Isolamento di goccioline lipidiche plastoglobule dal tessuto fogliare vegetale e cianobatteri

L'attuale comprensione della composizione e della funzione dei plastoglobuli è emersa attraverso studi proteomici e lipidomici dettagliati 1,2,3,4,5. Tali studi sono stati notevolmente aiutati da un metodo rapido ed efficace di isolamento che si basa sulla loro bassissima densità per una separazione efficiente utilizzando gradienti di saccarosio. I metodi iniziali di isolamento dei plastoglobuli sono stati ottenuti da specie come il faggio (Fagus sylvatica), la ginestra scozzese (Sarothamnus scoparius), la cipolla (Allium cepa), gli spinaci (Spinacia oleracea), la viola del pensiero (Viola tricolor), il pepe (Capsicum annuum) e il pisello (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,^12,13. Un metodo aggiornato per isolare i plastoglobuli cloroplasti in modo più efficiente e con un rendimento migliore è stato successivamente presentato da Ytterberg et ^al.3,14. Mentre inizialmente impiegato per lo studio dei plastoglobuli dei cloroplasti fogliari di Arabidopsis thaliana, abbiamo impiegato con successo questo metodo aggiornato per il tessuto fogliare sano di altre specie vegetali, sia monocotiledoni che dicotiledoni, tra cui mais (Zea mays), pomodoro (Solanum lycopersicum), erba d'amore (Eragrostis nindensis), falso bromo viola (Brachypodium distachyon) e tabacco selvatico (Nicotiana benthamiana) ; risultati non pubblicati). Inoltre, il metodo di isolamento è stato adattato con successo ai plastoglobuli dei cianobatteri, tra cui Synechocystis sp. PCC 6803 e Anabaena sp. PCC 7120¹⁵, e al tessuto fogliare essiccato della pianta di resurrezione, E. nindensis.

I plastoglobuli cloroplasti del tessuto fogliare sano sono fisicamente collegati alle membrane tilacoidi¹⁶. Nonostante questa continuità fisica, i due sottocompartimenti cloroplasti mantengono composizioni lipidiche e proteiche distinte, sebbene sia stato proposto lo scambio regolato di lipidi e proteine tra i due compartimenti 2,4,17,18,19. Infatti, è stato recentemente proposto un interessante modello di emifusione per il traffico di lipidi neutri tra cloroplasti e citosol¹⁹. A causa della continuità fisica dei plastoglobuli e dei tilacoidi, il metodo di isolamento con tessuto fogliare sano inizia con la raccolta di un preparato di tilacoidi grezzi pellettati, che viene successivamente sonicato per separare i plastoglobuli dai tilacoidi, che è in contrasto con i metodi utilizzati per isolare le goccioline lipidiche citosoliche²⁰ . L'ultracentrifugazione su un cuscino di saccarosio fa quindi galleggiare i plastoglobuli a bassa densità attraverso il saccarosio, separandoli efficacemente dai tilacoidi, dai nuclei e da altro materiale ad alta densità. Al contrario, i plastoglobuli nei cianobatteri, così come quelli del tessuto fogliare essiccato, esistono evidentemente in vivo in una forma fluttuante. Quindi, il loro isolamento comporta direttamente il galleggiamento su un gradiente di saccarosio. Questo articolo dimostra il metodo di isolamento dal tessuto fogliare sano e dimostra ulteriormente due varianti che possono essere utilizzate per isolare plastoglobuli da tessuto fogliare essiccato o colture cianobatteriche, espandendo notevolmente l'ampiezza fisiologica e il contesto evolutivo in cui i plastoglobuli possono essere studiati.

I plastoglobuli isolati possono successivamente essere utilizzati per qualsiasi numero di analisi a valle per studiare le caratteristiche molecolari. Abbiamo utilizzato i plastoglobuli isolati dal tessuto fogliare di A. thaliana per estese analisi proteomiche e lipidomiche in diverse condizioni ambientali o genotipi, dimostrando la modificazione selettiva della composizione proteica e lipidica in adattamento allo stress 2,4,21,22. Inoltre, sono stati eseguiti saggi chinasici in vitro che dimostrano attività di trans-fosforilazione associata a plastoglobuli isolati 22, gli stati oligomerici dei componenti proteici sono stati studiati utilizzando l'elettroforesi su gel nativa ²¹ e sono stati eseguiti saggi di rasatura della proteasi²³.

Il vantaggio principale di questo metodo è la velocità relativa della procedura. Nella nostra esperienza, i protocolli descritti di seguito possono essere completati completamente entro circa 4 ore. È stato descritto un metodo alternativo per isolare i plastoglobuli dal tessuto fogliare, che consente l'isolamento simultaneo di altri sottocompartimenti del cloroplasto²⁴. Questo metodo alternativo offre alcuni chiari vantaggi quando è necessario o desiderato un confronto quantitativo con gli altri sottocompartimenti del cloroplasto. Tuttavia, questo metodo alternativo è anche più noioso e fornirà una resa significativamente inferiore di plastoglobuli isolati da quantità comparabili di tessuto fogliare. Quando l'obiettivo è uno studio mirato dei plastoglobuli, la metodologia qui delineata è la scelta ottimale. Tuttavia, durante la preparazione del campione è possibile raccogliere aliquote totali di foglie e tilacoidi grezzi ed è altamente raccomandato di farlo, per avere campioni di riferimento per il successivo confronto.

1. Isolamento dei plastoglobuli grezzi

1. Estrazione di plastoglobuli grezzi da tessuto fogliare di mais non stressato
   1. Acquisire sei piantine di mais sane di circa 3 settimane e quasi nella fase di crescita V5, del peso di circa 120 g.
   2. Ritagliare tutte le foglie alla base del gambo, immergerle rapidamente in un bagno di ghiaccio e trasportarle nella cella frigorifera.
   3. Lavorando sotto una lampada di sicurezza verde, rimuovere le foglie di mais dal bagno di ghiaccio e tagliarle in pezzi più piccoli (circa 5 cm x 5 cm) usando le forbici.
   4. Macinare delicatamente ma accuratamente metà del tessuto fogliare tagliato in un frullatore commerciale in 350 ml di tampone di macinazione (Tabella 1). Avvia-arresta il frullatore 5x-6x per assicurarti che tutte le foglie siano tagliate. Non usare più alto del livello 7 sul frullatore.
   5. Filtrare l'omogenato attraverso uno strato di panno di nylon da 25 μm su un grande imbuto in quattro bottiglie di centrifuga da 250 ml. Quindi, ripetere il passaggio 1.1.4 con la seconda metà del tessuto fogliare tagliato.
   6. Dividere uniformemente il filtrato tra le quattro bottiglie e centrifugare per 6 minuti a 1.840 x g a 4 °C. Prelevare un'aliquota del filtrato fogliare e metterla da parte prima della centrifugazione per conservarla come campione rappresentativo totale di foglie.
   7. Versare il surnatante risultante e risospendere delicatamente il pellet in 12 ml di R 0,2 medio contenente 0,2 M di saccarosio (Tabella 1) ruotando e risospendendo con delicati movimenti del pennello. Dopo aver risospeso ogni pellet, portare la sospensione sulla bottiglia successiva e ripetere la risospensione. Raggruppa le sospensioni in un unico flacone.
   8. Distribuire la sospensione aggregata tra sei provette da ultracentrifuga da 3 ml, raggiungendo un volume massimo di 2,5 ml in ciascuna provetta.
   9. Sonicare ogni tubo 4x, per 10 s ogni volta, utilizzando un sonicatore di punta ad un'ampiezza del 100%. Fare attenzione a tenere il corno del sonicatore immerso e lontano dalla superficie del liquido per evitare schiuma.
   10. Muovi lentamente il corno del sonicatore su e giù all'interno della sospensione durante ogni round. Alternare tra i quattro tubi, restituendo ogni tubo a un secchiello del ghiaccio dopo ogni sonicazione per consentire al campione di raffreddarsi.
   11. Centrifugare la sospensione di tilacoide grezzo sonicata a 150.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Raccogliere il tampone galleggiante risultante di plastoglobuli grezzi dalla superficie del cuscino di saccarosio (facilmente visibile come un tampone giallo oleoso) usando una siringa e un ago da 22 G sfiorando la superficie del cuscino con l'apertura dell'ago, recuperando circa 500 μL da ciascun tubo. Depositare in un tubo da 2,0 ml.
   12. Raccogliere aliquote del tilacoide grezzo prima e dopo la sonicazione e il rilascio di plastoglobuli. Continuare con il passaggio 2.1. In alternativa, conservare i plastoglobuli grezzi a -80 °C e purificarli in un secondo momento.
2. Estrazione di plastoglobuli grezzi da tessuto fogliare essiccato di E. nindensis
   1. Acquisire un vaso (composto da tre singole piante per vaso) di E. nindensis completamente essiccato, di 8-9 settimane (quasi 40 g di tessuto).
   2. Ritagliare tutto il tessuto fogliare dalla base della pianta, appena sopra il terreno, usando le forbici e immergere immediatamente il tessuto in un bagno di ghiaccio. Trasportare il tessuto nella cella frigorifera.
   3. Lavorando sotto una lampada di sicurezza verde, tagliare la E. Nindensis lascia in pezzi più piccoli (circa 5 cm x 5 cm) usando le forbici.
   4. Macinare delicatamente ma accuratamente le foglie con 100 ml di tampone di macinazione (Tabella 1) in un frullatore commerciale. Avviare il frullatore più volte per assicurarsi che tutte le foglie vengano tagliate. Non usare più alto del livello 7 sul frullatore.
   5. Filtrare l'omogenato attraverso uno strato di panno di nylon da 25 μm su un grande imbuto in un matraccio conico da 250 ml. Prelevare un'aliquota del filtrato fogliare e metterla da parte prima della centrifugazione per conservarla come campione rappresentativo totale di foglie.
   6. Aggiungere la quantità appropriata di saccarosio per portare ad una concentrazione finale di 0,5 M e distribuire la soluzione in provette da centrifuga da 250 ml.
      NOTA: Una concentrazione più elevata di saccarosio rispetto al preparato di Z. mays viene utilizzata per garantire la flottazione delle goccioline lipidiche citosoliche prima della successiva sonicazione / rilascio dei plastoglobuli legati ai tilakoid.
   7. Centrifugare i tubi a 45.000 x g per 30 minuti a 4 °C. Una miscela di plastoglobuli e goccioline lipidiche citosoliche sarà facilmente vista come un cuscinetto giallo oleoso sopra o vicino alla superficie del cuscino di saccarosio (Figura 1B). Raccogliere il materiale galleggiante usando una siringa con un ago da 22 G sfiorando la superficie del cuscino con l'apertura dell'ago e depositarlo in un tubo.
   8. Eliminare il surnatante rimanente dopo aver raccolto la miscela di plastoglobulo/goccioline lipidiche fluttuanti.
   9. Per isolare i plastoglobuli collegati al tilacoide residuo, risospendere il pellet in 12 ml di R 0,2 medio ruotando e risospendendo con delicati movimenti del pennello. Raggruppa le sospensioni in un unico flacone. Continuare con il passaggio 1.1.8.
3. Estrazione di plastoglobuli grezzi da cianobatteri
   1. Coltivare una coltura di 50 mL di Synechocystis sp. PCC 6803 alla fase stazionaria (circa 7-10 giorni) e regolare la densità cellulare a un OD₇₅₀ di 2.0 usando uno spettrofotometro. Per le condizioni di coltura, utilizzare il mezzo BG-11 e crescere in un incubatore con un'intensità luminosa di 150 μmol fotoni / m 2 / s, 2% CO₂, 32 ° C e con agitazione continua a 150 giri / min.
   2. Per rimuovere i polisaccaridi, lavare le cellule centrifugando la coltura da 50 mL a 6.000 x g per 45 minuti a 4 °C e successivamente rimuovendo il surnatante. Continuare lavando le celle due volte in 50 ml di tampone A (Tabella 1). Rimuovere un'aliquota dell'omogenato cellulare e metterla da parte prima della centrifugazione per conservarla come campione totale rappresentativo della cellula.
   3. Risospendere il pellet lavato in 25 ml di tampone A e rompere le celle usando una cella a pressione francese a 1.100 psi, ripetendo il processo 3 volte (mettere il campione su ghiaccio tra ogni ciclo per evitare la denaturazione delle proteine) fino a quando il colore lisato cambia da verde a rosso-blu-verde sotto luce bianca. Utilizzare una cella pre-raffreddata ed eseguire questo passaggio nella cella frigorifera.
   4. Distribuire l'omogenato risultante tra otto provette ultracentrifughe da 3 mL riempite fino a un massimo di 2,5 ml in ciascuna provetta e quindi sovrapporre accuratamente con 400 μL di R medio, producendo un gradiente di gradini.
      NOTA: Fare riferimento a Yang, et al. e Kelekar, et al. per descrizioni dettagliate della preparazione del gradiente di saccarosio^25,26.
   5. Bilanciare accuratamente i tubi aggiungendo ulteriore mezzo R, se necessario, e centrifugare per 30 minuti a 150.000 x g a 4 °C. Il tilacoide e altri organelli più pesanti (compresi eventuali corpi poliidrossialcanoati) si pelletizzeranno, mentre i plastoglobuli saranno facilmente visti come un cuscinetto giallo oleoso sopra o vicino alla parte superiore del gradiente di saccarosio (Figura 1C).
   6. Raccogliere il tampone galleggiante risultante di plastoglobuli grezzi con una siringa e un ago da 22G e depositarlo in un tubo da 2 ml. Se necessario, raschiare i plastoglobuli dal lato della parete del tubo dell'ultracentrifuga con la punta dell'ago.
   7. Continuare con il passaggio 2.2. In alternativa, conservare i plastoglobuli grezzi a -80 °C e purificarli successivamente.

2. Raccolta di plastoglobuli puri

1. Lavorazione dei tessuti vegetali
   1. Produrre gradienti di saccarosio in provette da ultracentrifuga da 2,5 mL prima stratificando con 500 μL di plastoglobuli grezzi dal passo 1.1 o dal passo 1.2 miscelati con 500 μL di R medio 0,7, per portare a un volume totale di 1 mL, quindi sovrapporre con 400 μL di R medio 0,2, seguito da sovrapporre con 400 μL di R medio.
      NOTA: Fare riferimento a Yang et al. e Kelekar et al. per descrizioni dettagliate della preparazione del gradiente di saccarosio^25,26.
   2. Bilanciare attentamente i tubi aggiungendo il mezzo R in eccesso allo strato superiore, se necessario. Quindi centrifugare a 150.000 x g per 1,5 h a 4 °C.
   3. Raccogliere il tampone galleggiante risultante di plastoglobuli puri (Figura 1A) con una siringa e un ago da 22G e depositarlo in un tubo da 2 ml. Se necessario, raschiare i plastoglobuli dalla parte superiore della parete del tubo della centrifuga con la punta dell'ago.
   4. Aliquot i plastoglobuli puri e flash freeze in azoto liquido. Conservare direttamente a -80 °C o liofilizzare in polvere asciutta.
2. Lavorazione dei cianobatteri
   1. Produrre un gradiente di saccarosio in quattro provette di ultracentrifuga da 2,5 mL stratificate prima con 500 μL di plastoglobuli grezzi dal passo 1,3 miscelati con 750 μL di R 0,7 medio, quindi sovrapposti con 750 μL di R 0,2 medio.
      NOTA: Fare riferimento a Yang et al. e Kelekar et al. per descrizioni dettagliate della preparazione del gradiente di saccarosio^25,26.
   2. Centrifugare il gradiente di saccarosio a 150.000 x g per 90 minuti a 4 °C. Raccogliere i plastoglobuli puri (Figura 1C) con una siringa e un ago da 22 G dalla fase superiore del gradiente di saccarosio e trasferirli in un tubo da 1,5 ml.
   3. Aliquot i plastoglobuli puri e flash-freeze in azoto liquido. Conservare direttamente a -80 °C o liofilizzare in polvere asciutta.

Al completamento della fase 1 del protocollo, si dovrebbe essere in grado di vedere facilmente una notevole quantità di materiale di goccioline plastoglobulare / lipidiche galleggiare sopra (o vicino) allo strato superiore del cuscino di saccarosio (Figura 1B-C). Altre frazioni potrebbero anche essere raccolte in questa fase. Ad esempio, i tilacoidi saranno pellettati e potranno essere risospesi con R 0,2 medio per analisi successive. Dopo successiva centrifugazione, si otterranno plastoglobuli purificati in corrispondenza o in prossimità della superficie del gradiente di saccarosio, come mostrato nella figura 1A,C. È stato visto in determinate circostanze (ad esempio, specifiche linee genotipiche o condizioni ambientali) che i plastoglobuli isolano come due distinte sottopopolazioni che si separano a diversi strati del gradiente: una frazione a bassa densità sulla superficie del gradiente e una seconda frazione più densa che si deposita all'interfaccia tra i due strati superiori del gradiente. Mentre un'attenta analisi comparativa delle frazioni di separazione non è stata precedentemente eseguita, sembra probabile che queste sottopopolazioni rappresentino plastoglobuli di dimensioni diverse, in cui quelli con diametro più piccolo (e quindi maggiore rapporto superficie/volume e rapporto proteine/lipidi) si assesteranno più in basso nel gradiente.

In un tentativo infruttuoso, si vedranno pochi o nessun plastoglobulo visibile sulla superficie del cuscino di saccarosio dopo il primo ciclo di centrifugazione. L'incapacità di isolare con successo un numero sufficiente di plastoglobuli può dipendere da diversi fattori che potrebbero dover essere ottimizzati. In particolare, la tecnica di sonicazione (quando si utilizza tessuto fogliare sano) può avere un impatto significativo sul successo. Inoltre, la quantità necessaria di materiale vegetale / cianobatterico dipenderà dalla specie specifica e dalle sue condizioni di stress.

Dopo il successo dell'isolamento dei plastoglobuli, è possibile convalidare la purezza dei plastoglobuli isolati utilizzando l'immunoblotting delle proteine marcatrici per plastoglobuli e tilacoidi (il compartimento contaminante primario). Nella Figura 1D, immunoblot rappresentativi sono stati visti usando anticorpi sollevati contro A. thaliana FBN1a, come marker per plastoglobuli2, e contro A. thaliana fotosistema II subunità D1, come marcatore di tilacoidi27. Gli omologhi FBN in Synechocystis sp. PCC 6803 si associano principalmente ai tilacoidi piuttosto che ai plastoglobuli.

Si dovrebbe anche considerare attentamente le modalità di conservazione, che possono dipendere dagli studi a valle previsti. Soprattutto per le analisi a valle dei lipidi pigmentati prenillipidici, è fondamentale ridurre al minimo l'esposizione dei campioni alla luce diretta per evitare danni ai composti fotolabili. I plastoglobuli purificati possono essere utilizzati per esperimenti a valle come esperimenti basati su lipidomici o proteomici. I plastoglobuli sono caratterizzati da un rapporto proteina/lipidi molto basso, che si manifesta nella loro bassa densità e capacità di galleggiare sul saccarosio; Pertanto, una bassa concentrazione proteica dei campioni di plastoglobulo è normale. Per questo motivo, è consigliabile rimuovere i lipidi prima della separazione proteica mediante SDS-PAGE utilizzando la precipitazione proteica dell'acetone o l'estrazione di cloroformio/metanolo.

Figura 1: Isolamento e immunoblotting di plastoglobuli e tilacoidi . (A) Un campione rappresentativo di plastoglobulo purificato da Z. mays prima dell'estrazione dal gradiente di saccarosio. (B) Un campione rappresentativo di plastoglobulo grezzo da E. nindensis essiccato prima dell'estrazione dal cuscino di saccarosio. (C) Un campione rappresentativo di plastoglobulo grezzo (a sinistra) e puro (a destra) di Synechocystis sp. PCC 6803, che mostra sia prima che dopo l'ultracentrifugazione del cuscino di saccarosio caricato e del gradiente, rispettivamente. (D) L'anticorpo anti-fibrillina1a (α-FBN1a) è stato utilizzato per monitorare l'accumulo di fibrillina, una proteina marcatrice dei plastoglobuli nelle piante superiori. L'ortologo della fibrillina si accumula prevalentemente nei tilacoidi isolati dei cianobatteri (Synecho, Syenchocystis sp. PCC 6803). La subunità D1 anti-fotosistema II (α-PsbA) è stata utilizzata per convalidare la deplezione di tilacoidi dagli isolamenti dei plastoglobuli. In ogni corsia sono stati caricati 5 μg di tilacoidi e 10 μg di proteina plastoglobulo. Abbreviazioni: PG = plastoglobuli; Tuo = tilakoids. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Ricette tampone per l'isolamento dei plastoglobuli dal tessuto fogliare delle piante o dai cianobatteri.

Tabella 2: Cocktail inibitore della fosfatasi.

Tabella 3: Cocktail inibitore della proteasi.

Nessun conflitto di interessi da dichiarare.