Articolo metodologico

Un metodo di arricchimento per piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato

DOI:

10.3791/64499

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3 febbraio 2023

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1The First School of Clinical Medicine, Gannan Medical University, 2Laboratory Medicine, First Affiliated Hospital of Gannan Medical University

In questo articolo

Sommario

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Qui descriviamo l'arricchimento di piccole vescicole extracellulari derivate dal tessuto del cancro del fegato attraverso un metodo di ultracentrifugazione differenziale ottimizzato.

Abstract

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Piccole vescicole extracellulari (sEV) derivate dal tessuto possono riflettere lo stato funzionale delle cellule sorgente e le caratteristiche dello spazio interstiziale del tessuto. L'arricchimento efficiente di questi veicoli elettrici è un prerequisito importante per lo studio della loro funzione biologica e una chiave per lo sviluppo di tecniche di rilevamento clinico e tecnologia di supporto terapeutico. È difficile isolare i sEV dal tessuto perché di solito sono fortemente contaminati. Questo studio fornisce un metodo per il rapido arricchimento di sEV di alta qualità dal tessuto del cancro del fegato. Il metodo prevede un processo in quattro fasi: l'incubazione di enzimi digestivi (collagenasi D e DNasi Ι) con tessuto, filtrazione attraverso un filtro cellulare da 70 μm, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione attraverso un filtro a membrana da 0,22 μm. Grazie all'ottimizzazione della fase di ultracentrifugazione differenziale e all'aggiunta di una fase di filtrazione, la purezza dei sEV ottenuti con questo metodo è superiore a quella ottenuta dalla classica ultracentrifugazione differenziale. Fornisce un'importante metodologia e dati di supporto per lo studio dei sEV derivati dai tessuti.

Introduzione

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Le piccole vescicole extracellulari (sEV) hanno un diametro di circa 30-150 nm e sono secrete da varie cellule1. Possono comunicare con le cellule dei tessuti e regolare il microambiente locale o distante trasportando importanti molecole biologiche come lipidi, proteine, DNA e RNA a vari organi, tessuti, cellule e parti intracellulari. Pertanto, possono anche modificare il comportamento delle celle riceventi 2,3. L'isolamento e la purificazione di specifici sEV è un prerequisito essenziale per studiare il loro comportamento biologico durante lo sviluppo e il decorso della malattia. L'ul....

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Protocollo

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Il tessuto del cancro del fegato umano è stato raccolto da pazienti con diagnosi di malignità epatica presso il primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Tutti i pazienti hanno firmato un modulo di consenso informato e la raccolta di campioni di tessuto umano è stata approvata dal comitato etico del primo ospedale affiliato della Gannan Medical University. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione

  1. Posizionare lo shaker decolorante di trasferimento nell'incubatore e impo....

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Risultati

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Le sEV provenienti da tessuti di cancro del fegato umano hanno svolto un ruolo cruciale nella diagnosi, nel trattamento e nella prognosi dei pazienti con cancro al fegato. Questo metodo ha utilizzato strumenti di laboratorio comuni per isolare e purificare i sEV derivati dai tessuti del cancro del fegato; ciò può fornire un supporto metodologico per lo studio delle EV. La Figura 2 illustra il processo generale di arricchimento delle EV dai tessuti del cancro del fegato. Le sEV negli spazi in.......

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Discussione

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Questo protocollo descrive un metodo ripetibile per estrarre i sEV dal tessuto del cancro del fegato. I sEV di alta qualità sono ottenuti mediante isolamento dei tessuti acuti, trattamento con enzimi digestivi, ultracentrifugazione differenziale e filtrazione e purificazione della membrana filtrante da 0,22 μm. Per l'analisi a valle, è estremamente importante garantire l'elevata purezza dei sEV. Nel processo di centrifugazione differenziale, uno strato di sostanze bianche (composizione sconosciuta) apparirà sulla superfi.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il First Affiliated Hospital della Gannan Medical University per aver sostenuto questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (numero di sovvenzioni 82260422).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m Unità filtrante a membranaMillexSLGPR33RB
Siringa sterile da 1 mLHubei Xianming Medical Instrument CompanyYL01329
2% Acetato di uranile Microscopiaelettronica Sciences22400-2
Provetta da centrifuga da 4,7 mLBeckman Coulter361621
Piastra di cutura cellulare a 6 pozzettiLABSELECT11110
50 mL BecherTianjin Kangyiheng Strumento sperimentale Società di venditaCF2100800
70 &; m Filtro cellulareBiosharpBS-70-XBS
100 mm Piatto per coltura cellulareCELL TERCS016-0128
600 µ L Provetta da centrifugaAxygenMCT060C
Kit di quantificazione delle proteine BCAThermo FisherRJ240544
Beckman Coulter Optima-Max-TLBeckman A95761
BioRad Mini trans-blotBio-Rad1703930
BioRad Mini-ProteanBio-Rad1645050
CD63 AnticorpoAbcamab134045
CD9 AnticorpoAbcamab263019
Centrifuga 5430REppendorf5428HQ527333
Soluzione detergenteNanoFCMC1801
Collagenasi DRoche11088866001
Rete di rameHenan Zhongjingkeyi Technology CompanyDJZCM-15-N1
Termostato a seccoHangzhou allsheng instruments companyAS-01030-00
FITC Anti umano CD9 AnticorpoElabscienceE-AB-F1086C
GlicinaSolarbioG8200
Anticorpo secondario anti-topo accoppiato alla perossidasi di rafano di capra (HRP) ProteintechSA00001-1
Anticorpo secondario anti-coniglio accoppiato alla perossidasi di rafano di capra (HRP) ProteintechSA00001-2
MetanoloShanghai Zhenxing Chemical Company
Citometro a flusso di nanoparticelleNanoFCM INCFNAN30E20112368
Inibitori della fosfatasi (PhosSTOP)Soluzione
PBS)ServicebioG4202
Membrana in polivinilidene difluoruroSolarbioISEQ00010
QC BeadsNanoFCMQS2502
RPMI-1640 mezzo di baseIndustrie Biologiche 
bisturiGuangzhou Kehua Trading CompanyNN-0623-1
nanosfere di siliceNanoFCMS16M-EXO
Agitatore di decolorazione per trasferimento TS-8Kylin-BellE0018
Microscopio elettronico a trasmissioneThermo ScientificTalos L120C
TrisSolarbioT8060
TSG101 AnticorpoProteintech28283-1-AP
PinzettaGuangzhou Lige Technology CompanyLG01-105-4X
salina tamponata con fosfato Roche 4906845001 (C11875500BT

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
  2. Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods ....

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Arricchimento di vescicoleultracentrifugazione differenzialefiltrazione di membranadigestione enzimaticacitometria a flussomicroscopia elettronica a trasmissionemarcatori proteiciWestern blot

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