Valutazione delle presunte proprietà anticriptococco degli estratti grezzi e chiarificati dai molluschi

Summary

Il patogeno fungino umano Cryptococcus neoformans produce una varietà di fattori di virulenza (ad esempio, peptidasi) per promuovere la sua sopravvivenza all'interno dell'ospite. Le nicchie ambientali rappresentano una fonte promettente di nuovi inibitori naturali della peptidasi. Questo protocollo delinea la preparazione di estratti di molluschi e la valutazione del loro effetto sulla produzione di fattori di virulenza fungini.

Abstract

Cryptococcus neoformans è un patogeno fungino umano incapsulato con una distribuzione globale che infetta principalmente individui immunocompromessi. L'uso diffuso di antifungini in ambito clinico, il loro uso in agricoltura e l'ibridazione del ceppo hanno portato ad una maggiore evoluzione della resistenza. Questo crescente tasso di resistenza contro gli antimicotici è una preoccupazione crescente tra i medici e gli scienziati di tutto il mondo, e vi è una maggiore urgenza di sviluppare nuove terapie antifungine. Ad esempio, C. neoformans produce diversi fattori di virulenza, inclusi enzimi intra ed extracellulari (ad esempio, peptidasi) con ruoli nella degradazione dei tessuti, nella regolazione cellulare e nell'acquisizione di nutrienti. L'interruzione di tale attività della peptidasi da parte degli inibitori perturba la crescita e la proliferazione dei funghi, suggerendo che questa potrebbe essere una strategia importante per combattere l'agente patogeno. È importante sottolineare che gli invertebrati come i molluschi producono inibitori della peptidasi con applicazioni biomediche e attività antimicrobica, ma sono poco esplorati in termini di utilizzo contro i patogeni fungini. In questo protocollo, è stata eseguita un'estrazione globale dai molluschi per isolare potenziali inibitori della peptidasi in estratti grezzi e chiarificati e sono stati valutati i loro effetti contro i classici fattori di virulenza criptococcica. Questo metodo supporta la prioritizzazione dei molluschi con proprietà antifungine e offre opportunità per la scoperta di agenti anti-virulenza sfruttando gli inibitori naturali presenti nei molluschi.

Introduction

Cryptococcus neoformans è un patogeno fungino umano che produce una malattia grave negli ospiti immunocompromessi, come gli individui che vivono con l'HIV / AIDS¹, e porta a circa il 19% dei decessi correlati all'AIDS². Il fungo è suscettibile a diverse classi di antimicotici, tra cui azoli, polieni e flucitosina, che esercitano attività fungicida e fungistatica utilizzando meccanismi distinti ^3,4. Tuttavia, l'uso estensivo di antifungini in ambito clinico e agricolo combinato con l'ibridazione del ceppo ha amplificato l'evoluzione ....

Protocol

1. Estrazione di proteine dai molluschi

1. Raccogli molluschi da un'area naturale designata e approvata (ad esempio, Speed River, Guelph, Ontario). Per questo studio, sono state selezionate sia specie autoctone che invasive per valutare un'ampia gamma di potenziali effetti antifungini.
2. Rompere delicatamente il guscio dei molluschi (ad esempio, Cepaea nemoralis, Planorbella pilsbryi e Cipangopaludina chinensis) usando un pestello e un mortaio e rimuovere i pezzi solidi con un paio di pinzette. Generalmente, 10 molluschi sono raggruppati per l'uso in tutto il protocollo.
3. Raccogliere e pesare gli orga....

Results

Il flusso di lavoro qui descritto consente l'isolamento di proteine e peptidi da molluschi con potenziali proprietà anti-virulenza contro C. neoformans. Allo stesso modo, la valutazione di diverse forme di estratti (cioè grezzi e chiarificati) consente la semi-purificazione dei potenziali composti attivi e supporta la valutazione a valle (ad esempio, proteomica basata sulla spettrometria di massa). Tipicamente, il flusso di lavoro di estrazione delle proteine produce soluzioni omogeneizzate con concentrazioni pr.......

Discussion

Il protocollo di estrazione qui descritto delinea l'isolamento di composti da molluschi raccolti dall'Ontario, in Canada, e dimostra una nuova indagine sull'uso di estratti di molluschi contro il patogeno fungino umano, C. neoformans. Questo protocollo si aggiunge a un crescente corpo di ricerca che studia l'attività degli inibitori della peptidasi dagli invertebrati¹³. Durante l'estrazione, alcuni campioni di estratto erano difficili da filtrare-sterilizzare, probabilmente a causa della .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,2 μ m Filtri	VWR	28145-477 (Nord America)
Provette da 1,5 mL (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120086
Provette da 2 mL (Safe-Lock)	Eppendorf	0030120094
3,4-Diidrossi-L-fenilalanina (L-DOPA)	Sigma-Aldrich	D9628-5G	CAS #: 59-92-7
Piastre a 96 pozzetti	Costar (Corning)	3370
Bullet Blender Storm 24	NEXT ADVANCE	BBY24M
Centrifuga 5430R	Eppendorf	5428000010
Chelex 100 Resina	BioRad	142-1253
CO2 Incubatore (Statico)	SANYO	Non disponibile
Cryptococcus neoformans H99	ATCC	208821
DIC Microscopio	Software per microscopio Olympus
DIC	Zeiss
DMEM	Corning	10-013-CV
Glucosio (D-glucosio, anidro, grado reagente)	BioShop	GLU501	CAS #: 50-99-7
Glicina	Fisher Chemical	G46-1	CAS #: 56-40-6
GraphPad Prism 9	Dotmatics
Emocitometro	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375
Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4.7 H2O)	Honeywell	M1880-500G	CAS #: 10034-99-8
Peptone	BioShop	PEP403
Phosohate tampone sale pH 7.4	BioShop	PBS408	SKU: PBS408.500
Lettore di piastre (Synergy-H1)	BioTek (Agilent)	Non disponibile
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)	Fisher Chemical	P285-500	CAS #: 7778-77-0
Subtilisina A	Sigma-Aldrich	P4860	CAS #: 9014-01-01
Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide	Sigma-Aldrich	573462	CAS #: 70967-97-4
Bagno termale	VWR	76308-834
Tiamina cloridrato	Fisher-Bioreagents	BP892-100	CAS #: 67-03-8
Estratto di lievito	BioShop	YEX401	CAS #: 8013-01-2
Lievito base azotata (con aminoacidi)	Sigma-Aldrich	Y1250-250G	YNB