Viene presentato un protocollo rapido ed efficiente per l'isolamento delle goccioline lipidiche di plastoglobulo associate a vari organismi fotosintetici. Il successo della preparazione di plastoglobuli isolati è un primo passo cruciale che precede indagini molecolari dettagliate come analisi proteomiche e lipidomiche.
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Articolo metodologico
Isolamento di goccioline lipidiche plastoglobule dal tessuto fogliare vegetale e cianobatteri
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le goccioline lipidiche dei plastoglobuli sono un sottocompartimento dinamico dei cloroplasti vegetali e dei cianobatteri. Trovati ovunque tra le specie fotosintetiche, si ritiene che svolgano un ruolo centrale nell'adattamento e nel rimodellamento della membrana tilacoide in condizioni ambientali in rapida evoluzione. La capacità di isolare plastoglobuli di elevata purezza ha notevolmente facilitato il loro studio attraverso metodologie proteomiche, lipidomiche e di altro tipo. Con plastoglobuli di elevata purezza e resa, è possibile studiare la loro composizione lipidica e proteica, l'attività enzimatica e la topologia proteica, tra le altre possibili caratteristiche molecolari. Questo articolo presenta un protocollo rapido ed efficace per l'isolamento dei plastoglobuli dai cloroplasti del tessuto fogliare delle piante e presenta variazioni metodologiche per l'isolamento dei plastoglobuli e delle relative strutture di goccioline lipidiche dalle foglie di mais, dal tessuto fogliare essiccato della pianta della resurrezione, Eragrostis nindensis, e dal cianobatterio, Synechocystis PCC 6803. L'isolamento si basa sulla bassa densità di queste particelle ricche di lipidi, che facilita la loro purificazione mediante flottazione della densità del saccarosio. Questa metodologia si rivelerà preziosa nello studio dei plastoglobuli di diverse specie.
Introduzione
L'attuale comprensione della composizione e della funzione dei plastoglobuli è emersa attraverso studi proteomici e lipidomici dettagliati 1,2,3,4,5. Tali studi sono stati notevolmente aiutati da un metodo rapido ed efficace di isolamento che si basa sulla loro bassissima densità per una separazione efficiente utilizzando gradienti di saccarosio. I metodi iniziali di isolamento dei plastoglobuli sono stati ottenuti da specie come il faggio (Fagus sylvatica), la ginestra scozzese (Sarothamnus sc....
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Protocollo
1. Isolamento dei plastoglobuli grezzi
- Estrazione di plastoglobuli grezzi da tessuto fogliare di mais non stressato
- Acquisire sei piantine di mais sane di circa 3 settimane e quasi nella fase di crescita V5, del peso di circa 120 g.
- Ritagliare tutte le foglie alla base del gambo, immergerle rapidamente in un bagno di ghiaccio e trasportarle nella cella frigorifera.
- Lavorando sotto una lampada di sicurezza verde, rimuovere le foglie di mais dal bagno di ghiaccio e tagliarle in pezzi più piccoli (circa 5 cm x 5 cm) usando le forbici.
- Macinare delicatamente ma accuratamente metà del tessuto fogliare tagli....
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Risultati
Al completamento della fase 1 del protocollo, si dovrebbe essere in grado di vedere facilmente una notevole quantità di materiale di goccioline plastoglobulare / lipidiche galleggiare sopra (o vicino) allo strato superiore del cuscino di saccarosio (Figura 1B-C). Altre frazioni potrebbero anche essere raccolte in questa fase. Ad esempio, i tilacoidi saranno pellettati e potranno essere risospesi con R 0,2 medio per analisi successive. Dopo successiva centrif.......
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Discussione
Per ridurre al minimo le alterazioni fisiologiche/biochimiche del materiale e proteggere alcuni pigmenti foto- e termo-labili-lipidici che sono un ricco componente dei plastoglobuli, è fondamentale eseguire l'isolamento a 4 °C e al riparo dalla luce. Come indicato sopra, i passaggi iniziali vengono eseguiti nella cella frigorifera sotto una lampada di sicurezza utilizzando una lampadina a emissione verde. Le fasi successive eseguite in laboratorio sono sotto luci soffuse e utilizzano ghiaccio o centrifugazione refrigerat.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi da dichiarare.
Ringraziamenti
La ricerca nel gruppo di laboratorio di Lundquist è supportata da sovvenzioni NSF (MCB-2034631) e USDA (MICL08607) a P.K.L. Gli autori ringraziano la dott.ssa Carrie Hiser (MSU) per il supporto nello sviluppo del metodo di isolamento dei plastoglobuli cianobatterici.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| AEBSF | Milipore Sigma | P7626 | |
| Antipain.2HCl | Bachem | H-1765.0050BA | |
| Aprotinina | Milipore Sigma | A6106 | |
| Ascorbato | BDH | BDH9242 | |
| Bestatin | Sigma Aldrich | B8385 | |
| Beta-Glicerofosfato. 2Na5H2O | EMD Millipore | 35675 | |
| Albumina sierica bovina | Proliant Biological | 68700 | |
| Chymostatin | Sigma Aldrich | C7268 | |
| Eragrostis nindensis | N/A | N/A | |
| E-64 | Milipore Sigma | E3132 | |
| Cella a pressione francese (modello FA-079) | SLM/Aminco | N/A | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Leupeptin | Sigma Aldrich | L2884 | |
| Cloruro di magnesio | Sigma Aldrich | M8266 | |
| Multitron incubatore a scuotimento | Infors HT | N / A | |
| Fosfo-ramidon.2 Na | Sigma Aldrich | R7385 | |
| Idrossido di potassio | Fisher Chemicals | M16050 | |
| Cisteina ridotta | MP Biochemicals | 101444 | |
| fluoruro di sodio | Sigma Aldrich | S7920 | |
| Orto-vanadato di sodio | Sigma Aldrich | 450243 | |
| Pirofosfato di sodio · 10H2O | Sigma Aldrich | 3850 | |
| Sorbitolo | Sigma Aldrich | S3889 | |
| Saccarosio | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Sylvania 15 W lampadina fluorescente a tubo Gro-Lux, 18" | Walmart | N/A | |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | N/A | N/A | |
| Optima MAX-TL Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A95761 | |
| Waring Blender (1.2 L) | VWR | 58977-227 | Frullatore commerciale |
| Zea mays | N/A | N/A |
Riferimenti
- Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. Lipid droplets throughout the evolutionary tree. Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).
- Lundquist, P. K., et al. The functional network of the Ara....
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Ristampe e permessi
