Isolamento, attivazione ed espansione delle cellule T basate sulla flottazione da campioni di cellule mononucleate del sangue periferico umano utilizzando microbolle

Summary

L'obiettivo di questo studio è dimostrare la fattibilità della separazione basata sulla flottazione per isolare, attivare ed espandere le cellule T umane primarie.

Abstract

Il processo di isolamento delle cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per stabilire colture ex vivo è cruciale per la ricerca, i test clinici e le terapie basate sulle cellule. In questo studio, viene presentato un protocollo semplice e nuovo per isolare, attivare ed espandere le cellule T dalle PBMC ex vivo . Questo studio utilizza la tecnologia di selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) funzionalizzata per isolare e attivare le cellule T. In breve, il protocollo prevede la selezione positiva di cellule CD3⁺ da PBMC derivate da leukopak, seguita da una co-stimolazione di 48 ore con microbolle di streptavidina pre-coniugate anti-CD28-legate (SAMB) prima della trasduzione in piastre a 24 pozzetti. Le microbolle funzionalizzate offrono un'opportunità unica per attivare le cellule, portando a fenotipi proliferativi che consentono l'espansione con un esaurimento minimo. Questa tecnica offre un esaurimento ridotto perché le microbolle co-stimolatorie rimangono galleggianti e ritornano in cima al terreno di coltura, riducendo così la quantità di tempo in cui le cellule in espansione sono in contatto con i fattori co-stimolatori. I risultati indicano che le cellule T isolate e coltivate ricevono una stimolazione sufficiente per attivarsi e proliferare ma non in misura tale da portare a una sovraattivazione, che porta quindi all'esaurimento, come dimostrato dalla presenza di PD-1 eccessivo.

Introduction

Più di 500 studi clinici sulla terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-T sono attualmente condotti in tutto il mondo e quattro prodotti di terapia cellulare CAR-T sono disponibili sul mercato¹. Tuttavia, esistono ancora numerose esigenze di ricerca e produzione di cellule CAR-T che devono essere affrontate per migliorare l'efficacia, la scalabilità e il successo a lungo termine di queste terapie potenzialmente curative 2,3,4,5. La ricerca clinica e la produzione di cellule CAR-T adottive inizia con l'isolamento delle cellule T da un campione di sangue periferico e la successiva stimolazione, trasduzione ed espansione delle cellule isolate. Parametri come il recupero delle cellule T, la purezza e i segnali di attivazione/esaurimento richiedono un'attenta considerazione quando si scelgono le tecniche di isolamento e stimolazione cellulare per la ricerca e la produzione di cellule CAR-T ^3,4,6. È importante sottolineare che è necessario migliorare la persistenza terapeutica delle terapie cellulari CAR-T riducendo al minimo gli impedimenti biologici derivanti dagli attuali processi di produzione, come l'esaurimento delle cellule T, per migliorare l'efficacia terapeutica ^6,7.

In alternativa ai tradizionali metodi di isolamento cellulare come la selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) e la selezione cellulare attivata magneticamente (MACS), qui viene dimostrata la selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) con microbolle per l'isolamento delle cellule T. La separazione delle microbolle utilizza microsfere galleggianti e cave (microbolle) per legare i bersagli e farli galleggiare sulla superficie dei campioni di fluido ^8,9. Funzionalizzando le microbolle con anticorpi (cioè anti-CD3), le popolazioni di cellule T desiderate possono essere selezionate positivamente da campioni di sangue periferico. Successivamente, in questo lavoro viene dimostrato l'uso di una diversa popolazione di microbolle funzionalizzate con anticorpi (cioè anti-CD28) per co-stimolare e attivare cellule T selezionate positivamente in sospensione. Le microbolle offrono un flusso di lavoro di isolamento e attivazione semplice e altamente sintonizzabile che genera cellule T pronte per la coltura cellulare sospesa e applicazioni a valle come la modificazione genetica e l'espansione. Criticamente, l'attivazione cellulare galleggiante con microbolle promuove la stimolazione cellulare trattenuta per prevenire un eccessivo esaurimento delle cellule T⁷.

Per questo studio, la citometria a flusso è stato lo strumento principale utilizzato per analizzare l'isolamento, l'attivazione e il successo della trasduzione delle microbolle funzionalizzate, nonché per fornire informazioni dettagliate sulle sottopopolazioni specifiche presenti durante le fasi di crescita ed espansione post-trasduzione. Oltre alla citometria a flusso, sono stati utilizzati microscopi a campo chiaro e a fluorescenza per confermare la salute cellulare, la morfologia e il successo della trasduzione. Sulla base di questi risultati, la tecnologia e il protocollo a microbolle forniscono un'alternativa più sintonizzabile e delicata ai tradizionali metodi di isolamento e attivazione attualmente in uso; in particolare, le cellule attivate da microbolle mostrano un'espressione notevolmente inferiore dei marcatori di esaurimento delle cellule T rispetto a quella tipicamente osservata con strumenti e kit standard del settore.

Protocol

1. Isolamento delle cellule T con microbolle mediante selezione positiva

NOTA: questo protocollo descrive in dettaglio un approccio di selezione positiva CD3⁺ su piccola scala utilizzando SAMB.

1. Incubare 3 x 10⁸ PBMC ottenute commercialmente in 2,5 mL di tampone di separazione con anticorpo anti-CD3 biotinilato (OKT3) ad una concentrazione di 25 ng di anticorpo per 1 milione di cellule (25 ng/M). Mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
2. Aggiungere microbolle di streptavidina (SAMB) in un rapporto di 0,5 (quantità SAMB): 1 (quantità di celle) in base alla concentrazione SAMB riportata dal produttore.
3. Miscelare utilizzando un rotatore end-over-end commerciale (EOE) a 20 giri/min per 10-15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare per 5 minuti a 400 x g a temperatura ambiente.
4. Dopo la centrifugazione, le celle selezionate positivamente saranno nella parte superiore della sospensione con i SAMB. Le restanti celle non selezionate saranno nel pellet cellulare sul fondo del tubo. Utilizzando una pipetta di vetro da 9 pollici, inserire la punta sotto lo strato di bubble-cell sul fondo del tubo, aspirare il pellet cellulare e il subnatante con una pipetta elettronica e trasferirli in un nuovo tubo.

2. Co-stimolazione (attivazione) delle cellule T selezionate positivamente

1. Risospendere lo strato di bubble-cell rimanente nel tubo originale in 1 mL di mezzo completo di cellule T (o un altro mezzo desiderato).
2. Contare le cellule nel subnatante con microscopia a campo chiaro utilizzando un contatore automatico delle celle e sottrarre questo valore dal numero di cella iniziale per determinare il numero di cellule catturate nello strato di cellule a bolle.
3. Prima di questa fase, mescolare l'anticorpo anti-CD28 biotinilato con SAMB commerciali per un minimo di 2 ore per creare i SAMB anti-CD28 coniugati. Contattare il produttore SAMBs per determinare la quantità di anticorpi anti-CD28 necessari per la coniugazione. Aggiungere i SAMB coniugati anti-CD28 alla sospensione a celle a bolle risultante dal punto 2.1 utilizzando un rapporto di 1,5 (SAMB anti-CD28):1 (celle).
4. Miscelare utilizzando la rotazione EOE per 15 minuti, quindi regolare il volume totale a 2 milioni di cellule per ml con mezzo di cellule T completo o un altro mezzo desiderato in base al numero di cellule ottenuto al punto 2.2.

3. Espansione delle cellule co-stimolate in terreno di coltura cellulare

1. Distribuire 1 mL di cellule attivate dalla fase 2.4 ad una concentrazione di 2 M/mL per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Incubare in un incubatore umidificato al 5% di CO₂ a 37 °C.
2. Dopo 24 ore, aggiungere 50 U/mL di IL-2 e 25 ng/M di anti-CD3 solubile (OKT3) per favorire ulteriormente l'espansione, come calcolato utilizzando il numero iniziale di cellule placcate il giorno 0. Riporre la piastra cellulare nell'incubatore a CO₂ umidificata e lasciarla incubare per una notte a 37 °C.

4. Opzionale: Trasduzione delle cellule T attivate con lentivirus

NOTA: L'approccio utilizzato qui è adattato da Prommersberger et al. ¹⁰.

1. Scongelare il lentivirus a temperatura ambiente e mescolare brevemente mediante pipettaggio.
2. Rimuovere delicatamente il mid-natante, 600 μL da ciascun pozzetto, senza toccare le cellule figlie che ora si trovano sul fondo del pozzetto o lo strato di bolle che è rimasto sulla superficie della soluzione.
3. Aggiungere 5 μg/mL di bromuro di esadimetrina per pozzetto per migliorare la trasduzione virale. Aggiungere le particelle lentivirali a una molteplicità di infezione (MOI) di 3 (particelle lentivirali per cellula).
4. Centrifugare la piastra per 45 minuti a 800 x g e 32 °C utilizzando un'accelerazione lenta e nessuna interruzione per la decelerazione. Incubare le cellule per 4 ore in un incubatore a CO₂ umidificato a 37 °C.
5. Dopo 4 ore, aggiungere 600 μL di terreno di coltura T fresco e completo disponibile in commercio e 50 U/ml di IL-2 a ciascun pozzetto, e riposizionare la piastra cellulare nell'incubatore di CO₂ umidificata a 37 °C per l'espansione delle cellule T.

5. Espansione delle cellule T (con o senza trasduzione precedente)

1. Ogni 2 giorni, rimuovere metà del terreno dal mid-natante, sostituirlo con un mezzo di cellule T fresco e completo e aggiungere IL-2 ad una concentrazione di 50 U / mL.
2. Contare le cellule T due volte alla settimana per valutare la densità cellulare. Quando la densità cellulare supera 2 x 10 6-2,5 x 10⁶ cellule / ml, trasferire le cellule in un recipiente più grande, diluendoli a 5 x 10⁵ cellule / ml.

6. Raccolta delle cellule T e citometria a flusso

1. Mescolare delicatamente il contenuto di ciascun pozzetto pipettando su e giù. Rimuovere l'intero contenuto del pozzetto, comprese le microbolle, e trasferirle in un tubo da 1,5 ml.
2. Lavare ogni pozzetto con 400 μL di DPBS senza calcio e magnesio (−/−) e trasferire la soluzione in un tubo da 1,5 ml. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 50 μL di tampone di separazione.
4. Colorare con un cocktail anticorpale/colorante di attivazione e esaurimento e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente al buio. Preparare i cocktail di colorazione come segue: cocktail di attivazione: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, BV510-CD25, PE-CD69; cocktail di esaurimento: AF700-CD3, PE/Dazzle-CD4, PE/Cy7-CD8, PE-PD-1.
5. Aggiungere 1 mL di tampone di separazione e mescolare delicatamente. Centrifugare a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per lavare gli anticorpi in eccesso. Aspirare completamente il surnatante
6. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di tampone di separazione e trasferirlo in un recipiente appropriato (ad esempio, un tubo FACS, una piastra a 96 pozzetti, ecc.) per l'analisi della citometria a flusso. Lo schema di gating raccomandato per l'analisi della citometria a flusso è dettagliato nella Figura 1.

Results

Le cellule T sono state isolate dalle PBMC acquistate e placcate per l'attivazione come descritto nel protocollo. I campioni di controllo negativi (PBMC acquistati) non sono stati attivati. Questi campioni di controllo sono stati inclusi per dimostrare l'effetto che il processo di attivazione delle microbolle ha avuto sui campioni sperimentali rispetto ai controlli delle cellule T non toccati e non stimolati, assicurando che i marcatori di attivazione osservati fossero il risultato dei fattori di attivazione aggiunti e n...

Discussion

Il protocollo descritto consente l'isolamento delle cellule T da campioni di PBMC e l'attivazione di cellule T sospese in terreni di coltura con microbolle. Questo metodo si basa su microbolle funzionalizzate la cui galleggiabilità intrinseca offre un'opportunità unica per introdurre segnali co-stimolatori alle cellule e attivarli mentre sono sospesi in un terreno di coltura, riducendo così l'esposizione delle cellule in espansione alla stimolazione prolungata; tale sovrastimolazione può comportare un aumento dell'espres...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Mercaptoetanolo	Gibco	21985-023	CAS: 60-24-2
Piastre per colture multipozzetto Biologix Piastre a 24 pozzetti	VWR	76081-560
Biotina anti-umano CD28 (28.2) Anticorpo	Biolegend	302904
Biotina anti-umano CD3 (OKT3) Anticorpo	Biolegend	317320
DPBS, senza calcio, senza magnesio	Gibco	14190-136
GlutaMAX Integratore	Thermofisher	35050061
umano ricombinante IL2	BioVision (vwr)	10006-122
Particella lentivirale rLV.EF1.zsGreen1-9	Takara Bio	0038VCT
Leukopak	BioIVT	HUMANLMX100-0001129
PBMC umani normali	BioIVT	HUMANHLPB-0002562
Penicillina/streptomicina 100X per coltura tissutale	VWR	97063-708	CAS: 8025-06-7
Polybrene Reagente per infezioni/trasfezioni:	Millipore Sigma	TR-1003-G	CAS:28728-55-4
Siero AB umano aggregato Plasma derivato dal calore inattivato	Ricerca innovativa	ISERABHI100mL
RPMI 1640 Medium, integratore GlutaMAX, HEPES	Gibco	72400047
kit di microbolle di streptavidina (include il tampone di separazione di Akadeum)	Akadeum	11110-000