Generazione di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo sane e specifiche per malattie retiniche

Sudipta Mahato; Trupti Agrawal; Divya Pidishetty; Savitri Maddileti; Vinay Kumar Pulimamidi; Indumathi Mariappan

doi:10.3791/64509

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Articolo metodologico

Generazione di organoidi retinici da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo sane e specifiche per malattie retiniche

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DOI:

10.3791/64509

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9 dicembre 2022

Sudipta Mahato^*¹^,² , Trupti Agrawal^*¹^,² , Divya Pidishetty^*¹^,² , Savitri Maddileti¹ , Vinay Kumar Pulimamidi¹^,³ , Indumathi Mariappan¹

¹Centre for Ocular Regeneration, Prof. Brien Holden Eye Research Centre, LV Prasad Eye Institute, ²Manipal Academy of Higher Education, ³Schepens Eye Research Institute, Massachusetts Eye and Ear, Harvard Medical School

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive un metodo efficiente per differenziare le hiPSC in cluster di campi oculari e generare organoidi neuro-retinici utilizzando condizioni di coltura semplificate che coinvolgono sia sistemi di coltura aderenti che in sospensione. Altri tipi di cellule oculari, come l'RPE e l'epitelio corneale, possono anche essere isolati dai campi oculari maturi nelle colture retiniche.

Abstract

Le cellule staminali pluripotenti possono generare organoidi tissutali complessi che sono utili per studi di modellizzazione di malattie in vitro e per lo sviluppo di terapie rigenerative. Questo protocollo descrive un metodo più semplice, robusto e graduale per generare organoidi retinici in un sistema di coltura ibrido costituito da colture monostrato aderenti durante le prime 4 settimane di differenziazione retinica fino alla comparsa di cluster primordiali del campo oculare distinti e auto-organizzati (EFP). Inoltre, le isole neuroretiniche a forma di ciambella, circolari e traslucide all'interno di ciascun EFP vengono raccolte manualmente e coltivate sotto sospensione utilizzando piatti di coltura non aderenti in un mezzo di differenziazione retinica per 1-2 settimane per generare coppette ottiche 3D multistrato (OC-1M). Questi organoidi retinici immaturi contengono PAX6+ e ChX10⁺ proliferanti, precursori retinici multipotenti. Le cellule precursori sono linearmente auto-assemblate all'interno degli organoidi e appaiono come striature radiali distinte. A 4 settimane dalla coltura in sospensione, i progenitori retinici subiscono l'arresto post-mitotico e la differenziazione del lignaggio per formare organoidi retinici maturi (OC-2M). I precursori impegnati nella linea fotorecettoriale si sviluppano all'interno degli strati più esterni degli organoidi retinici. Queste cellule fotorecettrici CRX+ e RCVRN⁺ maturano morfologicamente per mostrare estensioni simili a segmenti interni. Questo metodo può essere adottato per generare organoidi retinici utilizzando cellule staminali embrionali umane (hESC) e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Tutti i passaggi e le procedure sono chiaramente spiegati e dimostrati per garantire la replicabilità e per applicazioni più ampie nella scienza di base e nella ricerca traslazionale.

Introduzione

La retina è un tessuto sensibile alla luce presente nella parte posteriore dell'occhio vertebrato che converte i segnali luminosi in impulsi nervosi da un fenomeno biochimico noto come via di foto-trasduzione. Gli impulsi nervosi iniziali generati nelle cellule fotorecettrici della retina vengono trasdotti ad altri interneuroni retinici e cellule gangliari retiniche (RGC) e raggiungono la corteccia visiva del cervello, che aiuta nella percezione dell'immagine e nella risposta visiva.

Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), circa 1,5 milioni di bambini sono ciechi, di cui 1 milione in Asia. La distrofia retinica ereditaria (IRD....