Coltivazione, congelamento, lavorazione e imaging di interi organoidi e sferoidi mentre sono ancora in un idrogel

Il futuro della ricerca e della terapia cellulare risiede nelle colture cellulari 3D ^1,2,3. I modelli organoidi e sferoidi colmano il divario tra esperimenti in vitro e modelli animali creando modelli migliori che imitano lo sviluppo, la fisiologia e le malattie del corpo umano 4,5,6,7,8,9. Tuttavia, la riproducibilità e la ripetibilità di questi modelli rimangono impegnative. Inoltre, la manipolazione, la raccolta, il trasferimento e la centrifugazione di queste strutture con le tecnologie attuali provocano la perdita o il danneggiamento degli organoidi e degli sferoidi in molte condizioni, influenzando significativamente i risultati.

Nonostante molti protocolli per la colorazione istologica, la colorazione immunoistochimica, l'etichettatura con immunofluorescenza e la crioconservazione, non esiste un approccio universale relativo alla standardizzazione delle condizioni sperimentali, alla gestione e all'elaborazione di queste delicate strutture senza perderle o danneggiarle. I protocolli attuali sono anche incredibilmente lunghi, alternati da pochi giorni a diverse settimane, e includono procedure complesse con vari reagenti 10,11,12,13,14. Inoltre, la raccolta, il pipettaggio, la centrifugazione e il trasferimento di strutture di crescita 3D tra vasi di coltura cellulare e crioviali causano cambiamenti nel posizionamento delle strutture e delle forze meccaniche e, in ultima analisi, influenzano la differenziazione e la maturazione degli organoidi e degli sferoidi. È stato riportato che la topologia tissutale, il posizionamento delle cellule e le forze meccaniche influenzano significativamente la differenziazione e la maturazione cellulare 6,15,16,17.

Pertanto, è auspicabile migliorare le attuali tecnologie convenzionali per generare organoidi e sferoidi con qualità stabile. Un metodo/dispositivo che salterà la centrifugazione e le altre fasi sopra descritte e fornirà il materiale in un unico ambiente sicuro dall'inizio alla fine dei molteplici processi sarebbe utile per raggiungere i dati più coerenti e affidabili. Inoltre, ciò ridurrà i vincoli di tempo, manodopera e costi.

Il dispositivo multiuso (MD) qui descritto fornisce un unico ambiente sicuro per più processi di organoidi e sferoidi (Figura supplementare 1). Questo dispositivo e i protocolli complementari eliminano le fasi di raccolta, pipettaggio, trasferimento e centrifugazione. Gli organoidi e gli sferoidi rimangono nel loro ambiente in vitro durante i processi sequenziali. Questo ambiente comprende principalmente componenti della matrice extracellulare naturale o sintetica, come gli idrogel disponibili in commercio. In altre parole, i metodi qui descritti consentono di elaborare, esaminare e congelare un campione intero di organoidi / sferoidi mentre è ancora in una goccia di idrogel.

Il dispositivo biocompatibile è resistente a temperature comprese tra 60 °C e -160 °C, il che rende possibile ripristinare gli organoidi/steroidi in un serbatoio di azoto liquido a -160 °C o preparare blocchi di resina per microscopia elettronica a 60 °C. La nicchia nel dispositivo è stata progettata per definire uno spazio limitato per le strutture di crescita 3D e stimolare la formazione di sferoidi o organoidi sulla base degli studi precedenti 18,19,20,21,22,23. Quella parte del dispositivo è trasparente e contiene una plastica specifica che fornisce un'elevata qualità ottica (indice di rifrazione: 1,43; valore di abbe: 58; spessore: 7,8 mil [0,0078 in o 198 μm]). Sia la nicchia che la parte "laterale" circostante causano l'autofluorescenza. La nicchia trasparente al centro ha un'area di 80 mm 2, mentre la parte laterale è di 600 mm². La profondità del contenitore è di 15 mm e lo spessore è di 1,5 mm. Queste caratteristiche, oltre alle dimensioni e al design del dispositivo, consentono di effettuare osservazioni con diversi tipi di microscopio ad alta tecnologia e preparare i campioni per gli esami al microscopio elettronico (Figura 2). Il sistema di chiusura del dispositivo prevede due posizioni, una sigillata nel congelatore e l'altra che consente il flusso di gas nell'incubatore. I saggi di proliferazione e citotossicità di CCK8 dimostrano effetti simili sulle cellule rispetto ai tradizionali piatti di coltura cellulare (Figura supplementare 2). Il test di esclusione del blu di Trypan dimostra un'elevata vitalità cellulare (94%) durante la coltura cellulare nel MD (Figura 3).

I processi che possono essere eseguiti per un campione nel singolo dispositivo comprendono (1) coltura, (2) colorazione istologica, (3) immunocolorazione, compresa la marcatura immunoistochimica e immunofluorescenza, (4) congelamento, (5) scongelamento, (6) esame al microscopio ottico, come microscopi a campo chiaro, campo scuro, fluorescenza, confocale e super-risoluzione, (7) rivestimento ed esame direttamente al microscopio elettronico a scansione o (8) preparazione per la microscopia elettronica a trasmissione ( Figura 2).

Esistono diverse metodologie per la colorazione istologica, la marcatura immunoistochimica o la marcatura fluorescente di organoidi e sferoidi 10,11,12,13,14,24,25. La loro raccolta dall'idrogel è il primo e principale passo della tecnologia attuale. Dopo questo passaggio, alcuni metodi consentono l'immuno-marcatura a montaggio intero. Gli organoidi raccolti sono incorporati in paraffina, sezionati ed etichettati per la colorazione e l'immunocolorazione in altri. Tuttavia, le sezioni potrebbero non presentare l'intero campione e fornire solo dati limitati relativi all'architettura 3D della struttura. Inoltre, il danneggiamento di queste strutture 3D e la perdita di antigenicità sono effetti collaterali ben noti di queste tecnologie.

I nuovi protocolli complementari per gli esami microscopici in questo articolo consentono un'analisi di campioni interi ancora in un idrogel. I protocolli qui descritti includono due formulazioni di nuova concezione: soluzione per immunoistochimica (S-IHC) e soluzione per l'etichettatura immunofluorescenza (S-IF). I metodi con queste soluzioni consentono ai ricercatori di ottenere dati più accurati, poiché non ci sono effetti dannosi dei flussi di lavoro tradizionali, come centrifugazione, pipettaggio e trasferimento delle strutture delicate. Il protocollo qui descritto elimina anche la necessità di fasi di raccolta, blocco, pulizia e recupero dell'antigene e riduce l'intera procedura a 6-8 ore. Inoltre, la metodologia consente di aggiungere simultaneamente da uno a tre anticorpi allo stesso S-IF. Pertanto, è possibile ottenere i risultati nello stesso giorno anche dopo gli esperimenti di etichettatura multipla, che è un altro vantaggio del protocollo qui descritto; I tradizionali protocolli di etichettatura con immunofluorescenza a montaggio intero richiedono in genere da 3 giorni a diverse settimane 10,11,12,13,14.

Anche l'incorporazione di paraffina, un altro passaggio dannoso che riduce l'antigenicità, viene omesso. La struttura 3D rimane nel suo ambiente in vitro dall'inizio alla fine dell'esame microscopico. Poiché la struttura 3D rimane nelle sue condizioni di crescita, l'espressione proteica e i dati di localizzazione imitano meglio le condizioni in vivo . Sono attesi risultati più accurati, poiché la metodologia elimina i passaggi che influenzano l'espressione dell'antigene del campione. Le Tabelle 1 e 2 dimostrano come questi nuovi protocolli eliminino i passaggi, risparmino tempo e manodopera in laboratorio e riducano i costi e i prodotti di scarto rispetto ai flussi di lavoro tradizionali.

Oltre ai passaggi cruciali sopra descritti, un altro problema è fornire un mezzo di crioconservazione e un metodo per preservare la struttura 3D del campione con tassi di vitalità cellulare più elevati 26,27,28,29,30,31. La crioconservazione è essenziale per creare un sistema modello stabile e consentire la biobanca di organoidi e sferoidi^32,33. Il biobanking dell'intera struttura 3D originale consentirà una ricapitolazione più fedele dello stato naturale di salute o malattia. Le considerazioni chiave sono la convenienza e l'affidabilità della crioconservazione e lo scongelamento di organoidi/sferoidi. Il recupero degli organoidi post-disgelo è molto basso nella maggior parte delle tecnologie attuali, spesso inferiore al 50%. Tuttavia, studi recenti hanno mostrato risultati promettenti con tassi di sopravvivenza migliorati^26,27,28,29. Lee et al. hanno dimostrato che il 78% delle cellule sferoidi è sopravvissuto dopo la crioconservazione quando hanno usato la soluzione dell'Università del Wisconsin contenente il 15% di DMSO²⁸. Il rapporto di sopravvivenza cellulare è aumentato all'83% nello studio di Arai et ^al.29. Tuttavia, i risultati dopo la crioconservazione sono significativamente influenzati poiché le strutture 3D non possono mantenere le stesse caratteristiche e qualità. Inoltre, sono necessari reagenti privi di siero per le buone pratiche di fabbricazione in ambito farmaceutico e diagnostico. I flussi di lavoro tradizionali utilizzano un terreno contenente siero bovino fetale (FBS) e dimetilsolfossido (DMSO) per il metodo di congelamento lento, entrambi associati a svantaggi. FBS è un prodotto di derivazione animale e può avere variazioni di lotto. Il DMSO è un crioprotettore di grande successo, ma l'esposizione a lungo termine, specialmente durante lo scongelamento, potrebbe causare effetti citotossici^30,31.

Questo articolo descrive anche la metodologia di congelamento / scongelamento di interi organoidi o sferoidi mentre sono ancora in un idrogel. Nello studio vengono utilizzate due formule per il congelamento di organoidi e sferoidi: (1) 10% di DMSO contenente una soluzione di congelamento tradizionale (FS) e (2) un mezzo di crioconservazione privo di siero e DMSO. Questo mezzo di crioconservazione contiene componenti della matrice extracellulare, che sono diversi dalle formule attuali. La matrice extracellulare comprende due classi principali di macromolecole, proteoglicani e proteine fibrose, che sono essenziali per l'impalcatura fisica dei costituenti cellulari, ma avviano anche i processi necessari per la morfogenesi dei tessuti, la differenziazione e l'omeostasi 34,35,36,37,38,39,40 . I collageni forniscono resistenza alla trazione, regolano l'adesione cellulare, supportano la chemiotassi e la migrazione e dirigono lo sviluppo dei tessuti³⁷. Inoltre, le fibre di elastina forniscono rinculo ai tessuti che subiscono ripetuti allungamenti³⁸. Una terza proteina fibrosa, la fibronectina, dirige l'organizzazione della matrice extracellulare interstiziale e ha un ruolo cruciale nel mediare l'attaccamento cellulare e funziona come meccano-regolatore extracellulare³⁹. Du et al. hanno dimostrato l'effetto crioprotettivo dell'idrolizzato di collagene di pollo sul sistema modello naturale di actomiosina⁴¹. I loro risultati suggeriscono che l'idrolizzato di collagene può inibire la crescita dei cristalli di ghiaccio, ridurre la denaturazione e l'ossidazione delle proteine in modo simile ai crioprotettori commerciali e fornire una migliore struttura del gel dopo i cicli di congelamento-scongelamento. Pertanto, l'aggiunta di componenti della matrice extracellulare ai mezzi di crioconservazione fornisce un ambiente più sicuro e protettivo per il campione e supporta le strutture viventi per guarire dopo il congelamento-scongelamento.

Inoltre, il presente studio descrive un protocollo semplice per etichettare le membrane citoplasmatiche e i nuclei di organoidi e sferoidi vivi mentre sono ancora nell'idrogel.

1. Coltura di organoidi e sferoidi

1. Mettere l'idrogel sul ghiaccio durante la notte (in frigorifero o in una cella frigorifera) per scongelare.
2. Posizionare il dispositivo multiuso disponibile in commercio (MD; vedi Tabella dei materiali) nell'incubatore 1 giorno prima dell'esperimento (37 °C, 5% CO₂) per riscaldare.
3. Introdurre le punte sterili delle pipette a punta larga in frigorifero a 4 °C.
   NOTA: i passaggi 1.1-1.3 devono essere eseguiti il giorno 0 e i passaggi 1.4-1.11 devono essere eseguiti il giorno 1.
4. Posizionare l'idrogel sul ghiaccio in una cappa a flusso laminare per 15 minuti.
   1. Facoltativo: Diluire l'idrogel in mezzo di coltura cellulare freddo secondo le raccomandazioni del produttore.
5. Posizionare il tubo contenente un pellet di cellule HepG2 (linea cellulare di carcinoma epatocellulare ottenuta commercialmente; vedere Tabella dei materiali) su ghiaccio.
6. Piastra 30-35 μL di idrogel al 100% all'interno della nicchia del dispositivo preriscaldato per creare una goccia di gel.
7. Posizionare 10.000 cellule HepG2 al centro della parte superiore di ogni goccia di idrogel (Figura 2) e incubare per 15 minuti a 37 °C.
8. Coprire la goccia di idrogel con 200 μL di Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con siero bovino fetale al 10%.
9. Coprire il coperchio del MD nella posizione corretta per consentire il flusso di gas e posizionare il dispositivo nell'incubatore.
10. Nutrire le cellule con 200 μL di DMEM con il 10% di FBS a giorni alterni.
11. Controllare la crescita degli sferoidi al microscopio invertito (Figura 3). La formazione sferoidale inizia dopo il 3^° giorno. Il video 1 mostra la posizione degli sferoidi a diversi livelli in una cupola di idrogel.
    NOTE: Si consiglia vivamente di aspirare delicatamente il liquido che circonda l'idrogel e aggiungere lentamente il nuovo liquido all'ambiente per evitare di danneggiare le gocce di idrogel.

2. Colorazione con ematossilina ed Eosina di organoidi/sferoidi a montaggio intero in un idrogel

1. Riscaldare il fissativo (4% paraformaldeide; PFA), PBS ed Ematossilina (vedi Tabella dei materiali) a 37 °C.
2. Aspirare il mezzo che circonda la goccia di idrogel con una pipetta, aggiungere 100-200 μL di PFA al 4% per fissare e incubare per 15-20 minuti a 37 °C.
3. Aspirare il 4% di PFA e aggiungere 200 μL di PBS per lavare 3 volte per 5 minuti ciascuno a 37 °C. Quindi, aspirare il PBS e incubare con 200 μL di soluzione di ematossilina per 15-20 minuti a 37 °C.
4. Aspirare l'ematossilina e aggiungere 200 μL di dH₂O per lavare 3 volte per 10 minuti ciascuno a 37 °C. Aspirare il dH₂O e incubare con 200 μL di etanolo per 5-10 minuti a 37 °C.
5. Aspirare l'etanolo e incubare con 200 μL di Eosina (vedere Tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C. Aspirare l'Eosina e aggiungere 200 μL di dH₂O per lavare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
6. Aspirare il dH₂O e aggiungere 100 μL di glicerolo per coprire la goccia di idrogel come mezzo di montaggio.
7. Opzionale: Montare la nicchia con una copertina. Questo passaggio può essere omesso per evitare di spremere organoidi/sferoidi di dimensioni considerevoli.
8. Chiudere saldamente il coperchio di MD per evitare l'asciugatura fino all'esame. Il campione è stabile per l'esame per almeno 6 mesi.

3. Immunoistochimica di organoidi/sferoidi a montaggio intero in un idrogel

1. Riscaldare a 37 °C la soluzione per immunoistochimica ottenuta commercialmente (S-IHC; vedere Tabella dei materiali).
2. Incubare gli organoidi o sferoidi nell'idrogel con perossido di idrogeno al 3% (H 2 O 2) in 200 μL di dH₂Oper 5 minuti a 37 °C.
3. Aspirare la soluzione di perossido di idrogeno e lavare in dH₂O per 5 minuti a 37 °C. Aspirare il dH₂O e incubare due volte con 100 μL di S-IHC a 37 °C per 10 minuti ciascuno.
4. Aspirare l'S-IHC e incubare con 100 μL di anticorpo primario (vedere Tabella dei materiali) diluito in S-IHC per 1-2 ore a 37 °C (seguendo le raccomandazioni del produttore relative alla diluizione di lavoro).
5. Aspirare la soluzione anticorpale primaria e incubare con 100 μL di S-IHC 3x per 5 minuti ciascuno a 37 °C.
6. Aspirare 100 μL di S-IHC e incubare con un anticorpo secondario biotinilato (vedere Tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C.
7. Aspirare la soluzione anticorpale secondaria e incubare con 100 μL di S-IHC 3x per 5 minuti ciascuno a 37 °C. Aspirare l'S-IHC e incubare con 100 μL di streptavidina marcata con perossidasi di rafano (HRP) (vedere Tabella dei materiali) per 10 minuti a 37 °C.
8. Aspirare la streptavidina marcata HRP e incubare con 100 μL di S-IHC 3x per 5 minuti ciascuno a 37 °C.
9. Aspirare l'S-IHC e incubare con 100 μL di miscela di soluzione cromogeno DAB/AEC (vedere Tabella dei materiali) per 5-10 minuti a 37 °C.
10. Monitorare l'intensità della colorazione al microscopio ottico.
11. Lavare con dH 2 O 3x per₂minuti ciascuno.
12. Facoltativo: Incubare con 100 μL di ematossilina (vedere Tabella dei materiali) per controcolorazione nucleare per 5 minuti a 37 °C.
13. Aspirare l'ematossilina e lavare in dH₂O per 5 min.
14. Aspirare il dH₂O e coprire la goccia di idrogel con 100 μL di glicerolo come mezzo di montaggio.
15. Chiudere saldamente il coperchio del MD fino all'esame microscopico.
    NOTE: Il recupero dell'antigene e le fasi di blocco delle proteine sono omesse in questo protocollo poiché S-IHC elimina queste fasi.

4. Marcatura a immunofluorescenza di organoidi/sferoidi a montaggio intero in un idrogel

1. Riscaldare i seguenti materiali a 37 °C: 4% PFA, PBS, S-IF, soluzione anticorpale primaria in S-IF, soluzione anticorpale secondaria in S-IF, colorante nucleare e glicerolo (vedere Tabella dei materiali).
2. Aspirare il terreno di coltura cellulare e fissare con 200 μL di PFA al 4% per 15-30 minuti a 37 °C. Aspirare il fissativo e lavare in S-IF 3x per 10 minuti ciascuno a 37 °C.
3. Aggiungi dH₂O sul lato che circonda la nicchia per fornire umidità durante i passaggi successivi.
4. Aspirare l'S-IF che circonda la goccia di idrogel e incubare la goccia di idrogel con 100 μL di soluzione anticorpale primaria (vedere Tabella dei materiali) in S-IF per 30-60 minuti a 37 °C.
5. Aspirare la soluzione anticorpale primaria e lavare in S-IF 3 volte per 10 minuti ciascuno a 37 °C.
6. Aspirare l'S-IF e incubare con 100 μL di soluzione anticorpale secondaria (vedere Tabella dei materiali) in S-IF per 30-60 minuti a 37 °C al buio.
7. Aspirare la soluzione anticorpale secondaria e lavare con PBS 3x per 10 minuti ciascuno a 37 °C al buio.
8. Aspirare il PBS e incubare con 100 μL di colorazione di DNA nucleare contenente mezzo di montaggio o glicerolo a 37 °C al buio.
9. Riempire la nicchia con glicerolo per evitare l'essiccazione.
10. Opzionale: coprire la nicchia con un coprivetrino. Questo passaggio può essere omesso per evitare di spremere gli organoidi / sferoidi.
11. Chiudere ermeticamente il MD. I campioni in MD possono essere conservati a 4 °C al buio per almeno 6 mesi con una minima perdita di fluorescenza.
12. Utilizzare le seguenti impostazioni per l'esame microscopico confocale: impostare il valore stenopeico di tutti i canali su 20,1, mantenere la costante master di guadagno a 550 per 488 nm, 485 per 550 nm e 450 per 594 nm, mantenere costante la potenza del laser per tutti gli esperimenti e la percentuale più bassa a 2,0.
    NOTE: Anticorpi primari: Anti-Na-K ATPasi (1:100), Anti-Arginasi (1:50), Anti-Albumina (1:50), Anti-Beta-galattosidasi (1:25), Anticorpo Antimitocondriale (1:100), Anticorpo Anti-Golgi (1:50), Anti-Citocheratina 5 (1:100), Anticorpo Ov6 (1:100). Anticorpi secondari: Goat anti-Rabbit IgG (H+L)- 488, Goat anti-Rabbit IgG (H+L)-550, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-488, Goat anti-Mouse IgG (H+L)-550, Goat anti-Chicken IgY(H+L)-647. La diluizione per tutti gli anticorpi secondari è 1:100. Inoltre, viene utilizzato anche FITC-Phalloidin (1:100), un anticorpo coniugato (vedi Tabella dei materiali).

5. Marcatura della membrana plasmatica e del nucleo di organoidi e sferoidi viventi in un idrogel

1. Preparare la soluzione di etichettatura contenente agglutinina di germe di grano fluorurato Alexa (5,0 μg/ml) e Hoechst (2 μM) nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS), secondo le raccomandazioni del produttore (vedere la tabella dei materiali), e riscaldare fino a 37 °C.
2. Aspirare il terreno di coltura cellulare e aggiungere 100 μL di soluzione di etichettatura per coprire la goccia di idrogel. Incubare per 15-30 minuti a 37 °C.
3. Rimuovere la soluzione di etichettatura e lavare due volte in PBS 2x per 10 minuti ciascuno a 37 °C. Opzionale: Fissare con 200 μL di formaldeide al 4% per 15 minuti a 37 °C.
4. Coprire la goccia di idrogel con glicerolo come mezzo di montaggio. Opzionale: Montare la nicchia con un vetro di copertura.
5. Chiudere saldamente il coperchio del MD e tenerlo in frigorifero al buio fino all'esame microscopico confocale/a fluorescenza. È stabile per almeno 6 mesi.

6. Congelamento e scongelamento di organoidi/sferoidi interi in idrogel

1. Congelare gli organoidi seguendo i passaggi seguenti.
   1. Riscaldare la soluzione di congelamento ottenuta commercialmente (FS; vedi tabella dei materiali) a 37 °C.
   2. Aspirare delicatamente il terreno di coltura cellulare che circonda la cupola di idrogel.
   3. Aggiungere delicatamente 200 μL di FS. Incubare il campione con FS a 37 °C per 1 ora.
   4. Chiudere saldamente il coperchio del dispositivo e inserirlo in una scatola di schiuma. Collocare questa scatola di schiuma in un'altra scatola di schiuma, come mostrato nella Figura supplementare 3. Chiudere ermeticamente entrambe le scatole di schiuma. Due scatole di schiuma l'una all'interno dell'altra forniscono un intervallo di gradiente di raffreddamento della temperatura da 1 a 2 ° C / min del campione in un congelatore a -20 ° C.
   5. Posizionare la scatola a -20 °C per 2 ore. Trasferire la scatola in un congelatore a -80 °C e lasciarla per una notte.
   6. Estrarre il campione dalle scatole. Il campione nel MD può essere conservato nel congelatore a -80 °C per 6 mesi.
   7. Trasferire il MD che contiene il campione nel serbatoio di azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
2. Scongelare gli organoidi seguendo i passaggi seguenti.
   1. Estrarre il DM contenente il campione dal congelatore/serbatoio di azoto e porlo direttamente in un incubatore a 37 °C. Incubare per 1 h a 37 °C.
   2. Aggiungere 200 μL di terreno di coltura caldo alla nicchia (il rapporto tra FS e terreno di coltura cellulare è 1:1) e incubare per 30 minuti a 37 °C.
   3. Aggiungere altro terreno di coltura caldo alla nicchia (il rapporto tra FS e terreno di coltura cellulare è 1:2) e incubare per 30 minuti a 37 °C.
   4. Aspirare delicatamente la miscela media e FS. Procedere alla microscopia elettronica a scansione (fase 7) e alla microscopia elettronica a trasmissione (fase 8) dell'imaging degli organoidi/sferoidi a montaggio intero nell'idrogel.

7. Microscopia elettronica a scansione di organoidi/sferoidi a montaggio intero

1. Riscaldare la soluzione fissativa e post-fissativa di Karnovsky (vedi Tabella dei materiali) a temperatura ambiente (RT).
2. Aspirare il mezzo di coltura cellulare che circonda l'idrogel nel MD. Posizionare il campione nel MD su ghiaccio nella cappa a flusso laminare per 15 minuti.
3. Aspirare l'idrogel liquefatto che circonda gli organoidi/sferoidi molto delicatamente. Una quantità limitata di matrigel può rimanere nella nicchia per evitare di danneggiare e perdere il campione.
4. Fissare con il fissativo di Karnovsky (2% PFA, 2,5% glutaraldeide in 0,15 M Cacodylate buffer e 2 mM CaCl₂; vedi Tabella dei materiali) a RT per 1 ora.
5. Aspirare delicatamente il fissativo e lavare con acqua distillata (dH₂O) 3 volte per 15 minuti ciascuno.
6. Aspirare delicatamente il dH₂O e fissare con soluzione post-fissativa (tetrossido di osmio acquoso all'1% [OsO₄]; vedi Tabella dei materiali) a RT per 1 ora.
7. Aspirare delicatamente il post-fissativo e lavare con acqua distillata (dH₂O) 3 volte per 15 minuti ciascuno.
8. Disidratare in una serie graduata di etanolo (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96%, 100%), miscela di etanolo / acetone (1: 1; 1: 2) e acetone assoluto a RT per 15 minuti ciascuno.
9. Asciugare con un essiccatore a punti critici.
10. Rivestire il campione nel dispositivo con oro/palladio a 6 nm utilizzando un rivestimento sputter (vedi Tabella dei materiali) per 90 s.
11. Osservare al microscopio elettronico a scansione con un rilevatore elettronico secondario a 2-3 kV in modalità vuoto (5 x ^10-6 mA). Scatta immagini con una distanza di lavoro di 8,1-8,2 mm e con ingrandimenti 675x, 1050x e 1570x.
    NOTE: Tutti i passaggi vengono eseguiti nel MD. Utilizzare 200-250 μL di soluzione per ogni passaggio.

8. Microscopia elettronica a trasmissione di organoidi/sferoidi a montaggio intero in idrogel

1. Riscaldare il fissativo di Karnovsky a 37 °C. Aspirare il mezzo di coltura cellulare che circonda l'idrogel nel MD.
2. Fissare il campione con il fissativo di Karnovsky a RT per 1 ora. Lavare con dH₂O 3x per 15 minuti ciascuno.
3. Post-fix con OsO₄ acquoso al 2% e ferrocianuro di potassio al 2,5% a RT per 45 min. Lavare con dH₂O 3x per 10 minuti ciascuno.
4. Incubare in tiocarboidrazide allo 0,5% (TCH; vedi tabella dei materiali) a RT per 30 minuti. Lavare con dH₂O 3x per 10 minuti ciascuno.
5. Incubare in_{OsO 4} acquoso al 2% a RT per 30 min. Lavare con dH₂O 3x per 10 minuti ciascuno.
6. Incubare in soluzione di acetato di uranile al 2% (vedi tabella dei materiali) a RT per 1 ora.
   NOTA: In questa fase, gli sferoidi possono essere mantenuti a 4 °C durante la notte.
7. Incubare in soluzione di aspartato di piombo (vedi tabella dei materiali) a 60 °C per 45 min. Lavare con dH₂O 3x per 10 minuti ciascuno.
8. Disidratare in una serie graduata di etanolo (50%, 70%, 90%, 100% [x2]) e acetone assoluto a RT per 15 minuti ciascuno.
9. Trattare con una miscela di (1:1; 1:2) acetone/resina Epon e resina Epon pura (vedi Tabella dei materiali) a RT per 2 ore ciascuno.
10. Polimerizzare la resina a 60 °C durante la notte (minimo 16 h). Dopo la polimerizzazione, rimuovere il blocco di resina dal MD, come mostrato nella Figura supplementare 4.
11. Attaccare il blocco di resina a uno più grande con una colla di resina. Tagliare il blocco e raggiungere la posizione di organoidi o sferoidi.
12. Ottieni sezioni semisottili (1.000 nm) e ultrasottili (60 nm) usando un ultramicrotomo (vedi Tabella dei materiali).
13. Posizionare le sezioni ultrasottili su griglie di rame a 100 maglie e osservare al microscopio elettronico a scansione con un rivelatore STEM ad una tensione accelerata di 30 kV. Cattura immagini con una distanza di lavoro di 44 mm e con ingrandimenti 2580x, 5020x e 6060x.
    NOTE: Utilizzare 200-250 μL di soluzione per ogni passaggio. I passaggi 8.1-8.10 vengono eseguiti nel MD.

Il presente articolo rappresenta un dispositivo multiuso (MD) e integra le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la colorazione istologica, la colorazione immunoistochimica, l'etichettatura con immunofluorescenza, il rivestimento e la lavorazione di interi organoidi o sferoidi mentre sono ancora in un idrogel in un unico ambiente dal design univoco. L'attuale studio è stato progettato per preparare sferoidi per il cancro del fegato HepG2 in 35 gocce di idrogel in 35 MD. Gli esperimenti sono stati condotti in triplice copia per garantire l'accuratezza. Inoltre, gli organoidi polmonari nei medici sono stati etichettati immunofluorescenti come esempio per dimostrare i risultati delle attuali metodologie per gli studi sugli organoidi.

La Figura 1 mostra uno sguardo ravvicinato al dispositivo contenente una cupola di idrogel. Le dimensioni e la forma della nicchia sono progettate per fornire un ambiente protettivo per l'idrogel contenente gli organoidi / sferoidi e salvare i reagenti utilizzati durante i vari processi. Inoltre, la parte laterale del dispositivo che circonda la nicchia può essere utilizzata come camera di umidità durante gli esperimenti di immunocolorazione. Il mezzo per alimentare il campione può variare tra 100-200 μL, a seconda dell'altezza della goccia di idrogel. L'attuale studio si concentra sul metodo a cupola poiché molti idrogel, componenti commerciali della matrice extracellulare ed estratti di membrana basale consentono all'utente di preparare gocce. Tuttavia, è anche possibile riempire la nicchia del MD con l'idrogel e quindi seminare le cellule al suo interno per generare organoidi / sferoidi. Questo metodo potrebbe essere preferito se la viscosità della matrice non consente la preparazione di cupole o se l'esperimento include grandi volumi di organoidi. Il tipo di idrogel e il rapporto idrogel/mezzo per la preparazione delle gocce possono variare a seconda del tipo di cellula, del disegno sperimentale e del mezzo. Figura 1  rappresenta anche il design del dispositivo che consente di studiare gli organoidi / sferoidi sotto microscopi elettronici a campo chiaro, confocali e a scansione mentre gli organoidi / sferoidi sono ancora nel loro ambiente nativo in vitro .

La Figura 2 presenta come seminare le cellule in un idrogel ed esaminare lo sviluppo di sferoidi o organoidi. Anche il design e le dimensioni del dispositivo multiuso sono stati presentati in quella figura. Il video 1 mostra la posizione degli sferoidi in crescita 3D in un idrogel. La Figura 3 rappresenta immagini dal vivo di sferoidi in crescita dal giorno 3 al giorno 21. Il tempo per la formazione di sferoidi e organoidi può variare a seconda della natura del campione. Ad esempio, gli sferoidi delle cellule HepG2 e delle cellule HEK si sono formati entro 3 giorni, mentre la formazione di organoidi epatici e biliari è durata 2 settimane durante gli esperimenti.

Gli sferoidi colorati con ematossilina ed eosina sono visibili nella Figura 4. L'immagine rappresenta sferoidi ben conservati e omogeneamente colorati in diverse dimensioni e fusioni di sferoidi. Le cellule vive al centro degli sferoidi sono degne di nota. L'immagine mostra anche le delicate connessioni tra le cellule di diversi sferoidi. Queste connessioni fragili non potevano essere visualizzate dopo i flussi di lavoro tradizionali poiché il trasferimento, il pipettaggio o la centrifugazione le avrebbero danneggiate. Figura 5  dimostra immunocolorazione degli sferoidi con l'anticorpo specifico per l'Arginasi, uno dei marcatori più comuni per la diagnosi e la prognosi del carcinoma epatocellulare42,43. Le micrografie rivelano cellule tumorali epatiche differenziate e indifferenziate negli stessi sferoidi. Questa figura contiene immagini con e senza controcolorazione con ematossilina. I ricercatori potrebbero scegliere di omettere la controcolorazione con l'ematossilina nei casi in cui sarebbe difficile differenziare le aree etichettate in una struttura 3D.

La Figura 6 rappresenta un altro protocollo semplice per la visualizzazione a montaggio completo di organoidi/sferoidi viventi in un idrogel: colorazione della membrana cellulare viva e del nucleo. La metodologia consente la stessa densità di etichettatura nella periferia e nel centro, mostrando una penetrazione completa del reagente. La Figura 7, la Figura 8 e la Figura 9 mostrano immagini rappresentative di sferoidi marcati rispettivamente con uno, due o tre anticorpi. Da uno a tre anticorpi primari sono diluiti in S-IF contemporaneamente. Allo stesso modo, da uno a tre anticorpi secondari corrispondenti adatti all'esperimento vengono diluiti simultaneamente in S-IF. Il protocollo di immunomarcatura consente ai ricercatori di marcare le strutture 3D entro 4-6 ore senza perderle o danneggiarle. Lo sfondo è trasparente e la tecnologia utilizzata qui non richiede ulteriori metodi / soluzioni di clearing, recupero dell'antigene o blocco. Il metodo consente inoltre ai ricercatori di etichettare il campione con più anticorpi in un unico passaggio. In altre parole, l'utente prepara una soluzione contenente da uno a tre anticorpi primari e un'altra soluzione corrispondente a uno o tre anticorpi secondari. Il protocollo qui descritto elimina le fasi di etichettatura sequenziale con anticorpi diversi nelle metodologie convenzionali.

La figura 10 rappresenta le immagini microscopiche elettroniche di scansione e trasmissione degli sferoidi. La prima riga mostra immagini di interi sferoidi nel MD sotto un microscopio elettronico a scansione. La seconda fila contiene immagini microscopiche elettroniche di trasmissione di sferoidi dopo la preparazione dei blocchi di resina contenenti sferoidi a montaggio intero nel MD, nonché immagini di sferoidi sezionati e colorati. Gli organelli citoplasmatici ben conservati e altre caratteristiche ultrastrutturali delle cellule dimostrano l'efficacia di questo semplice protocollo, che protegge la struttura 3D dell'intero campione. L'MD consente inoltre ai ricercatori di congelare e scongelare i campioni interi in un idrogel. Grafico 11  dimostra le cupole di idrogel e gli sferoidi ad un ingrandimento maggiore prima e dopo il congelamento. L'irregolarità ai confini della cupola di idrogel è notevole. Tuttavia, la rotondità degli sferoidi crioconservati è quasi stabile dopo lo scongelamento rispetto agli sferoidi prima del congelamento. I metodi di etichettatura della membrana cellulare viva e del nucleo vengono applicati anche 48 ore dopo lo scongelamento per dimostrare come la procedura di congelamento / scongelamento abbia influenzato l'architettura 3D, la membrana cellulare e la vitalità cellulare. La soluzione di congelamento tradizionale contenente dimetilsolfossido e l'attuale soluzione di nuova formulazione, SF, dimostrano risultati simili. Più del 75% delle strutture 3D potrebbe sopravvivere in questo protocollo. Tuttavia, sono necessari ulteriori esperimenti per rivelare gli effetti collaterali a lungo termine di ciascuna formulazione su organoidi e sferoidi.

Le Tabelle 1 e 2 confrontano i flussi di lavoro tradizionali con quelli qui descritti in base al numero di passaggi, alla durata e alla produzione di rifiuti (ad esempio, il numero totale di guanti di plastica, punte per pipette, pipette sierologiche, provette per centrifughe, provette per microcentrifuga, recipienti per colture cellulari, crioviali, ecc. per ciascun flusso di lavoro).

La Figura 1 supplementare rappresenta i passaggi sequenziali che possono essere eseguiti schematicamente in un singolo MD. La figura supplementare 2 mostra i risultati degli esperimenti progettati per confrontare la vitalità cellulare, la tossicità e i tassi di proliferazione delle cellule HepG2 in un MD o in un piatto tradizionale con fondo di vetro. La figura supplementare 3 mostra le scatole di schiuma che sono state utilizzate per congelare i campioni nei MD. La figura supplementare 4 riassume i passaggi per estrarre un blocco di resina da un MD. La figura 5 supplementare include immagini di organoidi delle vie aeree che sono stati marcati con immunofluorescenti e quindi visualizzati mentre erano ancora nei MD. Allo stesso modo, Video 2 dimostra due organoidi delle vie aeree marcati con immunofluorescenti in un MD. Infine, la figura supplementare 6 è un grafico che confronta l'intensità media dell'intensità di marcatura della membrana cellulare negli sferoidi vivi prima e dopo il congelamento utilizzando il flusso di lavoro tradizionale e il flusso di lavoro descritto qui. Il software Image J è stato utilizzato per l'analisi.

Figura 1: Il dispositivo di coltura cellulare multiuso (MD). (A) La nicchia (N), la parte centrale del dispositivo, è progettata per creare un ambiente protettivo per gli organoidi/sferoidi cresciuti in una goccia di idrogel (D) durante i processi sequenziali. Il lato (S), la parte circostante della nicchia, può essere utilizzato come camera umidificatore durante gli esperimenti di immunocolorazione. (B) Il centro trasparente nel coperchio consente all'utente di osservare gli organoidi/sferoidi quando il dispositivo è chiuso. (C) La cupola di idrogel contenente organoidi nel MD può essere colorata o incorporata in un blocco di resina per microscopia elettronica a trasmissione. Il coperchio include anche la nicchia (N) per la metodologia della goccia sospesa. Le dimensioni e il design del dispositivo consentono all'utente di esaminare gli organoidi/sferoidi sotto (D) microscopi elettronici a campo chiaro, (E) confocale e (F) a scansione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Semina di cellule all'interno di un idrogel. (A) Il pellet cellulare nella pipetta viene inserito nella parte superiore della cupola. Dopo 3-5 giorni, gli sferoidi diventano visibili nella cupola, specialmente alla periferia della goccia. (B) Quattro immagini dal vivo di sferoidi in crescita da ogni quarto in una cupola sono state catturate e unite. Barra della scala = 200 μm. (C)Il design e le dimensioni (in centimetri) del dispositivo multiuso (MD). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Sviluppo di sferoidi in una goccia di idrogel dal giorno 3 al giorno 21. Barra di scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Sferoidi a montaggio intero colorati con ematossilina ed eosina all'interno del MD. Visualizzazione delle connessioni tra le cellule situate negli sferoidi adiacenti o fusori. I delicati processi tra le cellule (frecce) sono visibili poiché l'intero campione montato nell'idrogel viene fissato, colorato ed esaminato senza danneggiare le strutture di crescita 3D. Barra della scala: giorno 3, giorno 9 = 50 μm; Giorno 7, Giorno 17 = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Colorazione immunoistochimica di sferoidi a montaggio intero nell'idrogel all'interno del MD. I campioni sono stati immunocolorati con un anticorpo specifico per l'arginasi. Le cellule arginasi positive (frecce rosse) e negative (frecce nere) sono viste negli sferoidi. Le immagini provengono da due esperimenti: (A-C) senza e (D-F) con controcolorazione con ematossilina. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 6: Immagine confocale di un organoide vivo nell'idrogel. Gli organoidi viventi sono stati etichettati con la membrana cellulare viva (WGA) e le macchie del nucleo (Hoechst). Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 7: Marcatura con immunofluorescenza di sferoidi a montaggio intero in un idrogel con un anticorpo e una colorazione nucleare (Hoechst). (A-C) Il pannello superiore mostra uno sferoide marcato con un anticorpo specifico per Na-K ATPasi nella membrana cellulare. (D-F) Il pannello inferiore dimostra la posizione di un altro anticorpo specifico per l'arginasi, una proteina citosolica specifica per il carcinoma epatocellulare, negli sferoidi del cancro del fegato. Durata del protocollo di colorazione: 6 h. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 8: Marcatura con immunofluorescenza di sferoidi a montaggio intero in un idrogel con due anticorpi e una colorazione nucleare (Hoechst). (A-C) Il pannello superiore mostra uno sferoide marcato con due anticorpi specifici per albumina e Ov6. Barra della scala = 5 μm. (D-F) Il pannello inferiore mostra la posizione della proteina alfa feto e Ov6 negli sferoidi del cancro del fegato. Barra della scala = 20 μm. Durata del protocollo di colorazione: 6 h. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 9: Marcatura a immunofluorescenza di sferoidi a montaggio intero in un idrogel con tre anticorpi e una colorazione nucleare (Hoechst). (A-E) Lo sferoide nel pannello superiore è marcato con anticorpi specifici per Arginasi, Na-K ATPasi e beta-galattosidasi. Barra della scala = 10 μm. (F-J) Il pannello centrale dimostra uno sferoide marcato con Ov6, beta-galattosidasi e proteina alfa-feto. Barra di scala = 20 μm. (K-O) Lo sferoide nel pannello inferiore è stato marcato con FITC-falloidina, anticorpo anti-mitocondriale e anticorpo anti-Golgi. Barra della scala = 20 μm. Si noti l'elevata specificità dell'etichettatura e lo sfondo ridotto. Durata del protocollo di colorazione: 6 h. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 10: Immagini al microscopio elettronico. (A-C) Scansione di immagini al microscopio elettronico di interi sferoidi nell'idrogel nel MD. Barra di scala = 10 μm. (D-F) Le caratteristiche ultrastrutturali delle cellule in uno sferoide sono state visualizzate anche al microscopio elettronico a trasmissione. Barre della scala: (D) = 4 μm; (E,F) = 2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 11: Immagini dal vivo degli sferoidi prima e dopo il congelamento. (A-F) L'irregolarità dei bordi delle cupole di idrogel è evidente dopo il congelamento. Tuttavia, le dimensioni e la rotondità degli sferoidi rimangono simili. (F) La migrazione cellulare sulla superficie della coltura può essere osservata dopo lo scongelamento. (G-L) La membrana cellulare viva (WGA) e la colorazione del nucleo (Hoechst) dimostrano vitalità cellulare simile e membrane cellulari intatte prima e dopo il congelamento dell'intero sferoide in un idrogel nel MD. Scala basr: (A,B,D,E) = 200 μm; (C,F,G-L) = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Confronto tra il numero di fasi, il tempo e la produzione di rifiuti tra il flusso di lavoro tradizionale e quello nuovo durante un esperimento a breve termine.

Tabella 2: Confronto tra l'immunomarcatura convenzionale e il nuovo protocollo di immunomarcatura.

Video 1: Serie temporali di immagini a diversi livelli di un idrogel contenente sferoidi al microscopio a contrasto a fase invertita. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: Struttura 3D di due organoidi delle vie aeree marcati con anticorpi per citocheratina 5 e DAPI. Clicca qui per scaricare questo video.

Figura supplementare 1: Panoramica dell'esperimento. Questo schema mostra le fasi sperimentali sequenziali per la crescita e l'esame di organoidi interi in un idrogel. La tecnologia qui descritta consente di coltivare, congelare, scongelare, etichettare ed esaminare gli organoidi sotto diversi microscopi. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 2: Confronto della vitalità cellulare, della tossicità e dei tassi di proliferazione delle cellule HepG2 in un piatto tradizionale con fondo di vetro o in un MD. Le cellule HepG2 sono state coltivate su (A) un tradizionale piatto di coltura cellulare con fondo di vetro o (B) in un MD per confrontare la vitalità e la tossicità cellulare. (C) Il test di esclusione del blu di Trypan è stato utilizzato per dimostrare la fattibilità. Barra della scala = 20 μm. I risultati sono stati confrontati utilizzando saggi di citotossicità CCK8 (D-E) e proliferazione cellulare (F). Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 3: Disposizione delle due scatole di schiuma. Una scatola di schiuma viene posizionata all'interno dell'altra durante il lento processo di congelamento dell'intero organoide o sferoide nel MD. *indica le due caselle. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 4: Passaggi che dimostrano come rimuovere il blocco di resina dal MD dopo la polimerizzazione della resina. (A) Il blocco di resina che circonda gli sferoidi o gli organoidi viene preparato all'interno della nicchia MD e quindi polimerizzato. (B-D) Quindi, con un'apposita asta sottile, il blocco di resina viene spinto per rimuoverlo dalla nicchia. (E) Successivamente, il blocco di resina, con la plastica sottostante, viene rimosso. (F-G) Infine, un paio di pinzette viene utilizzato per separarli se il blocco è ancora attaccato alla plastica. (H) Il blocco è pronto per il sezionamento sottile. Gli organoidi o sferoidi a montaggio intero nel blocco di resina (*) sono pronti per il sezionamento per la microscopia elettronica a trasmissione. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 5: organoidi delle vie aeree che sono stati marcati immunofluorescenti e poi visualizzati mentre erano ancora in MD. (A-C) Il pannello superiore mostra organoidi circolari delle vie aeree con un lume centrale. Il verde rappresenta le cellule progenitrici delle vie aeree che esprimono la citocheratina 5 nell'anello più esterno dell'organoide e il blu rappresenta i nuclei. Barra di scala = 50 μm. (D-F) Il pannello inferiore mostra l'immagine tridimensionale dei due organoidi affiancati nei filtri (D) DAPI e (E) Alexa 488, nonché l'immagine (F) unita. Barra di scala = 100 μm. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare 6: Confronto della densità di marcatura sulle membrane cellulari vive delle cellule. Il grafico confronta gli sferoidi prima e dopo il congelamento utilizzando il flusso di lavoro tradizionale e attualmente adottato. L'analisi è stata eseguita utilizzando il software di analisi delle immagini Image J. Abbreviazioni: IntDen = Densità integrata (intensità di fluorescenza negli sferoidi selezionati). CTCF = Fluorescenza cellulare totale corretta. Clicca qui per scaricare questo file.

Ranan Gulhan Aktas possiede domande di brevetto MD, S-IHC, S-IF e FS. Olgu Enis Tok è stata coinvolta nello sviluppo di questi prodotti. Olgu Enis Tok e Gamze Demirel sono membri del team di ricerca e sviluppo della società denominata Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut e Ozgecan Kayalar non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.