Method Article

Automazione del test del micronucleo mediante citometria a flusso di imaging e intelligenza artificiale

DOI:

10.3791/64549

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January 27th, 2023

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1Amnis Flow Cytometry, Luminex Corporation

In This Article

Summary

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Il test del micronucleo (MN) è un test ben consolidato per quantificare il danno al DNA. Tuttavia, la valutazione del test utilizzando tecniche convenzionali come la microscopia manuale o l'analisi delle immagini basata sulle caratteristiche è laboriosa e impegnativa. Questo articolo descrive la metodologia per sviluppare un modello di intelligenza artificiale per valutare il test MN utilizzando i dati di citometria a flusso di imaging.

Abstract

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Il test del micronucleo (MN) viene utilizzato in tutto il mondo dagli organismi di regolamentazione per valutare le sostanze chimiche per la tossicità genetica. Il test può essere eseguito in due modi: segnando MN in cellule binucleate una volta divise, bloccate dalla citochinesi o cellule mononucleate completamente divise. Storicamente, la microscopia ottica è stata il metodo gold standard per valutare il test, ma è laboriosa e soggettiva. La citometria a flusso è stata utilizzata negli ultimi anni per valutare il test, ma è limitata dall'incapacità di confermare visivamente aspetti chiave delle immagini cellulari. La citometria a flusso di imaging (IFC) combina l'acquisizione di immagini ad alta produttività e l'analisi automatizzata delle immagini ed è stata applicata con successo per acquisire rapidamente immagini e valutare tutti gli eventi chiave nel test MN. Recentemente, è stato dimostrato che i metodi di intelligenza artificiale (AI) basati su reti neurali convoluzionali possono essere utilizzati per valutare i dati del saggio MN acquisiti da IFC. Questo documento descrive tutti i passaggi per utilizzare il software di intelligenza artificiale per creare un modello di deep learning per valutare tutti gli eventi chiave e applicare questo modello per assegnare automaticamente un punteggio a dati aggiuntivi. I risultati del modello di deep learning AI si confrontano bene con la microscopia manuale, consentendo quindi un punteggio completamente automatizzato del test MN combinando IFC e AI.

Introduction

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Il test del micronucleo (MN) è fondamentale nella tossicologia genetica per valutare il danno al DNA nello sviluppo di cosmetici, prodotti farmaceutici e chimici per uso umano 1,2,3,4. I micronuclei sono formati da interi cromosomi o frammenti cromosomici che non si incorporano nel nucleo dopo la divisione e si condensano in piccoli corpi circolari separati dal nucleo. Pertanto, il MN può essere utilizzato come endpoint per quantificare il danno al DNA nei test di genotossicità1.

Il metodo ....

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Protocol

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1. Acquisizione dati mediante citometria a flusso di imaging

NOTA: Fare riferimento a Rodrigues et al.16 con le seguenti modifiche, notando che le regioni di acquisizione utilizzando IFC potrebbero dover essere modificate per un'acquisizione ottimale dell'immagine:

  1. Per il metodo non-Cyt-B, eseguire un conteggio delle cellule utilizzando un contatore di cellule disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali) su ciascuna coltura immediatamente prima della coltura e immediatamente dopo il periodo di recupero.
  2. Se si ese....

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Results

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La Figura 1 mostra il flusso di lavoro per l'utilizzo del software AI per creare un modello per il test MN. L'utente carica i file .daf desiderati nel software AI, quindi assegna gli oggetti alle classi del modello di verità di terra utilizzando gli algoritmi di tagging cluster assistito da AI (Figura 2) e predict (Figura 3). Una volta che tutte le classi del modello di verità di base sono state popolate con oggetti sufficienti, il .......

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Discussion

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Il lavoro qui presentato descrive l'uso di algoritmi di deep learning per automatizzare il punteggio del test MN. Diverse pubblicazioni recenti hanno dimostrato che strumenti intuitivi e interattivi consentono la creazione di modelli di deep learning per analizzare i dati delle immagini senza la necessità di conoscenze computazionali approfondite18,19. Il protocollo descritto in questo lavoro utilizzando un pacchetto software basato sull'interfaccia utente è stat.......

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Disclosures

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Gli autori sono impiegati da Luminex Corporation, una società DiaSorin, il produttore del citometro a flusso di imaging ImageStream e del software Amnis AI utilizzato in questo lavoro.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provetta da centrifuga da 15 mlFalcon352096
Cleanser - Coltro Clenz Beckman Coulter8546931Riempi il contenitore con 200 ml di detergente.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/
1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
ColchicinaMilliporeSigma64-86-8
Filtro sottovuoto per flaconi Corning MilliporeSigmaCLS4307690,22 µ m filtro, flacone da 500 ml
Citocalasina BMilliporeSigma14930-96-2flacone da 5 mg
Debubbler - 70% IsopropanoloMilliporeSigma1.3704Riempire il contenitore con 200 mL di Debubbler.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)MilliporeSigma67-68-5
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1XEMD MilliporeBSS-1006-BPBS Ca++MG++ Gratuito 
Siero fetale bovinoHyCloneSH30071.03
Formaldeide, 10%, senza metanolo, Ultra PurePolysciences, Inc.04018Questo è ciò che viene utilizzato per la formalina al 4% e all'1%. ATTENZIONE: Formalina/Formaldeide tossica per inalazione e se ingerita. Irritante per gli occhi, il sistema respiratorio e la pelle. Può causare sensibilizzazione per inalazione o contatto con la pelle. Rischio di gravi danni agli occhi. Potenziale rischio di cancro. http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Analizzatore di cellule Guava Muse Luminex0500-3115È stato utilizzato un analizzatore di cellule Guava Muse in configurazione standard.
Hoechst 33342Thermo FisherH357010 mg/mL soluzione
MannitoloMilliporoSigma69-65-8
MEM Aminoacidi non essenziali 100XHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IILuminex, una società DiaSorin100220È stata utilizzata una fotocamera ImageStreamX Mark II a 2 con laser a 405 nm, 488 nm e 642 nm.
Software di analisi MIFC - IDEASLuminex, a DiaSorin company100220"Image analysis sofware"
Il software complementare al software MIFC (ImageStreamX MKII)
MIFC - INSPIRELuminex, a DiaSorin company100220"Software di acquisizione immagini"
Questo è il software che esegue il software MIFC (ImageStreamX MKII)
Amnis AIsoftware Luminex, a DiaSorin company100221"Software AI"
Questo è il software che permette la creazione di modelli di intelligenza artificiale per analizzare i dati
Mitomicina CMilliporeSigma50-07-7
NEAA Miscela 100xLonza BioWhittaker13-114E
Soluzione di penicilina/streptomicina/glutammina 100XGibco15070063
Cloruro di potassio (KCl)MilliporeSigmaP9541
Risciacquo - Acqua ultrapura o acqua deionizzataNANA Utilizzarequalsiasi acqua ultrapura o acqua deionizzata. Riempire il contenitore con 900 ml di risciacquo.
RNaseMilliporeSigma9001-99-4
RPMI-1640 Medium 1xHyCloneSH30027.01
Guaina - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-BQuesto è lo stesso della soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco 1x  Ca++MG++ gratuito. Riempire il contenitore con 900 ml di guaina.
SterilizzatoreHyCloneSH30529.01
- 0,4%– 0,7% IpocloritoVWRJT9416-1Questa è assentualmente il 10% di candeggina Clorox che può essere prodotta diluendo la candeggina Clorox con acqua. Riempire il contenitore con 200 ml di Sterilzer.
Pallone T25Falcon353109
Pallone T75Falcon353136
celle TK6MilliporeSigma95111735
ad acqua sterile

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fenech, M., et al. HUMN project initiative and review of validation, quality control and prospects for further development of automated micronucleus assays using image cytometry systems. International Journal of Hygiene and Environmental Health. 216 (5), 541-552 (2013).
  2. OECD. Test No. 487: In Vitro Mammalian Cel....

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Micronucleus AssayImaging Flow CytometryArtificial IntelligenceConvolutional Neural NetworkGenetic ToxicityAutomated Image AnalysisDeep Learning ModelCell Morphology ClassificationGenotoxicity ScreeningMononucleated Cells

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