Il presente studio descrive le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la lavorazione, la colorazione, l'etichettatura e l'esame di interi sferoidi e organoidi sotto vari microscopi, mentre rimangono intatti in un idrogel all'interno di un dispositivo multiuso.
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Articolo metodologico
Coltivazione, congelamento, lavorazione e imaging di interi organoidi e sferoidi mentre sono ancora in un idrogel
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi e gli sferoidi, strutture di crescita tridimensionale nei laboratori di coltura cellulare, stanno diventando sempre più riconosciuti come modelli superiori rispetto ai modelli di coltura bidimensionale, poiché imitano meglio il corpo umano e hanno vantaggi rispetto agli studi sugli animali. Tuttavia, questi studi affrontano comunemente problemi di riproducibilità e coerenza. Durante i lunghi processi sperimentali - con trasferimenti di organoidi e sferoidi tra diversi vasi di coltura cellulare, pipettaggio e centrifugazione - queste strutture di crescita 3D sensibili e fragili sono spesso danneggiate o perse. In definitiva, i risultati sono significativamente influenzati, poiché le strutture 3D non possono mantenere le stesse caratteristiche e qualità. I metodi qui descritti riducono al minimo questi passaggi stressanti e garantiscono un ambiente sicuro e coerente per organoidi e sferoidi durante tutta la sequenza di lavorazione mentre sono ancora in un idrogel in un dispositivo multiuso. I ricercatori possono crescere, congelare, scongelare, elaborare, colorare, etichettare e quindi esaminare la struttura di organoidi o sferoidi sotto vari strumenti ad alta tecnologia, dai microscopi confocali a quelli elettronici, utilizzando un unico dispositivo multiuso. Questa tecnologia migliora la riproducibilità, l'affidabilità e la validità degli studi, pur mantenendo un ambiente stabile e protettivo per le strutture in crescita 3D durante la lavorazione. Inoltre, l'eliminazione dei passaggi stressanti riduce al minimo gli errori di gestione, riduce il tempo impiegato e diminuisce il rischio di contaminazione.
Introduzione
Il futuro della ricerca e della terapia cellulare risiede nelle colture cellulari 3D 1,2,3. I modelli organoidi e sferoidi colmano il divario tra esperimenti in vitro e modelli animali creando modelli migliori che imitano lo sviluppo, la fisiologia e le malattie del corpo umano 4,5,6,7,8,9. Tuttavia, la riproducibilità e la ripetibilità di questi modelli rimangono impegna....
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Protocollo
1. Coltura di organoidi e sferoidi
- Mettere l'idrogel sul ghiaccio durante la notte (in frigorifero o in una cella frigorifera) per scongelare.
- Posizionare il dispositivo multiuso disponibile in commercio (MD; vedi Tabella dei materiali) nell'incubatore 1 giorno prima dell'esperimento (37 °C, 5% CO2) per riscaldare.
- Introdurre le punte sterili delle pipette a punta larga in frigorifero a 4 °C.
NOTA: i passaggi 1.1-1.3 devono essere eseguiti il giorno 0 e i passaggi 1.4-1.11 devono essere eseguiti il giorno 1. - Posizionare l'idrogel sul ghiaccio in una cappa a flusso laminare per 15 m....
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Risultati
Il presente articolo rappresenta un dispositivo multiuso (MD) e integra le metodologie per la coltivazione, il congelamento, lo scongelamento, la colorazione istologica, la colorazione immunoistochimica, l'etichettatura con immunofluorescenza, il rivestimento e la lavorazione di interi organoidi o sferoidi mentre sono ancora in un idrogel in un unico ambiente dal design univoco. L'attuale studio è stato progettato per preparare sferoidi per il cancro del fegato HepG2 in 35 gocce di idrogel in 35 MD. Gli esperimenti sono .......
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Discussione
L'MD, integrando le formulazioni e i protocolli qui descritti, facilita la crescita 3D rapida e spontanea di organoidi e sferoidi in un ambiente più controllato e continua l'esperimento nelle stesse condizioni. Il campione rimane nello stesso ambiente durante l'intero processo e quasi il 100% delle architetture di crescita 3D rimangono intatte nel contenitore. Ciò migliora l'omogeneità durante gli esperimenti sequenziali e consente un periodo di coltura prolungato. Inoltre, il numero di passaggi durante la lavorazione di.......
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Dichiarazioni
Ranan Gulhan Aktas possiede domande di brevetto MD, S-IHC, S-IF e FS. Olgu Enis Tok è stata coinvolta nello sviluppo di questi prodotti. Olgu Enis Tok e Gamze Demirel sono membri del team di ricerca e sviluppo della società denominata Cellorama. Yusuf Mustafa Saatci, Zeynep Akbulut e Ozgecan Kayalar non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.
Ringraziamenti
Siamo grati a Dale Mertes dell'Università di Chicago per la preparazione dei diagrammi, al Dr. Mehmet Serif Aydin per il suo supporto tecnico presso l'Istanbul Medipol University Research Institute for Health Sciences and Technologies, e al Dr. Rana Kazemi della Maltepe University per la redazione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Etanolo assoluto (EtOH) | Merck | 8187602500 | Diluire in dH2O per fare una soluzione al 30%, 50%, 70%, 80%, 90% e 96% e conservare presso RT |
| Acetone | Merck | 8222512500 | Store presso RT |
| Alexa agglutinina di germe di grano fluorescente e Hoechst nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) | Invitrogen | I34406 | Image-IT LIVE Membrana plasmatica e kit di marcatura nucleare, conservare a -20 gradi |
| C Alfa-1-Fetoproteina (AFP) Anticorpo policlonale concentrato e prediluito | Biocare Medical | CP 028 A Conservare | a +4 ° C |
| Anticorpo anti-albumina | Abcam | EPR20195 | Negozio a +4 gradi C, Diluizione: 1:50 |
| Anticorpo anti-beta galattosidasi, Pollo policlonale | Abcam | 134435 | Conservare a +4 gradi C, Diluizione: 1:25 |
| Anti-citocheratina 5 | Abcam | 53121 | Conservare a +4 ° C, Diluizione: 1:100 |
| Arginase-1 Anticorpo monoclonale di coniglio concentrato e prediluito | Biocare Medical | ACI 3058 A, B | Conservare a +4 ° C, Diluizione: 1:50 |
| Cloruro di calcio (CaCl2) | Sigma | C1016-500G | Sciogliere nel fissativo di Karnovsky per ottenere 2 mM CaCl2; conservare presso RT |
| Cell Counting Kit 8 (WST-8 / CCK8) | Abcam | ab228554 | |
| Provette da centrifuga, 15 mL | Nest | 601051 | |
| Provette da centrifuga, 50 mL | Armadio | ||
| Classe II Bio II Advance Plus | Telstar | EN12469 | |
| Incubatore CO2 | Panasonic | KM-CC17RU2 | |
| Griglie in rame | Microscopia elettronica Scienze | G100-Cu | Sezioni ultrasottili messe sulle griglie; Essiccatore per punti critici a maglia quadrata da 100 linee/pollice |
| Leica | EM CPD300 | Per l'essiccazione di campioni biologici per applicazioni SEM in | |
| miscela di soluzioni cromogeniche assolute DAB/AEC | Negozio Sigma Aldrich | AEC101 | a +4 C |
| Coltello diamantato | Diatome | Ultra 45°, 40-US | Utilizzare per sezioni ultrasottili per TEM |
| Dimetil solfossido per biologia molecolare | Biofroxx | 67-68-5 | |
| Plastica monouso Pasteur Pippettes | Nest DMEM | ||
| - Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 41966-029 | Conservare a +4 ° C |
| Eosina Y Soluzione alcolica Bright | Slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Resina Epon | Sigma | 45359-1EA-F | Kit medio per inclusione epossidica, conservare a +4 gradi C |
| Siero fetale bovino con additivo fortificante | Pan Biotech | P30-3304 | Conservare a +4 ° C |
| Soluzione di congelamento (FS) | Cellorama | CellO-F | Conservare a +4 gradi C |
| Macchina per coltelli in vetro | Leica | EM KMR3 | Per realizzare coltelli in vetro in 8 mm di spessore |
| Strisce di coltelli in vetro (Dimensioni 8 mm x 25,4 mm x 400 mm) | Leica | 7890-08 | Utilizzare per sezioni ultrasottili o semisottili per TEM |
| Soluzione acquosa di glutaraldeide, grado EM, 25% | Scienze della microscopia elettronica | 16210 | Diluire in dH2O per ottenere una soluzione al 2,5% e conservare a +4 ° C |
| Soluzione di glicerolo | Sigma Aldrich | 56-81-5 | Conservare a -20 C, Diluizione: 1:100 |
| Anticorpo secondario IgY (H+L) anti-pollo di capra, Alexa, 647 | Invitrogen | A32933 | Conservare a RT |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo di capra, DyLight, 488 | Invitrogen | 35502 | Conservare a +4 ° C, Diluizione :1:50 |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-topo di capra, DyLight, 550 | Invitrogen | 84540 | Conservare a +4 gradi; C, Diluizione :1:50 |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, DyLight, 488 | Invitrogen | 35552 | Conservare a +4 gradi; C, Diluizione :1:50 |
| Anticorpo secondario IgG (H+L) anti-coniglio di capra, DyLight, 550 | Invitrogen | 84541 | Conservare a +4 gradi; C |
| Ematossilina Harris | Bright Slide | 2.BS01-104-1000 | |
| Cellule HepG2 | ATCC | HB-8065 | Conservare in serbatoio di azoto |
| Anticorpo umano / ratto OV-6 Clone monoclonale di topo IgG1 # OV-6 | R & D Systems | MAB2020 | Store a -20 gradi C |
| Hydrogel | Corning 354248 | Matrigel, matrice a membrana basale ad alta concentrazione (HC), senza LDEV, 10 mL, conservare a -20 ° C | |
| Hydrogel | Corning | 354234 | Matrigel, matrice di membrana basale, senza LDEV, 10 mL, conservare a -20 ° C |
| Idrogel | ThermoFischer Scientific | A1413201 | Geltrex, senza LDEV Fattore di crescita ridotto Membrana basale |
| Matrice Idrogel | Biotechne, R& D Systems | BME001-01 | Cultrex Ultramatrix RGF BME, conservare a -20 gradi C |
| Fissativo | %2 PFA, %2,5 glutaraldeide in tampone cacodilato 0,15 M, 2 mM CaCl2; preparare fresco; utilizzare per TEM & Campioni SEM | ||
| Acido L-aspartico | Sigma | 11189-100G | Conservare presso RT |
| Soluzione di aspartato | Sciogliere 40 mg di acido aspartico in 10 mL di ddH2O e aggiungere 66 mg di nitrato di piombo. Stabilizzare la soluzione a 60 gradi C e regolare il pH a 5; preparare nuovi | ||
| Microscopia elettronica | nitrato di piombo | Scienze 17900 | Negozio su RT |
| Microscopio confocale Leica | Leica DMi8 | ||
| LSM 700 Microscopio confocale a scansione laser | Zeiss | ||
| Lettore di micropiastre | Biotek Synergy | ||
| Dispositivo multiuso (MD) | Cellorama | CellO-M | |
| Colorante di DNA nucleare | Invitrogen | H3569 | Hoechst 33258, pentaidrato (bis-benzimide) - 10 mg/mL soluzione in acqua, conservare a +4 gradi; C |
| Colorante per DNA nucleare | ThermoFischer Scientific | 62248 | Soluzione DAPI, Conservare a +4 gradi C |
| Tetrossido di osmio (OsO4), 4% | Scienze della microscopia elettronica | 19190 | Diluire in dH2O per fare una soluzione al 2%; conservare a +4 ° C e in contenitore ermetico; proteggere la luce |
| Ov6 anticorpo | R& Sistemi D | MAB2020 | Negozio a +4 gradi C |
| Soluzione di paraformaldeide (PFA), 4% | Sigma | 1.04005.1000 | Sciogliere il 4% di PFA in dH2O e far bollire, raffreddare e aliquotare; conservare a -20 ° C |
| Soluzione di paraformaldeide 4% in PBS, 1 L | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | Conservare a +4 ° C |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), compresse | MP Biomedicals, LLC | 2810305 | |
| Soluzione | %2 OsO4, %2,5 Ferrocianuro di potassio in dH2O; preparare una | ||
| soluzione acquosa di ferrocianuro di potassio fresco, 5% | Microscopia elettronica Sciences | 26603-01 | Negozio su RT |
| Primovert - Microscopio a campo chiaro invertito - ZEISS | Zeiss | Art.-Nr.: 491206-0001-000 | |
| Provette per microcentrifuga a fondo tondo, 2 mL | Nest | 620611 | |
| Microscopia elettronica a scansione con attacco STEM | Zeiss | GeminiSEM 500 | Utilizziamo il rivelatore di elettroni secondari (SE) Inlens a 2-3 kV per le micrografie elettroniche a scansione e il rivelatore aSTEM a 30 kV per le micrografie elettroniche a trasmissione. |
| Confezione da laboratorio anti-polivalente SensiTek HRP | ScyTek Laboratories | SHP125 | Negozio a +4 gradi C |
| tampone cacodilato di sodio, 0,4 M, pH 7,2 | Microscopia elettronica Sciences | 11655 | Diluire in dH2O per ottenere 0,2 M e conservare a +4 ° C |
| Anticorpo SADIO/POTASSIO ATPasi alfa 1 [M7-PB-E9] | GeneTex | GTX22871 | Conservare a -20 ° |
| C Soluzione per la marcatura in immunofluorescenza (S-IF) | Cellorama | CellO-IF | Conservare a +4 gradi Soluzione C |
| per immunoistochimica (S-IHC) | Cellorama | CellO-P | Conservare a +4 gradi; C |
| Dispositivo di rifilatura dei campioni | Leica | EM TRIM2 | Per preparare il blocco del campione di epon all'ultramicrotomo |
| Sputter coater | Leica | EM ACE200 | Rivestire i campioni SEM con oro/palladio a 6 nm per 90 s |
| Tiocarboidrazide (TCH) | Sigma | 223220-5G | Diluire in dH2O per ottenere una soluzione allo 0,5% e filtrare con 0,22 &; m filtro a membrana; negozio presso RT; preparare una soluzione fresca |
| di Trypan Blue, 0,4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultra gel super colla | Pattex | PSG2C | Per blocco epon polimerizzato con campione per supporto epon |
| block Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | Per preparare sezioni ultrasottili o semisottili di alta qualità per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) |
| Puntali per pipette universali, 10 &; L | Nest | 171215-1101 | |
| Puntali per pipette universali, 1000 &; L | Isolab | L-002 | |
| Puntali per pipette universali, 200 &; L | Nest | 110919HA01 | |
| Scienze al microscopio elettronico | acetato di uranile | 22400 | Diluire in dH2O per ottenere una soluzione al 2% e filtrare con 0,22 &; m filtro a membrana; tenere ben chiuso il contenitore di stoccaggio presso RT |
Riferimenti
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Nath, S., Devi, G. R.
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Ristampe e permessi
