Propagazione del virus e quantificazione colorimetrica cellulare

Summary

Il presente protocollo descrive la propagazione del virus Zika (ZIKV) in cellule renali di scimmia verde africana Vero e la quantificazione di ZIKV utilizzando metodi di immunorilevazione colorimetrica basati su cellule nei formati a 24 e 96 pozzetti (high throughput).

Abstract

Il virus Zika (ZIKV) è un virus trasmesso dalle zanzare appartenente al genere Flavivirus. L'infezione da ZIKV è stata associata ad anomalie cerebrali congenite e potenzialmente alla sindrome di Guillain-Barré negli adulti. La ricerca su ZIKV per comprendere i meccanismi della malattia è importante per facilitare lo sviluppo di vaccini e trattamenti. Il metodo di quantificazione dei virus è cruciale e fondamentale nel campo della virologia. Il focus forming assay (FFA) è un test di quantificazione del virus che rileva l'antigene virale con gli anticorpi e identifica i focolai di infezione delle cellule utilizzando la tecnica di immunocolorazione della perossidasi. L'attuale studio descrive il protocollo di propagazione e quantificazione del virus utilizzando sia i formati a 24 pozzetti che a 96 pozzetti (high throughput). Rispetto ad altri studi simili, questo protocollo ha ulteriormente descritto l'ottimizzazione delle dimensioni dei focolai, che può servire come guida per espandere l'uso di questo test per altri virus. In primo luogo, la propagazione di ZIKV viene eseguita in cellule Vero per 3 giorni. Il surnatante di coltura contenente ZIKV viene raccolto e quantificato utilizzando l'FFA. In breve, la coltura virale viene inoculata su cellule Vero e incubata per 2-3 giorni. La formazione di focolai viene quindi determinata dopo processi di colorazione ottimizzati, tra cui la fissazione cellulare, la permeabilizzazione, il blocco, il legame degli anticorpi e l'incubazione con substrato di perossidasi. I focolai virali colorati vengono visualizzati utilizzando uno stereomicroscopio (conteggio manuale in formato a 24 pozzetti) o un analizzatore software (conteggio automatizzato in formato a 96 pozzetti). L'FFA fornisce risultati riproducibili e relativamente rapidi (3-4 giorni) ed è adatto per essere utilizzato per diversi virus, compresi quelli che non formano placca. Successivamente, questo protocollo è utile per lo studio dell'infezione da ZIKV e potrebbe essere utilizzato per rilevare altri virus clinicamente importanti.

Introduction

L'infezione da virus Zika (ZIKV) è una malattia virale emergente trasmessa dalle zanzare. Il primo isolamento di ZIKV avvenne in Uganda nel 1947 ^1,2; È rimasta trascurata dal 1947 al 2007, poiché i sintomi clinici sono più comunemente asintomatici e caratterizzati da malattia febbrile autolimitante. Nel 2007, l'epidemia di Zika è iniziata nelle isole Yap ^3,4, seguita da epidemie più grandi nelle regioni del Pacifico (Polinesia francese, Isola di Pasqua, Isole Cook e Nuova Caledonia) dal 2013 al 2014 ^5,6,7,8....

Protocol

1. Propagazione del virus

1. Preparazione delle cellule
   1. Coltivare le cellule Vero in un matraccio da^{75 cm contenente} 12 mL di terreno di coltura modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 2 mM di L-glutammina (vedi Tabella dei materiali). Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO₂ .
   2. Monitorare le cellule al microscopio; una volta che le celle raggiungono il 70%-90% di confluenza, sono pronte per essere utilizzate (Figura 1A).
      NOTA: Le celle Vero raddoppiano ogni 24 h

Results

Lo ZIKV può essere quantificato utilizzando l'FFA, come illustrato schematicamente nella Figura 3. Per la piastra a 24 pozzetti, le cellule Vero infette sono state fissate a 48 ore, 60 ore, 72 ore, 84 ore e 96 ore dopo l'infezione. I risultati hanno mostrato che le cellule sono rimaste intatte (non è stato osservato alcun distacco cellulare) dopo 96 ore (4 giorni) dall'infezione (Figura 4 e Figura 8A-E supplementare). La comparsa di focolai vira.......

Discussion

Esistono diversi test per determinare il titolo del virus; il PFA ha un protocollo di quantificazione del virus simile a quello dell'FFA, in cui l'inoculo virale viene diluito per consentire di distinguere le singole placche o focolai. Dopo la colorazione, ogni placca o focolai indica una singola particella infettiva nell'inoculo¹⁹. Il PFA è colorato con cristallo viola per visualizzare la formazione di placca causata dalla lisi o dalla morte cellulare. Quindi, il PFA richiede più tempo, in quanto.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 µ m Filtro per siringa in polietersulfone	Sartorius	S6534-FMOSK
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	Nest	615601
Pipetta sierologica sterile da 10 mL	Labserv	14955156
1x Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato (dPBS)	Gibco	14190-136
provetta con tappo a vite da 2,0 mL	Axygen	SCT-200-SS-C-S
Piastra a 24 pozzetti	Corning	3526
Pipette sierologiche sterili da 25 mL	Labserv	14955157
substrato di perossidasi 3,3'Diaminobenzidina (DAB)	Thermo Scientific	34065
37 ° Incubatore C con 5% CO2	Sanyo	MCO-18AIC
5 mL pipetta sierologica sterile	Labserv	14955155
50 mL provetta da centrifuga	Falcon	LAB352070
75 cm2 pallone per coltura tissutale	Corning	430725U
Piastra a 96 pozzetti	Falcon	353072
Anticorpo monoclonale anti-flavivirus, 4G2 (clone D1-4G2-4-15)	MilliporeSigma	MAB10216
Autoclavato 20x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	N/A	N/A	22,8 g di 8 mM Na2HPO4, 4,0 g di 1,5 mM KH2PO4, 160 g di NaCl 0,14 M, 4,0 g di KCl 2,7 mM, 1 L di MilliQ H2O
Cabina di sicurezza biologica, Classe II	Holten	HB2448
CTL S6 Analizzatore ELISpot/FluoroSpot universale	ImmunoSpot, Cellular Technology Limited (CTL)	CTL-S6UNV12	Analizzatore software commerciale
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	12800-017
Fetale bovino siero (FBS)	Bovogen	SFBS
Capra anti-topo IgG anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP)	MilliporeSigma	12-349
Hemacytometer	Laboroptik LTD	Neubauer migliorato
IGEPAL CA-630 detergente	Sigma-Aldrich	I8896	Octylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanolIGEPAL
Microscopio invertito	ZEISS	TELAVAL 31
Bilanciere da laboratorio	FINEPCR	CR300
L-Glutammina	Gibco	25030-081
Carbossimetilcellulosa (CMC) a bassa	viscositàSigma-Aldrich	C5678
Micropipetta multicanale (10 - 100 &; L)	Eppendorf	3125000036
Micropipetta multicanale (30 - 300 &; L)	Eppendorf	3125000052
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148
Penicillina-streptomicina	Gibco	15140-122
Pipette monocanale (10 - 100 &; L)	Eppendorf	3123000047
Pipette monocanale (100 - 1000 &; micro; L)	Eppendorf	3123000063
Pipette monocanale (20 - 200 &; micro; L)	Eppendorf	3123000055
Latte scremato	Sunlac Low Fat	N/A	Preparare il 3% di latte scremato in 1x PBS per la fase di blocco nella colorazione
Ipoclorito di sodio	Clorox	N/A	Per disinfettare eventuali rifiuti liquidi infettivi scartati da fiasche/piastre
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ1000
Siringa monouso, Luer Lock, 10 mL con ago da 21 G	Terumo
Vero Cellule renali di scimmia verde africana	-	ECACC 88020401	Ricevuto dal collaboratore. Tuttavia, le celle Vero ottenute da altri fornitori dovrebbero poter essere utilizzate con una certa ottimizzazione.