Questo protocollo descrive l'isolamento delle cellule staminali muscolari e dei progenitori fibro-adipogeni dai singoli muscoli scheletrici nei topi. Il protocollo prevede la dissezione di un singolo muscolo, l'isolamento delle cellule staminali mediante selezione cellulare attivata a fluorescenza, la valutazione della purezza mediante colorazione con immunofluorescenza e la misurazione quantitativa dell'ingresso in fase S mediante saggio di incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina.
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Articolo metodologico
Isolamento di popolazioni di cellule staminali quiescenti da singoli muscoli scheletrici
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il muscolo scheletrico ospita popolazioni distinte di cellule staminali adulte che contribuiscono all'omeostasi e alla riparazione del tessuto. Le cellule staminali muscolari scheletriche (MuSC) hanno la capacità di creare nuovi muscoli, mentre i progenitori fibro-adipogeni (FAP) contribuiscono ai tessuti di supporto stromale e hanno la capacità di produrre fibroblasti e adipociti. Sia i MuSC che i FAP risiedono in uno stato di uscita prolungata del ciclo cellulare reversibile, chiamato quiescenza. Lo stato quiescente è la chiave della loro funzione. Le cellule staminali quiescenti sono comunemente purificate da più tessuti muscolari riuniti in un singolo campione. Tuttavia, studi recenti hanno rivelato differenze distinte nei profili molecolari e nella profondità di quiescenza delle MuSC isolate da diversi muscoli. Il presente protocollo descrive l'isolamento e lo studio di MuSCs e FAPs da singoli muscoli scheletrici e presenta strategie per eseguire analisi molecolari dell'attivazione delle cellule staminali. Descrive in dettaglio come isolare e digerire muscoli di diversa origine dello sviluppo, spessori e funzioni, come il diaframma, tricipiti, gracili, tibiale anteriore (TA), gastrocnemio (GA), soleo, estensore digitorum longus (EDL) e muscoli masseteri. MuSCs e FAPs sono purificati mediante selezione cellulare attivata da fluorescenza (FACS) e analizzati mediante colorazione a immunofluorescenza e saggio di incorporazione di 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU).
Introduzione
Il muscolo scheletrico ha un'elevata capacità di rigenerazione grazie alla presenza di cellule staminali muscolari (MuSC). I MuSC si trovano sulle miofibre, sotto la lamina basale, e risiedono in uno stato quiescente di uscita prolungata e reversibile del ciclo cellulare 1,2,3,4. Dopo la lesione, i MuSC si attivano ed entrano nel ciclo cellulare per dare origine a progenitori amplificatori che possono differenziarsi e fondersi per formare nuove miofibre 2,5. Lavori precedenti hanno d....
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Protocollo
Il presente protocollo è stato eseguito in conformità con le linee guida sulla cura degli animali presso l'Università di Aarhus e le normative etiche locali.
NOTA: Assicurarsi di rispettare le normative del comitato etico locale per la sperimentazione animale e la gestione di campioni di roditori post-mortem. I topi sono una potenziale fonte di allergeni; Se disponibile, attivare la ventilazione di scarico e posizionarla sopra lo spazio di lavoro per evitare un'eccessiva esposizione agli allergeni. In alternativa, indossare una maschera facciale se l'esperimento viene eseguito regolarmente. Questo protocollo prevede di lavorare con oggetti ....
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Risultati
Seguendo il protocollo per l'isolamento individuale del muscolo scheletrico (Figura 2), i muscoli gracili, TA, EDL, GA, soleo, tricipiti, massetere e diaframma sono stati isolati da tre topi maschi svizzeri di razza che erano stati interrotti da un programma di allevamento locale (Figura 2). Dopo la dissociazione tissutale e la colorazione degli anticorpi, i MuSC e i FAP dei singoli muscoli sono stati purificati mediante FACS (Figura 3
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Discussione
Diversi passaggi sono fondamentali nell'esecuzione di questo protocollo per ottenere buoni rendimenti. I singoli muscoli hanno un volume ridotto rispetto alla quantità di muscolo utilizzata nei protocolli di isolamento di massa. Ciò si traduce in un rischio di secchezza del muscolo durante la dissezione, che riduce la resa. Per evitare ciò, è importante aggiungere mezzo ai muscoli immediatamente dopo la dissezione. Inoltre, se la dissezione richiede più tempo, la pelle può essere rimossa da un arto alla volta per ridurre.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti e non hanno conflitti di interesse.
Ringraziamenti
La selezione delle cellule è stata eseguita presso la FACS Core Facility, Università di Aarhus, Danimarca. Le figure sono state create utilizzando Biorender.com. Ringraziamo il Dr. J. Farup per aver condiviso l'anticorpo anti-PDGFRa del coniglio. Questo lavoro è stato sostenuto da un AUFF Starting Grant a E.P. e Start Package grants da NovoNordiskFonden a E.P. (0071113) e ad A.D.M. (0071116).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta da 1,5 mL ( Prestazioni PCR testate, PP, 30.000 xg, Senza DNA/DNasi-/RNasi, Basso legame con il DNA, Sterile ) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 72.706.700 | Provetta da 1,5 mL |
| Provetta da 15 mL (PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNasi-/RNasi-, Non citotossico, apirogeno, Sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.554.502 | Provetta |
| da 15 mLProvetta da 5 ml in polistirene a fondo tondo | Falcon, Fisher Scientific. | 352054 | Provetta FACS senza tappo filtro |
| 5 mL di polistirene Tubo a fondo tondo con tappo filtrante Falcon | , Fisher Scientific | 352235 | Provetta FACS con tappo filtro |
| Provetta da 5 mL (PP, non sterile autoclavabile) | VWR collection | 525.0946 | Provetta da 50 mL |
| ( PP/HD-PE, 20.000 xg, IVD/CE, ADR, DNA/DNase-/RNase-free, non citotossico, apirogeno, sterile) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 62.547.254 | provetta da 50 mL |
| Alexa Fluor 555 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lotto: 2387458 (Cat # A31572) | |
| Alexa Fluor 647 asino-anti topo IgG (H+L) | Invitrogen, Thermo Fisher | Lotto: 2420713 (Cat#A31571) | |
| ARIA 3 | BD | FACS, Core facility Aarhus | |
| University Centrifuge 5810 | eppendorf | EP022628188 | Centrifuga |
| Click-iT EdU Kit di proliferazione cellulare per imaging, Alexa Fluor 488 colorante | Invitrogen, Thermo Fisher | Lotto: 2387287 (Cat# C10337) | Kit di proliferazione cellulare |
| Collagene da pelle di vitello | Bioreagente, Sigma Aldrich | Fonte: SLCK6209 (Cat# C8919) | |
| Collagenasi di tipo II | Worthington, Fisher Scientific | Lotto: 40H20248 (cat# L5004177 ) | Collagenasi |
| Dispase | Gibco, Fisher Scientific | Lotto: 2309415 (cat# 17105-041 ) | Dispase |
| Siero d'asino (non sterile) | Sigma Aldrich, Merck | Lotto: 2826455 (Cat# S30-100mL) | |
| Dumont nr. 5, 110 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.327 | Pinze dritte con punte fini |
| Dumont nr. 7, 115 mm | Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1606.335 | Pinze curve |
| Miscela di nutrienti F-10 (Ham) (1x), +L-glutammina | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2453614 (cat# 31550-023) | |
| FITC anti-topo CD31 | BioLegend, NordicBioSite | MEC13.3 (Cat # 102506) | |
| FITC Anti-mouse CD45 | BioLegend, NordicBioSite | 30-F11 (Cat# 103108) | |
| Acido acetico glaciale (100%) | EMSURE, Merck | K44104563 9Cat # 1000631000) | |
| Testa sopra la testa rotatore di mini-tubo | Fisher Scientific | 15534080 (Modello n. 88861052) | Rotatore mini-tubo testa sopra la testa |
| Siero di cavallo | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 2482639 (cat# 10368902 ) | |
| Isotemp SWB 15 | FisherBrand, Fisher Scientific | 15325887 | Agitazione bagno d'acqua |
| MS2 mini-shaker | IKA | Unità Vortex | |
| Ago 20 G (0,9 mm x 25 mm) | BD microlancia, Fisher Scientific | 304827 | ago da 20 G |
| Tampone formalinico neutro 10% | CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | Lotto: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002) | |
| Filtro cellulare apirogeno (40 &; M) | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3945.040 | Filtro cellulare |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) | BioLegend, NordicBioSite | D7 (Cat# 108120) | |
| Pax7 anticorpo primario | DSHB | Lotto: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428) | |
| PBS 10x concentrato in polvere | Fisher BioReagents, Fisher Scientific | BP665-1 | |
| PE/Cy7 anti-mouse CD106 (VCAM1) | BioLegend, NordicBioSite | 429 (MVCAM. A) (Cat # 105720) | |
| Pen/strep | Gibco, Fisher Scientific | Lot. 163589 (cat# 11548876 ) | |
| Puntali per pipette p10 | Puntali artistici, barriera autosigillante, Thermo Scientific | 2140-05 | Puntali filtranti a bassa ritenzione, pre-sterilizzati Puntali |
| pipette p1000 | Puntali artistici, barriera autosigillante, Thermo Scientific | 2279-05 | Puntali filtranti a bassa ritenzione, pre-sterilizzati Puntali |
| pipette p20 | Puntali artistici, barriera autosigillante, Thermo Scientific | 2149P-05 | Puntali con filtro a bassa ritenzione, pre-sterilizzati |
| Puntali per pipette p200 | Puntali Art, barriera autosigillante, Thermo Scientific | 2069-05 | Puntali con filtro a bassa ritenzione, pre-sterilizzati, |
| Sottopiede protettivo | Abena | ACTC-7712 | 60 x 40cm, 8 strati |
| Rainin, pipet-lite XLS | Mettler Toledo, Thermo Scientific | 2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05 | Pipette (P10, P20, P200, P1000) |
| Anti-PDGFR-alfa ricombinante | RabMAb, abcam | AB134123 | |
| Bisturi (albero n. 3) | Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.502 | Bisturi |
| Lama per bisturi n. 11 | Heinz Herenz, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 1902.0911 | Bisturi |
| Scanlaf mars | Labogene | armadio di classe 2: Microscopio | |
| ScanR | , struttura principale Forbici dell'Università di Aarhus | ||
| FST | 14568-09 | ||
| Serie 8000 DH | Thermo Scientific | 3540-MAR | Incubatore |
| Pipetta sierologica 10 mL | VWR | 612-3700 | sterile e apirogena |
| 5 mL | VWR, Avantor erogato da VWR | 612-3702 | Siringa sterile, apirogena |
| 5 mL, punta Luer (6%), sterile | BD Emerald, Fisher Scientific | 307731 Siringa | |
| TC Dish 100, standard | Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S | 83.3902 | Petri dish |
| Superficie trattata con coltura tissutale (TC), polistirene nero, fondo piatto, sterile, coperchio, confezione da 20 | Corning, Sigma Aldrich | 3764 | 96 pozzetti Piastra a mezzo fondo |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich, Merck | Fonte: SLCJ6163 (Cat # T8787) |
Riferimenti
- Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692(2021).
- Cheung....
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