Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Sommario

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Abstract

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR) rappresentano la più grande superfamiglia di recettori e sono i bersagli di numerosi farmaci umani. Lo screening ad alta produttività (HTS) di librerie casuali di piccole molecole rispetto ai GPCR viene utilizzato dall'industria farmaceutica per la scoperta di farmaci specifici per bersaglio. In questo studio, un HTS è stato impiegato per identificare nuovi ligandi a piccole molecole di neuropeptidi GPCR specifici per invertebrati come sonde per studi fisiologici di vettori di patogeni umani e veterinari mortali.

Il recettore della chinina specifico per gli invertebrati è stato scelto come bersaglio perché regola molti importanti processi fisiologici negli invertebrati, tra cui la diuresi, l'alimentazione e la digestione. Inoltre, la farmacologia di molti GPCR invertebrati è scarsamente caratterizzata o non caratterizzata affatto; pertanto, la farmacologia differenziale di questi gruppi di recettori rispetto ai GPCR correlati in altri metazoi, in particolare nell'uomo, aggiunge conoscenza alle relazioni struttura-attività dei GPCR come superfamiglia. È stato sviluppato un test HTS per cellule in piastre a 384 pozzetti per la scoperta di ligandi del recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, o zecca bovina meridionale, Rhipicephalus microplus. Il recettore della zecca chinina era stabilmente espresso nelle cellule CHO-K1.

Il recettore della chinina, quando attivato da neuropeptidi endogeni della chinina o da altri agonisti di piccole molecole, innesca il rilascio di Ca²⁺ dalle riserve di calcio nel citoplasma. Questo saggio di fluorescenza del calcio combinato con un approccio di "doppia addizione" può rilevare molecole "hit" funzionali agoniste e antagoniste nella stessa piastra di analisi. Ogni test è stato condotto utilizzando piastre di farmaci contenenti una serie di 320 piccole molecole casuali. È stato ottenuto un fattore Z' affidabile di 0,7 e sono state identificate tre molecole colpite agonista e due antagoniste quando l'HTS era ad una concentrazione finale di 2 μM. Il saggio di fluorescenza del calcio qui riportato può essere adattato per lo screening di altri GPCR che attivano la cascata di segnalazione Ca²⁺ .

Introduzione

I recettori accoppiati a proteine G (GPCR), che sono presenti dal lievito all'uomo, rappresentano la più grande superfamiglia di recettori in molti organismi¹. Svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione di quasi tutti i processi biologici negli animali. Ci sono 50-200 GPCR nel genoma degli artropodi, il che significa che rappresentano la più grande superfamiglia di recettori di membrana². Sono classificati in sei classi principali, A-F, in base alla loro somiglianza di sequenza e alle funzioni³. I GPCR trasducono vari segnali extracellulari, come quelli di ormoni, neuropeptidi, ammine biogen....

Protocollo

1. Manutenzione delle celle

NOTA: UNA LINEA CELLULARE CHO-K1 che esprime stabilmente il recettore della chinina da R. microplus, chiamata BMLK₃, è stata sviluppata da Holmes et al.16. I dettagli dello sviluppo della linea cellulare sono presentati altrove¹⁴. Tutte le seguenti fasi vengono eseguite in condizioni sterili in un armadio di biosicurezza di classe II.

1. Far crescere la linea cellulare ricombinante in mezzi selettivi (terreno F-12K contenente il 10% di siero bovino fetale [FBS] e 800 μg/mL di solfato G418) per garantire l'espressione del r....

Risultati

Una piastra di farmaco interna (SAC2-34-6170) composta da 320 piccole molecole casuali è stata utilizzata per dimostrare questo test HTS come esempio. L'HTS aveva un'eccellente qualità del saggio con un fattore Z' di 0,7 (Tabella 1). Questo fattore Z' riflette la qualità del saggio indipendente dai composti testati³⁴. Un fattore Z′ pari o superiore a 0,5 indica un buon intervallo dinamico del segnale di analisi tra le RFU dei controlli positivi e dei controll.......

Discussione

L'obiettivo di HTS è identificare le molecole colpite attraverso lo screening di un numero enorme di piccole molecole. Pertanto, i risultati di questo esempio rappresentano solo una piccola parte di un esperimento HTS convenzionale. Inoltre, le molecole hit identificate devono essere convalidate in saggi a valle, come un saggio dose-dipendente sulla stessa linea cellulare ricombinante e su una linea cellulare CHO-K1 che trasporta solo il vettore vuoto, che può essere eseguito simultaneamente per salvare piccole molecole........

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,25% tripsina-EDTA	Gibco Invitrogen	15050-065	con rosso fenolo
0,4% blu di tripano	MilliporeSigma	T8154	liquido, sterile
1,5 mL provette per microcentrifuga	Thermo Fisher	AM12400	senza RNasi Pipetta
sierologica da 5 mL	Corning	29443-045	Corning Costar Stripette confezionato singolarmente
Pipetta sierologica da 10 ml	Corning	29443-047	Corning Costar Stripette confezionata singolarmente
Provette coniche da 15 mL	Falcon	352196	sterili
20 & micro; L punte filtranti	USA Scientifc Inc.	P1121	sierologica sterile con barriera
da 25 mL	Corning	29443-049	Corning Costar Stripette confezionato singolarmente
Provette coniche da 50 mL	Corning	430828	graduate, sterili
150 mL riservatore auto-friendly	Integra Bioscience	6317	sterile, confezionato singolarmente per la semina cellulare nel giorno 1
150 mL reseror auto-friendly	Integra Bioscience	6318	sterile, impilato, per il caricamento del colorante nel giorno 2
384/ 12,5 &; L puntali a bassa ritenzione	Integra Bioscience	6405	filtro lungo sterile
384/ 12,5 &; Punte a L	Integra Bioscience	6404	filtro lungo sterile
384 pozzetti	Greiner	781091	CELLSTAR, polistirene trasparente, &; Guarnizioni per piastre in alluminio trasparente, nero/piatto
	Axygen Scientific	PCR-AS-200
Involucro in foglio di alluminio	Walmart
Armadio Biosafty II	NuAire	NU-540-300
Contatore di celle	Nexcelom	AutoT4
vetrini per conteggio cellule	Nexcelom	SD-100	20 e micro; Camera a L
CO2 incubatore umidificato	Thermo Fisher	Forma Serie II
Lampada da tavolo	SunvaleeyTEK	RS1000B
Dimetil solfossido	MilliporeSigma	276855	anido, >99,9%
Piastra per farmaci	Corning	3680
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Corning	21-031- CV	DPBS, 1x senza calcio e magnesio
Etanolo	Koptec	2000
F-12K Miscela di nutrienti	Corning	45000-354	(Kaighn's Mod.) con L-glutammina
Siero fetale bovino	Equitech-Bio	SFBU30
Kit per il dosaggio del calcio fluorescente	ENZO Lifescience	ENZ-51017	10x96 test
G418 solfato	Gibco Invitrogen	10131-027	Antibiotico selettivo Geneticin 50 mg/mL
tampone di Hank	MilliporeSigma	55037C	HBSS modificato, con calcio, con magnesio, senza fenolo leggere
tampone HEPES	Gibco Invitrogen	15630-080	1 Molar
HTS data storage	plateform CDD vault		https://www.collaborativedrug.com/
Sistema di manipolazione di liquidi	Integra Bioscience	Viaflo	384/12.5 µ L
Centrifuga a piastre	Thermo Fisher	Sorvall ST8
Lettore di piastre	Tecnologia BMG	Clariostar
Poly-D-lisina	MilliporeSigma	P6407
Rhimi-K-1 peptide agonista	Genscript	ordine personalizzato	QFSPWGamide
T-75 pallone	Falcon	353136

pipetta piastra a a base di poliestere