L'obiettivo di questo studio è dimostrare la fattibilità della separazione basata sulla flottazione per isolare, attivare ed espandere le cellule T umane primarie.
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Articolo metodologico
Isolamento, attivazione ed espansione delle cellule T basate sulla flottazione da campioni di cellule mononucleate del sangue periferico umano utilizzando microbolle
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il processo di isolamento delle cellule T dalle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) per stabilire colture ex vivo è cruciale per la ricerca, i test clinici e le terapie basate sulle cellule. In questo studio, viene presentato un protocollo semplice e nuovo per isolare, attivare ed espandere le cellule T dalle PBMC ex vivo . Questo studio utilizza la tecnologia di selezione cellulare attivata dalla galleggiabilità (BACS) funzionalizzata per isolare e attivare le cellule T. In breve, il protocollo prevede la selezione positiva di cellule CD3+ da PBMC derivate da leukopak, seguita da una co-stimolazione di 48 ore con microbolle di streptavidina pre-coniugate anti-CD28-legate (SAMB) prima della trasduzione in piastre a 24 pozzetti. Le microbolle funzionalizzate offrono un'opportunità unica per attivare le cellule, portando a fenotipi proliferativi che consentono l'espansione con un esaurimento minimo. Questa tecnica offre un esaurimento ridotto perché le microbolle co-stimolatorie rimangono galleggianti e ritornano in cima al terreno di coltura, riducendo così la quantità di tempo in cui le cellule in espansione sono in contatto con i fattori co-stimolatori. I risultati indicano che le cellule T isolate e coltivate ricevono una stimolazione sufficiente per attivarsi e proliferare ma non in misura tale da portare a una sovraattivazione, che porta quindi all'esaurimento, come dimostrato dalla presenza di PD-1 eccessivo.
Introduzione
Più di 500 studi clinici sulla terapia cellulare del recettore dell'antigene chimerico (CAR)-T sono attualmente condotti in tutto il mondo e quattro prodotti di terapia cellulare CAR-T sono disponibili sul mercato1. Tuttavia, esistono ancora numerose esigenze di ricerca e produzione di cellule CAR-T che devono essere affrontate per migliorare l'efficacia, la scalabilità e il successo a lungo termine di queste terapie potenzialmente curative 2,3,4,5. La ricerca clinica e la produzione di cellule CAR-T adottive inizia c....
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Protocollo
1. Isolamento delle cellule T con microbolle mediante selezione positiva
NOTA: questo protocollo descrive in dettaglio un approccio di selezione positiva CD3+ su piccola scala utilizzando SAMB.
- Incubare 3 x 108 PBMC ottenute commercialmente in 2,5 mL di tampone di separazione con anticorpo anti-CD3 biotinilato (OKT3) ad una concentrazione di 25 ng di anticorpo per 1 milione di cellule (25 ng/M). Mescolare delicatamente pipettando su e giù e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti.
- Aggiungere microbolle di streptavidina (SAMB) in un rapporto di 0,5 (quantità SAMB): 1 (quantità ....
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Risultati
Le cellule T sono state isolate dalle PBMC acquistate e placcate per l'attivazione come descritto nel protocollo. I campioni di controllo negativi (PBMC acquistati) non sono stati attivati. Questi campioni di controllo sono stati inclusi per dimostrare l'effetto che il processo di attivazione delle microbolle ha avuto sui campioni sperimentali rispetto ai controlli delle cellule T non toccati e non stimolati, assicurando che i marcatori di attivazione osservati fossero il risultato dei fattori di attivazione aggiunti e n.......
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Discussione
Il protocollo descritto consente l'isolamento delle cellule T da campioni di PBMC e l'attivazione di cellule T sospese in terreni di coltura con microbolle. Questo metodo si basa su microbolle funzionalizzate la cui galleggiabilità intrinseca offre un'opportunità unica per introdurre segnali co-stimolatori alle cellule e attivarli mentre sono sospesi in un terreno di coltura, riducendo così l'esposizione delle cellule in espansione alla stimolazione prolungata; tale sovrastimolazione può comportare un aumento dell'espres.......
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Dichiarazioni
Tutti gli autori, al momento della presentazione, sono dipendenti di Akadeum Life Sciences, che produce e vende prodotti per la separazione delle microbolle.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2-Mercaptoetanolo | Gibco | 21985-023 | CAS: 60-24-2 |
| Piastre per colture multipozzetto Biologix Piastre a 24 pozzetti | VWR | 76081-560 | |
| Biotina anti-umano CD28 (28.2) Anticorpo | Biolegend | 302904 | |
| Biotina anti-umano CD3 (OKT3) Anticorpo | Biolegend | 317320 | |
| DPBS, senza calcio, senza magnesio | Gibco | 14190-136 | |
| GlutaMAX Integratore | Thermofisher | 35050061 | |
| umano ricombinante IL2 | BioVision (vwr) | 10006-122 | |
| Particella lentivirale rLV.EF1.zsGreen1-9 | Takara Bio | 0038VCT | |
| Leukopak | BioIVT | HUMANLMX100-0001129 | |
| PBMC umani normali | BioIVT | HUMANHLPB-0002562 | |
| Penicillina/streptomicina 100X per coltura tissutale | VWR | 97063-708 | CAS: 8025-06-7 |
| Polybrene Reagente per infezioni/trasfezioni: | Millipore Sigma | TR-1003-G | CAS:28728-55-4 |
| Siero AB umano aggregato Plasma derivato dal calore inattivato | Ricerca innovativa | ISERABHI100mL | |
| RPMI 1640 Medium, integratore GlutaMAX, HEPES | Gibco | 72400047 | |
| kit di microbolle di streptavidina (include il tampone di separazione di Akadeum) | Akadeum | 11110-000 |
Riferimenti
- Albinger, N., Hartmann, J., Ullrich, E. Current status and perspective of CAR-T and CAR-NK cell therapy trials in Germany. Gene Therapy. 28 (9), 513-527 (2021).
- Tyagarajan, S., Spencer, T., Smith, J. Optimizing CAR-T cell....
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Ristampe e permessi
