Il presente lavoro descrive un nuovo protocollo sperimentale che utilizza un supporto stampato in 3D per consentire l'imaging di cellule vive ad alta risoluzione di globi enucleati. Attraverso questo protocollo, l'attività di segnalazione del calcio cellulare nell'epitelio corneale ferito da globi ex vivo può essere osservata in tempo reale.
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Articolo metodologico
Imaging di cellule vive di globi ex vivo intatti utilizzando un nuovo supporto stampato in 3D
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La guarigione della ferita epiteliale corneale è un processo migratorio avviato dall'attivazione dei recettori purinergici espressi sulle cellule epiteliali. Questa attivazione si traduce in eventi di mobilizzazione del calcio che si propagano da cellula a cellula, che sono essenziali per iniziare la motilità cellulare nel letto della ferita, promuovendo un'efficiente guarigione della ferita. Il laboratorio Trinkaus-Randall ha sviluppato una metodologia per l'imaging della risposta di guarigione delle ferite corneali in globi murini ex vivo in tempo reale. Questo approccio prevede l'enucleazione di un globo intatto da un topo che è stato eutanasia secondo protocolli stabiliti e l'incubazione immediata del globo con un colorante indicatore di calcio. Una contromacchia che colora altre caratteristiche della cellula può essere applicata in questa fase per aiutare con l'imaging e mostrare punti di riferimento cellulari. Il protocollo ha funzionato bene con diversi coloranti di cellule vive utilizzati per la controcolorazione, tra cui l'actina SiR per colorare l'actina e la colorazione della membrana plasmatica rosso intenso per colorare la membrana cellulare. Per esaminare la risposta a una ferita, l'epitelio corneale viene ferito utilizzando un ago da 25 G e i globi vengono posizionati in un supporto stampato in 3D. Le dimensioni del supporto stampato in 3D sono calibrate per garantire l'immobilizzazione del globo per tutta la durata dell'esperimento e possono essere modificate per ospitare occhi di diverse dimensioni. L'imaging cellulare vivo della risposta della ferita viene eseguito continuamente a varie profondità in tutto il tessuto nel tempo utilizzando la microscopia confocale. Questo protocollo ci consente di generare immagini ad alta risoluzione e di qualità pubblicativa utilizzando un obiettivo aereo 20x su un microscopio confocale. Altri obiettivi possono essere utilizzati anche per questo protocollo. Rappresenta un miglioramento significativo nella qualità dell'imaging di cellule vive in globi murini ex vivo e consente l'identificazione di nervi ed epitelio.
Introduzione
Cornea
La cornea è una struttura avascolare chiara che copre la superficie anteriore dell'occhio che rifrange la luce per consentire la visione e protegge l'interno dell'occhio dai danni. Poiché la cornea è esposta all'ambiente, è suscettibile di danni sia da cause meccaniche (graffi) che da infezioni. Una lesione corneale in un paziente altrimenti sano guarisce in genere entro 1-3 giorni. Tuttavia, nei pazienti con condizioni di base tra cui deficit di cellule staminali limbari e diabete di tipo II, il processo di guarigione della ferita corneale può essere notevolmente prolungato1. Poiché la cornea è altamente innervata, q....
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Protocollo
Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia per l'uso di animali nella cura oftalmica e nella ricerca sulla visione e dal protocollo IACUC dell'Università di Boston (201800302).
1. Progettazione dei supporti stampati in 3D e della barra di copertura
- Progetta i supporti stampati in 3D e la barra di copertura tenendo conto del diametro medio dei globi del mouse e stampa in 3D il design (Figura 1A, B).
- Mantenere il diametro della parete interna del supporto leggermente più grande ....
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Risultati
Questo protocollo è stato utilizzato per produrre costantemente dati e immagini di qualità di pubblicazione10. Le immagini ottenute rappresentano un miglioramento significativo rispetto agli approcci precedenti (Figura 2). Utilizzando il supporto stampato in 3D, le immagini possono essere catturate attraverso gli strati della cornea e si può osservare la mobilizzazione del calcio in diversi piani z (Figura 3). Questo approccio è stato uti.......
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Discussione
Questo protocollo descrive una tecnica di imaging cellulare vivo che utilizza un supporto stampato in 3D per stabilizzare e immobilizzare gli occhi degli animali intatti. È progettato per aggirare diversi svantaggi significativi riconosciuti con precedenti protocolli di imaging di cellule vive del tessuto corneale ex vivo . Questo protocollo offre molti vantaggi per l'imaging di cellule vive di globi intatti. Riduce significativamente i danni tissutali non necessari che potrebbero interferire con la risposta di .......
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Dichiarazioni
Non abbiamo conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Vorremmo riconoscere il NIH per il seguente sostegno di sovvenzione: RO1EY032079 (VTR), R21EY029097-01 (VTR), 1F30EY033647-01 (KS) e 5T32GM008541-24 (KS). Vorremmo anche riconoscere il Massachusetts Lions Eye Research Fund e il New England Corneal Transplant Fund.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,75 plastica blu di acido polilattico (PLA) | Creality (Shenzen, Cina) | N/A | Materiale per supporto |
| Piatto da 35 mm, n. 1,5 Vetrino coprioggetti, diametro del vetro 14 mm, rivestimento in poli-D-lisina MatTek | Corporation (Ashland, MA) | P35GC-1,5-14-C | Pozzetto per l'imaging. |
| Autodesk Fusion 360 software | Autodesk (San Rafael, CA). | N/A | Software utilizzato per la stampa dei supporti. |
| BD 25 G 7/8 aghi sterili monouso 100 aghi/scatola | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA) | 305124 | Per ferite ai globi indotte sperimentalmente |
| CellMask DeepRed | Invitrogen (Carlsbad, CA) | C10046 | Controcolorazione della membrana cellulare. Indicatore di calcio. Concentrazione 1:10.000 con una concentrazione finale di 1% (v/v) DMSO e 0,1% (p/v) di acido pluronico |
| Complete Home Super Glue | Walgreens (Deerfield, IL) | N/A | Per il fissaggio del supporto al pozzetto di imaging |
| Stampante 3D Ender 3 Pro | Creality (Shenzen, Cina) | N/A | Per la stampa del supporto |
| FIJI/ImageJ ImageJ | (Bethesda, MD) | Numero di licenza: GPL2 | Software utilizzato per confermare la coerenza della profondità e del diametro della ferita tra globi indipendenti utilizzando l'analisi della regione di interesse |
| Fluo-4 | Invitrogen (Carlsbad, CA) | F14201 | Indicatore di calcio. Concentrazione 1:100 con una concentrazione finale di 1% (v/v) DMSO e 0,1% (p/v) di acido pluronico |
| Gibco medio privo di siero per cheratinociti | (Waltham, MA) | 17005042 | 25 mg/mL di estratto ipofisario bovino, 0,02 nM EGF, 0,3 mM CaCl2 e penicillina-streptomicina (100 unità/mL, 100 µ g/mL, rispettivamente) aggiunto al mezzo |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Corning, Medlabtech (Manassas, VA) | 21-040-CV | Utilizzato per lavare via la macchia in eccesso dalle cornee prima dell'imaging |
| Microscopio confocale Zeiss 880 con AiryScan | Zeiss (Thornwood, NY) | N/A È | stato utilizzato un obiettivo con ingrandimento 20x |
Riferimenti
- Kneer, K., et al. High fat diet induces pre-type 2 diabetes with regional changes in corneal sensory nerves and altered P2X7 expression and localization. Experimental Eye Research. 175, 44-55 (2018).
- Lee, Y., et al.
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Ristampe e permessi
