L'attuale protocollo consente una somministrazione efficiente e stabile di microsfere fluorescenti (MS) e punti quantici (QD) nel miocardio di pesci vivi che possono essere tracciati (tracciati) nel tempo.
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Articolo metodologico
Iniezione intramiocardica per lo studio della funzione linfatica cardiaca nel pesce zebra
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pesce zebra ha dimostrato di essere un modello importante per lo studio della formazione e della funzione cardiovascolare durante lo sviluppo e la rigenerazione postembrionale. Il presente protocollo descrive un metodo per iniettare traccianti fluorescenti nel miocardio del pesce zebra per studiare l'assorbimento del liquido interstiziale e dei detriti nei vasi linfatici cardiaci. A tal fine, microsfere (200 nm di diametro) e punti quantici (<10 nm di diametro) vengono introdotti nel miocardio di zebrafish vivo, che possono essere tracciati utilizzando la microscopia confocale ex vivo . Questi traccianti vengono quindi tracciati in modo intermittente per diverse ore per seguire la clearance dal miocardio nei vasi linfatici cardiaci. I punti quantici vengono trasportati attraverso i vasi linfatici cardiaci lontano dal cuore, mentre le microsfere più grandi rimangono nel sito di iniezione per oltre tre settimane. Questo metodo di iniezione intramiocardica può essere esteso ad altri usi, tra cui l'iniezione di MS incapsulato o idrogel per rilasciare localmente cellule, proteine o composti di interesse in una regione mirata del cuore.
Introduzione
Il sistema linfatico è essenziale per il mantenimento dell'equilibrio tissutale-fluido, la modulazione della risposta immunitaria a seguito di lesioni e l'assorbimento dei lipidi nell'intestino1. L'accumulo di prove supporta l'ampio ruolo del sistema linfatico in vari contesti di malattia e sviluppo. Tuttavia, gli studi meccanicistici sono ostacolati perché i vasi linfatici possono essere difficili da visualizzare e la loro funzionalità può essere incerta. Le prime tecniche di imaging si basavano sulla capacità naturale del sistema linfatico di assorbire interstizialmente i traccianti iniettati e quindi di tras....
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Protocollo
Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali presso Weill Cornell Medicine (protocollo 2020-0027) e hanno seguito le linee guida adeguate. I seguenti esperimenti sono stati eseguiti con maschi e femmine di zebrafish AB wild-type di età compresa tra 14 e 20 mesi dopo la fecondazione per gli adulti e 35 giorni dopo la fecondazione per i giovani.
1. Estrazione dell'ago e preparazione del reagente
- Estrarre un capillare in vetro borosilicato standard con diametro esterno di 1,2 mm (diametro esterno) utilizzando u....
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Risultati
Immediatamente dopo l'iniezione, deve essere visibile una piccola regione bianca della parete miocardica (Figura 3F). Questa regione mostrerà una marcatura fluorescente brillante della MS e della QD iniettate (Figura 4B, E). Inoltre, dopo la procedura possono essere presenti punti di fluorescenza deboli e sporadici sulla superficie esterna del cuore da qualsiasi QD e MS nello spazio pericardico (Figura 4B, E.......
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Discussione
Il presente articolo ha descritto un metodo per introdurre materiale esogeno nel miocardio del pesce zebra. Questa tecnica è stata sviluppata per introdurre QD e SM nel miocardio per studiare la funzione linfatica nell'omeostasi e nella rigenerazione 2,18. Un approccio simile è stato utilizzato anche per introdurre la QD nel miocardio dei topi per studiare la presenza e la funzione dei linfatici dopo infarto del miocardio
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Adedeji Afolalu, Chaim Shapiro, Soji Hosten e Chelsea Quaies per la cura dei pesci (Weill Cornell Medicine), Caroline Pearson (Weill Cornell Medicine) per la lettura critica del manoscritto. Jingli Cao (Weill Cornell Medicine) per l'uso del cannocchiale di dissezione e della telecamera per registrare la procedura oltre alla lettura critica del manoscritto. Nathan Lawson (University of Massachusetts Medical School), Brant Weinstein (NICHD), Elke Ober (University of Copenhagen) e Stephan Schulte-Merker (WWU Münster) per le linee di zebrafish transgeniche. Daniel Castranova (NICHD) per consigli su QD e imaging e Yu Xia (Weill....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto di cristallizzazione | VWR | 89000-288 | |
| Cannocchiale di dissezione | Zeiss | 495010-0007-000 | |
| Acqua per impianti ittici | N/A | N/A | Acqua RO con sale marino e bicarbonato di sodio aggiunti a una conduttività di 226uS e pH di 7,35 |
| Pinze | Dumont | 11252-20 | |
| Capillari in vetro | WPI | 1B120-3 | senza filamento |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Forbici per iridectomia | Fine Scientific Tools | 15000-00 | |
| Microiniettore | Warner Instruments | 64-1735 | |
| Microloader femtotips | Eppendorf | 5242 956.003 | |
| Estrattore per micropipette | Sutter Instrument | P-97 | Ingresso pedale gated |
| Microsfere | Thermo Fisher Scientific | B200 | Blu |
| PBS | Corning | 46-013-CM | |
| Punti quantici (QD) | Thermo Fisher Scientific | Q21061MP | Qtracker705 etichetta vascolare |
| Spugna | qualsiasi | ( | 1,5 & volte; 5 & volte; 3 cm) con scanalatura (0,5 & volte; 2,5 cm) |
| Filtro per siringa | Corning | 431220 | |
| Tricaina | Sigma-Aldrich | A5040 | concentrazione: 4 mg/mL |
Riferimenti
- Munn, L. L., Padera, T. P. Imaging the lymphatic system. Microvascular Research. 0, 55(2014).
- Harrison, M. R., et al. Late developing cardiac lymphatic vasculature supports adult zebrafish heart function and regeneration. eLife. 8, 42762(2019).<....
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Ristampe e permessi
