10) Mannan + DX70. (11) Mannano + FITC-E. coli.
3. Aggiungere inibitori: 1 μL di CCD alla provetta (5); 10 μl di EDTA in provette (6-8); 100 μL di Mannano in provette (9-11). Seguire le concentrazioni come indicato al punto 1. Incubare per 5 min.
4. Aggiungere il secondario fluorescente alle provette appropriate: 50 μl di LY alle provette (1) e (5); 50 μl di DX40 nella provetta (2), (6) e (9); 50 μl di DX70 nella provetta (3), (7) e (10); 50 μl di FITC-E. coli in provetta (4), (8) e (11). Incubare per 30 min.
5. Aggiungere 200 μl di tampone FACS a ciascuna provetta. Centrifugare a 400 x g a 16 °C per 5 min.
6. Versare il surnatante e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS. Ripetere i passaggi 8.5-8.6 due volte.
7. Eseguire i campioni sul citometro a flusso seguendo il passaggio 7.

Risultati

I saggi di endocitosi utilizzano leucociti misti isolati da gradienti e controllati per fagociti e linfociti per determinare se specifici meccanismi cellulari sono stati alterati dall'esposizione alle tossine. Innanzitutto, le celle vengono controllate in base alle dimensioni e alla granularità¹⁰. Le cellule morte, frammentate o morenti vengono visualizzate nell'angolo in basso a sinistra del grafico a dispersione e vengono eliminate, non analizzate per la fagocitosi. La porta dei fagociti comprende i macrofagi, i Natural Killer (cellule NK) e i granulociti, mentre la porta dei linfociti comprende i linfociti, le cellule B fagocitiche e le cellule citotossiche non specifiche (NCC) (Figura 1).

La fagocitosi è determinata dall'assorbimento di particelle marcate con FITC, come mostrato dalla lettura della fluorescenza a 495 nm / 519 nm con il laser blu. L'autofluorescenza di fondo e la fluorescenza di legame aspecifica vengono eliminate tenendo conto dell'intensità media della fluorescenza (MFI) emessa dalle cellule di controllo e del controllo dell'isotipo. Con ciascun inibitore deve essere eseguita una curva dose-risposta per stabilire le concentrazioni da utilizzare. Se i risultati della citometria a flusso delle cellule esposte alla tossina testata sono gli stessi delle cellule esposte a un inibitore, allora la tossina sta causando un effetto simile e potrebbe inibire quel meccanismo endocitico. Se le risposte della tossina e dell'inibitore sono additive, ciò suggerisce che la tossina potrebbe inibire l'endocitosi con un meccanismo diverso rispetto all'inibitore.

I confronti vengono effettuati tra cellule non trattate e cellule trattate con la tossina in esame (Figura 2), cellule trattate con tossina o inibitore (Figura 3A) e cellule trattate con il solo inibitore (Figura 3B). I risultati rappresentativi mostrano che le cellule trattate con microcistina sono state inibite, in modo simile alle cellule trattate con CCD. Questi risultati dimostrano che la microcistina ha inibito l'assorbimento di liquidi mediante micropinocitosi. Le cellule gate vengono analizzate mediante ANOVA unidirezionale e i risultati devono essere riportati come il numero medio di cellule positive per FITC.

Figura 1: Grafico a dispersione rappresentativo della citometria a flusso dei leucociti isolati dal tessuto renale di zebrafish wild type basato sulle caratteristiche di forward scatter (FSC) e side scatter (SSC). Il gate dei fagociti comprende macrofagi/monociti e granulociti (23% delle cellule gate). Il cancello dei linfociti comprende linfociti, cellule B fagocitiche e cellule citotossiche aspecifiche (NCC) (26% delle cellule gate). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Intensità media di fluorescenza (MFI) delle cellule fagocitiche gate nella Figura 1 dopo l'esposizione alla tossina. La provetta (1) mostra le cellule non colorate mentre le cellule nella provetta (2) emettono fluorescenza attraverso l'assorbimento di LY. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Intensità media di fluorescenza (MFI) dei fagociti gatepati nella Figura 1. Captazione del giallo di Lucifero (LY) senza la presenza dell'inibitore della citocalasina D (CCD) (A); assorbimento di LY con presenza di CCD. La provetta (1) mostra le cellule non colorate mentre le cellule nella provetta (2) emettono fluorescenza attraverso l'assorbimento di LY. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Panoramica delle fasi del protocollo. *La durata e l'entità dell'esposizione dei pesci a una biotossina variano a seconda della biotossina specifica utilizzata e delle normative e dei protocolli di cura degli animali e di biosicurezza delle diverse istituzioni. **La concentrazione desiderata utilizzata e il tempo di esposizione utilizzato devono essere ottimizzati prima dell'esperimento e dipenderanno dalla tossina utilizzata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

L'utilizzo della citometria a flusso con leucociti zebrafish offre un approccio potente e versatile per studiare in dettaglio il sistema immunitario, valutare l'impatto delle tossine ambientali e facilitare la ricerca tossicologica. Fornisce un modo per valutare in modo rapido ed efficace l'impatto delle tossine sulle cellule immunitarie e sulla risposta immunitaria. I risultati rivelano i fattori umorali coinvolti e suggeriscono come la fisiologia e il metabolismo dei pesci interagiscono con le biotossine ambientali. La panoramica del protocollo è illustrata nella Figura 4.

Tuttavia, esistono limitazioni a questi metodi. La preparazione dei leucociti di zebrafish per la citometria a flusso può essere più complessa rispetto ad altri modelli. Le piccole dimensioni del pesce zebra possono limitare la quantità di sangue e il numero di leucociti disponibili per l'analisi ^9,10. Queste procedure richiedono la dissociazione dei tessuti per ottenere sospensioni di singole cellule e la vitalità cellulare può influire sull'accuratezza dei risultati. Rispetto a modelli come i topi, la gamma di strumenti immunologici disponibili, come gli anticorpi specifici per i marcatori cellulari del pesce zebra, è più limitata per il pesce zebra. Questa limitazione può limitare la profondità dell'analisi che può essere condotta sui leucociti del pesce zebra. Inoltre, l'interpretazione dei dati della citometria a flusso richiede esperienza, soprattutto quando si tratta di risposte immunitarie complesse. Un'interpretazione errata dei dati può portare a conclusioni errate, in particolare nel contesto degli impatti delle tossine ambientali.

I risultati di campioni cellulari senza inibitori aggiunti possono essere confrontati con campioni cellulari con gli inibitori. I risultati dei campioni cellulari con l'aggiunta della tossina devono essere confrontati con i campioni cellulari con gli inibitori. Se il riarrangiamento citoscheletrico è stato influenzato, l'assorbimento di LY sarà limitato. Se la tossina inibisce l'assorbimento di DX-40 o DX-70, le diverse dimensioni del particolato non saranno fagocitate. Se le cellule non assorbono il FITC-E. coli, la tossina ha inibito la fagocitosi.

In sintesi, il pesce zebra funge da modello eccellente per studiare gli effetti delle tossine ambientali sulle cellule immunitarie. Questo protocollo delinea un metodo che utilizza la citometria a flusso e i leucociti di zebrafish per lo screening delle biotossine, con particolare attenzione ai processi di endocitosi e fagocitosi¹¹. L'obiettivo di questo studio è accertare se l'esposizione alle tossine influisce sulla capacità dei leucociti fagocitici di assorbire i patogeni e discernere i potenziali impatti su specifici meccanismi endocitici.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10% siero fetale bovino	Gibco	A3160501
14 mL provette da centrifuga a fondo tondo	BD Biosciences	352059
40 &; Strain per cellule m	Corning	07-201-430
Provette per citometria a flusso da 5 mL	BD Biosciences	352235
Provetta per centrifuga conica da 50 mL	Corning	14-959-49A
Etanolo assoluto	Fisher	BP2818-500
Contatore di cellule automatizzato	Life Technologies Countess II FL		per lo studio della vitalità cellulare
Bovino albumina sierica (BSA)	Sigma	A3059
citocalasina D (CCD)	Sigma	C8273-5MG
destrano 40	Sigma	FD40-100MG
destrano 70	Sigma	46945-100MG-F
Escherichia coli DH5&alfa; (o altro ceppo batterico di laboratorio)	New England Biolabs	C29871
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma	ED4SS
Software per l'analisi	del flusso Software Novoacea Citometro
flusso	Novocyte 3000
Fluoresceina	Fluka BioChemica	46950
matasse soluzione salina bilanciata senza calcio o magnesio	Sigma	H4891
Histopaque 1077	Sigma	10771-100ML
Lucifero Giallo	Sigma	L0259-25MG
Mannan	Sigma	M7504-250MG
Soluzione salina tamponata con fosfato	Sigma	P3813
RPMI-1640 con GlutaMax	Gibco	61870036
Software statistico	SPSS
Tossina
Tricaina	Western Chemical Inc	NC0342409