$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
La cromatina è una struttura dinamica e fluida mantenuta dalle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina. Sia le proteine istoniche che quelle non istoniche sono coinvolte nel mantenimento della struttura della cromatina. Come vengono mediate queste interazioni e come si altera la struttura della cromatina durante i processi che coinvolgono il DNA come substrato?
Molte tecniche sono state sviluppate per far luce sulla dinamica delle interazioni proteina-DNA e proteina-proteina. Questi includono sia tecniche biofisiche come la spettroscopia CD che metodi biochimici come la cromatografia con filtrazione su gel. Questa raccolta mette in evidenza alcune di queste tecniche che possono essere utilizzate per esplorare le dinamiche dell'architettura della cromatina.
L'integrità del DNA può essere analizzata mediante citometria a flusso (FACS) e Ling et al.1 adattano questo metodo per rilevare i difetti funzionali dello sperma umano. La fisiologia degli spermatozoi può essere valutata utilizzando biomarcatori come il danno al DNA, il potenziale della membrana mitocondriale e l'apoptosi degli spermatozoi. Ling et al. mostrano che la FACS può essere facilmente adattata per monitorare ciascuno di questi parametri per valutare la fisiologia degli spermatozoi, dimostrando così che la tecnica è un kit di strumenti pratico e affidabile per la diagnosi dell'infertilità maschile.
La spettroscopia CD è probabilmente uno dei metodi più semplici per studiare la conformazione di proteine e DNA. Ogni conformer del DNA ha un modello di banda caratteristico. Il cambiamento nel pattern di bande può essere correlato con il cambiamento nella conformazione del DNA e, quindi, il cambiamento nell'architettura del DNA può essere monitorato in presenza di proteine interagenti utilizzando uno spettrofotometro CD. Arya et al.2 utilizzano questa tecnica per studiare i cambiamenti nel DNA indotti dall'interazione con la proteina di rimodellamento della cromatina ATP-dipendente, SMARCAL1, in assenza e presenza di ATP. Mostrano che le alterazioni nella struttura del DNA possono essere correlate con l'attività trascrizionale della proteina.
La cromatografia ad esclusione dimensionale e i saggi pull-down sono utilizzati di routine per monitorare le interazioni proteina-proteina. L'assemblaggio dei nucleosomi è facilitato dagli chaperoni istonici che si legano agli istoni. Bobde et al.3 descrivono metodi e saggi che possono essere utilizzati per identificare se una data funzione proteica è un chaperone istonico o meno.
Come studiamo i meccanismi dell'assemblaggio dei nucleosomi in tempo reale? Sono state sviluppate tecniche di imaging a singola molecola, come la tenda del DNA, per visualizzare il processo di assemblaggio in tempo reale. La tenda del DNA è una tecnica ibrida che combina fluidità lipidica, microfluidica e microscopia a riflessione interna totale per visualizzare l'interazione proteina-DNA in tempo reale. Kang et al.4 descrivono la tenda del DNA come una tecnica per studiare il meccanismo alla base dell'assemblaggio dell'istone chaperone, Abo1, da S. pombe. Le tecniche descritte forniscono un modo per esaminare la dinamica della cromatina, che svolge un ruolo importante sia nella stabilità genomica che nella regolazione epigenetica dei processi che coinvolgono il materiale genetico.
L'immunoprecipitazione tradizionale della cromatina (ChIP) richiede anticorpi specifici contro la proteina di interesse. Molte volte, gli anticorpi non sono abbastanza specifici, portando a risultati falsi positivi, soprattutto durante il sondaggio dei siti di legame dei fattori di trascrizione. Inoltre, gli anticorpi non sono sempre disponibili per le proteine in tutti gli organismi. La Candida albicans è uno di questi organismi per i quali gli anticorpi non sono disponibili. Il metodo Cut and Run aggira queste limitazioni fondendo MNase con il fattore di trascrizione di interesse. Qasim et al.5 descrivono l'uso di questo metodo per determinare i siti di legame dei fattori di trascrizione in C. albicans.
I metodi descritti in questa raccolta forniscono uno sguardo sulle tecniche disponibili per i ricercatori. Tutti questi metodi sono versatili e facilmente adattabili per rispondere alle domande che i ricercatori si pongono.