Method Article

Valutazione del processo e cinetica dell'espressione ricombinante della chitina deacetilasi nelle cellule pLysS di E. coli Rosetta utilizzando una tecnica statistica

DOI:

10.3791/64590

⸱

March 10th, 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nell'attuale protocollo, è stata applicata una tecnica statistica, il central composite design (CCD), per ottimizzare le condizioni di processo per l'espressione della chitina deacetilasi batterica ricombinante (BaCDA) nelle cellule pLysS di E. coli Rosetta. L'impiego di CCD ha portato a un aumento di ~2,39 volte dell'espressione e dell'attività di BaCDA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi anni, la via più ecologica della deacetilazione della chitina in chitosano utilizzando l'enzima chitina deacetilasi ha acquisito importanza. Il chitosano convertito enzimaticamente con caratteristiche emulative ha una vasta gamma di applicazioni, in particolare in campo biomedico. Sono state riportate diverse chitina deacetilasi ricombinanti da varie fonti ambientali, ma non ci sono studi sull'ottimizzazione del processo per la produzione di queste chitina deacetilasi ricombinanti. Il presente studio ha utilizzato la metodologia del disegno composito centrale della superficie di risposta per massimizzare la produzione di chitina deacetilasi batterica ricombinante (BaCDA) in E. coli Rosetta pLysS. Le condizioni di processo ottimizzate erano una concentrazione di glucosio dello 0,061%, una concentrazione di lattosio dell'1%, una temperatura di incubazione di 22 °C, una velocità di agitazione a 128 giri/min e 30 ore di fermentazione. In condizioni ottimizzate, l'espressione dovuta all'induzione del lattosio è iniziata dopo 16 ore di fermentazione. La massima espressione, la biomassa e l'attività di BaCDA sono state registrate 14 ore dopo l'induzione. Alla condizione ottimizzata, l'attività BaCDA del BaCDA espresso è aumentata di ~2,39 volte. L'ottimizzazione del processo ha ridotto il ciclo fermentativo totale di 22 ore e il tempo di espressione di 10 ore dopo l'induzione. Questo è il primo studio a riportare l'ottimizzazione del processo di espressione della chitina deacetilasi ricombinante utilizzando un design composito centrale e il suo profilo cinetico. L'adattamento di queste condizioni di crescita ottimali potrebbe portare a una produzione economica e su larga scala della moneran deacetilasi, meno esplorata, intraprendendo un percorso più ecologico per la produzione di chitosano di grado biomedico.

Introduction

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La chitina, un polimero naturale legato β 1-4 glicosidico, è il secondo polisaccaride più abbondante in natura dopo la cellulosa. Nonostante ciò, la chitina ha applicazioni industriali limitate a causa della sua insolubilità1. Questo collo di bottiglia viene affrontato sottoponendo la chitina a N-deacetilazione, che conferisce una carica positiva e aumenta la solubilità del polimero risultante, il chitosano1. La chitina può essere modificata in chitosano attraverso due diversi percorsi: chimico ed enzimatico. L'applicazione biomedica del chitosano richiede una deacetilazione controllata e definita, che è limitata nelle vie chimiche 2,3. Questa limitazione può essere affrontata utilizzando le chitina deacetilasi (CDA), un approccio enzimatico verde per il processo di deacetilazione 4,5.

La chitina deacetilasi appartiene alla famiglia delle esterasi 4 (CE-4), definite nel database degli enzimi attivi dei carboidrati (CAZY). Gli enzimi della famiglia CE-4 condividono l'omologia NodB o dominio polisaccaridico deacetilasi come regione conservata. Il central composite design (CCD), uno strumento statistico, viene utilizzato per l'ottimizzazione di diversi enzimi modificanti la chitinawild-type 6,7,8,9. Tuttavia, i passaggi a valle nell'uso di organismi wild-type diventano noiosi, da qui il passaggio agli enzimi ricombinanti 10,11,12,13,14,15,16,17. Negli ultimi anni, i CDA ricombinanti alofili da fonti marine hanno acquisito importanza grazie alla loro facilità nell'applicazione industriale e nella produzione di chitosano di grado biomedico18,19.

La produzione di enzimi ricombinanti in E. coli ha una limitazione sul processo ed è necessaria l'ottimizzazione dei terreni poiché la sua espressione in E. coli varia a seconda del gene e del plasmide utilizzati20. Pertanto, lo screening di un processo adeguato e dei parametri nutrizionali diventa importante. One factor at a time (OFAT), il metodo di ottimizzazione comunemente impiegato, richiede enormi risorse e tempo per eseguire esperimenti passo dopo passo. Questo metodo soffre di una mancanza di informazioni statistiche riguardanti l'interazione tra i parametri 20,21,22,23. Pertanto, la metodologia della CCD della superficie di risposta (RSM) è stata adottata per studiare la resa di espressione della chitina deacetilasi batterica alofila (BaCDA) e l'attività di BaCDA in E. coli Rosetta pLysS. I parametri considerati per l'ottimizzazione dell'espressione nell'ospite di E. coli erano la concentrazione di lattosio, la concentrazione di glucosio, la temperatura di incubazione, la velocità di agitazione e il tempo di incubazione. Nella maggior parte degli studi sull'espressione di E. coli, come induttore è stato utilizzato un terreno di Luria Bertani (LB) con isopropil β-d-1-tiogalattopiranoside (IPTG). Questa aggiunta di IPTG ha richiesto un monitoraggio regolare della crescita24. Queste mediazioni ricorrenti durante il processo fermentativo aprono anche strade per la contaminazione. Quindi, i gruppi di ricerca sono passati al brodo formidabile (TB) con il lattosio come induttore. L'inclusione del lattosio nei terreni al posto dell'IPTG risolve questa preoccupazione; E. coli consuma questo lattosio e produce allo-lattosio come sottoprodotto, determinando una condizione di auto-induzione. Questo mezzo autoinduttore include il glicerolo, che ha mostrato una migliore resa della proteinaricombinante 25.  Questa sovraespressione di proteine ricombinanti nei terreni di TB è stata ulteriormente migliorata ottimizzando i parametri di processo. Nel presente studio, è stato applicato un disegno composito centrale per ottimizzare l'espressione eterologa di BaCDA alofila nelle cellule pLysS di E. coli Rosetta. I parametri di processo scelti erano la temperatura di incubazione, la velocità di agitazione e il tempo di incubazione, mentre i parametri nutrizionali valutati erano la concentrazione di glucosio e lattosio. L'espressione alofila di BaCDA è stata valutata con la condizione ottimizzata prevista e convalidata in modo incrociato utilizzando SDS-PAGE.

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Protocol

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1. Mezzi di espressione e condizione culturale

  1. Trasformare il vettore pET-22b contenente il gene BaCDA in cellule competenti per E. coli Rosetta pLysS utilizzando il metodo dello shock termico, come descritto in15.
    NOTA: È necessario prestare attenzione quando si lavora con i microrganismi. Tutti i lavori microbiologici devono essere eseguiti all'interno di una cappa di biosicurezza per evitare contaminazioni.
  2. Eseguire lo studio preliminare dell'espressione in terreni tubercolari contenenti lo 0,05% (p/v) di glucosio e lo 0,2% (p/v) di lattosio a 16 °C e 180 giri/min. Coltivare 6.792 x 107 cellule pLysS di E. coli Rosetta in 100 mL di terreno contenente plasmide clonato BaCDA fino a raggiungere la fase stazionaria. Alle condizioni di crescita menzionate, le cellule pLysS di E. coli Rosetta raggiungono una densità ottica di 600 (OD600) di 10,85 ± 0,21. 
    NOTA: Composizione del terreno TB (% p/v): triptone, 1,2; estratto di lievito, 2,4; glicerolo, 0,6; e 1x TB di sale (17 mM KH2PO4 e 74 mM K2HPO4)17.

2. Ottimizzazione e progettazione sperimentale

  1. Progetta gli esperimenti e adatta il modello polinomiale del secondo ordine nella progettazione composita centrale utilizzando il software dello strumento statistico. Il software statistico utilizzato nel presente studio è stato MINITAB 17.0 (versione di prova).
    1. A tale scopo, aprire il software e fare clic sui seguenti pulsanti: Statistica > DoE > Superficie di risposta > Crea superficie di risposta > Progettazione della risposta > Composito centrale. L'output viene visualizzato sotto forma di finestra di dialogo.
  2. Inserire i cinque parametri, temperatura di incubazione, velocità di agitazione, tempo di incubazione, concentrazione di glucosio e concentrazione di lattosio, a cinque livelli (-2, -1, 0, +1, +2) nella finestra di dialogo.
    1. Per fare ciò, inserisci i parametri con i livelli nella finestra di dialogo, inserisci i dettagli di tutti i parametri e premi OK. Questo genera la matrice di progettazione sperimentale con sei repliche nel punto centrale, che richiedono 32 esecuzioni sperimentali. Il software genera una tabella contenente i parametri e i loro livelli in termini codificati e non codificati, utilizzati nell'ottimizzazione del processo tramite CCD (Tabella 1).
  3. Esegui i 32 esperimenti con le condizioni generate dal software. Inserire i risultati sperimentali nella matrice di progettazione sperimentale (generata dal software) contenente livelli e parametri in termini di unità codificate e non codificate (Tabella 2).
  4. Analizzare la matrice di disegno sperimentale (Tabella 2) utilizzando il software. Per fare ciò, apri il software e inserisci la risposta nella scheda tecnica. Selezionare la colonna Risposta > Statistica > DoE > superficie di risposta > Analizza progettazione superficie di risposta > OK. L'output viene analizzato per la significatività statistica e il software prevede un modello.

Tabella 1: I parametri e i loro livelli in termini codificati e non codificati utilizzati nel disegno sperimentale per stimare l'espressione della chitina deacetilasi ricombinante nelle cellule pLysS di E. coli Rosetta. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Matrice del disegno sperimentale con attività sperimentale e predetta di BaCDA (espressione) della chitina deacetilasi ricombinante in cellule pLysS di E. coli Rosetta. Clicca qui per scaricare questa tabella.

3. Validazione del modello

  1. Convalida il modello progettato utilizzando lo strumento di ottimizzazione della risposta disponibile nel software.
  2. Ripetere la fermentazione alle condizioni ottimali previste dal software e confrontare il valore sperimentale con il valore previsto dal software.
    1. A tale scopo, aprire il software e selezionare la colonna Risposta > Statistica > DoE > la superficie di risposta > Ottimizzatore risposta > Massimizza > OK. L'output è costituito dalle condizioni di processo ottimali e dai valori previsti dal software. Ripetere la fermentazione alle condizioni ottimali previste e confrontare i valori.

4. Metodi analitici

  1. Espressione, biomassa e quantificazione delle proteine
    1. Eseguire la fermentazione in 32 condizioni fornite dal software nella matrice di disegno sperimentale (Tabella 2). Ottenere il pellet dopo ogni corsa centrifugando la coltura a 5,405 x g per 10 minuti a 4 °C. Pesare il pellet della cella per determinare la resa della biomassa.
      NOTA: Tutte le manipolazioni microbiche devono essere effettuate in condizioni asettiche (ad esempio, all'interno di cappe di biosicurezza).
    2. Lisi il pellet cellulare per ottenere la proteina periplasmatica mediante sonicazione. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazolo) a ciascun grammo di pellet cellulare e interrompere sonicando per 10 cicli con un impulso di 10 s acceso e 10 s spento al 60% di ampiezza. Raccogliere il lisato centrifugando a 5,405 x g per 10 min a 4 °C. Quantificare la concentrazione proteica con il saggio di Bradford26.
      NOTA: Per evitare la denaturazione delle proteine, la sonicazione deve essere eseguita in condizioni di freddo. Posizionare i campioni sul ghiaccio durante l'esecuzione della sonicazione.
    3. Analizza l'espressione BaCDA utilizzando SDS-PAGE seguito dal software ImageJ. Caricare 10 μL di lisato cellulare solubile (proteina periplasmatica) su gel di bis-acrilammide al 12% ed eseguire con 1 tampone tris-glicina-SDS (TGS) a una corrente di 100 V per 2 ore. Al termine della corsa, colorare il gel con il blu Coomassie e depuntare per rimuovere lo sfondo27.
    4. Cattura un'immagine utilizzando un'unità di documentazione su gel. Determinare l'espressione BaCDA confrontando l'intensità della banda sotto forma di valori di pixel utilizzando il software ImageJ. Si consideri l'esecuzione sperimentale con la più bassa attività BaCDA e la biomassa come pixel di riferimento 28.
      1. Per fare ciò, apri il software e apri il file immagine, quindi seleziona ogni corsia utilizzando la casella rettangolare. Vai su Analizza e imposta ogni corsia come 100%, quindi seleziona la banda sovraespressa in ogni corsia utilizzando la casella rettangolare. Vai su Analizza e determina l'intensità della banda, ripeti il processo in ogni corsia ed esporta il risultato come file .xls. Considerare l'intensità di banda della corsa sperimentale con la più bassa attività BaCDA come intensità di riferimento e analizzare l'espressione di ciascuna corsia.
  2. Saggio dell'attività enzimatica
    1. Determinare l'attività del BaCDA utilizzando un kit di dosaggio dell'acetato15, utilizzando la chitina del glicole etilenico (1 mg/mL; EGC) come substrato29.
    2. Lasciare reagire 20 μL di BaCDA con 40 μL del substrato in presenza di 40 μL di tampone Tris-HCl (pH 7) da 50 mM per 1 ora a 30 °C agitando a 800 giri/min.
    3. Dopo 1 ora, centrifugare il reagente da 100 μL attraverso una colonna da 3 kDa a 2.111 x g per 15 minuti a 4 °C. Scartare il retentato composto da BaCDA e raccogliere il filtrato contenente acetato rilasciato durante la reazione. Utilizzare il filtrato per il saggio dell'acetato per determinare l'attività del BaCDA.
      NOTA: Un'unità dell'enzima è definita come l'attività che rilascia 1 μM di acetato dal substrato per microlitro di enzima al minuto. Il test dell'attività enzimatica è stato effettuato in triplicati e la rispettiva attività enzimatica è stata calcolata di conseguenza.
  3. Cinetica di fermentazione dell'induzione del lattosio
    1. Esaminare il profilo di attività per determinare il punto di induzione e di inizio dell'espressione del lattosio. La profilazione dell'attività viene effettuata stimando l'attività della biomassa e del BaCDA con le condizioni di fermentazione ottimizzate.
    2. Determinare la concentrazione di glucosio nel terreno utilizzando un kit per la stima del glucosio. Traccia il profilo di attività utilizzando la biomassa, la concentrazione di glucosio e l'attività di BaCDA rispetto al tempo di fermentazione.

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Results

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Ottimizzazione del processo di espressione dell'enzima ricombinante periplasmatico chitina deacetilasi in E. coli utilizzando il design composito centrale (CCD)
Il costrutto pET22b-Ba CDA, quando coltivato in condizioni non ottimizzate, ha fornito una resa massima di biomassa e un'attività di BaCDA rispettivamente di 22,26 ± 0,98 g/L e 84,67 ± 0,56 U/L. Nel presente studio, è stato adottato un approccio statistico CCD per trovare le condizioni di proc...

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Discussion

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La chitina deacetilata, il chitosano, ha molte applicazioni, soprattutto in campo biomedico30. Tuttavia, la riproducibilità del chitosano per quanto riguarda il suo grado di acetilazione (DA) e il modello di acetilazione (PA) è una delle principali preoccupazioni, oltre ad altre apprensioni ambientali. La via più ecologica, che utilizza gli enzimi, è stata così sfruttata. La gamma di CDA può essere impiegata per creare chitosano con un modello unico di deacetilazione, che aumenterebbe le loro appl...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare la Manipal Academy for Higher Education (MAHE) per il fondo MAHE UNSW e gli autori desiderano ringraziare il Council of Scientific & Industrial Research - Human Resource Development Group (CSIR-MHRD), Govt. dell'India per una borsa di ricerca senior, premio numero lettera 09/1165 (0007) 2K19 EMR-I del 31.3.2019.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kits
Kit per il dosaggio dell'acetatoMegazyme, IrlandaK-ACETAKIl protocollo è stato leggermente modificato e ottimizzato per eseguire il test in una piastra a 96 pozzetti
Kit di stima del glucosioAgappe diagnosis Ltd., India12018013Il protocollo è stato leggermente modificato e ottimizzato per eseguire il test in una piastra
a 96 pozzettiChemicals
Acido aceticoHi-media, IndiaAS001Utilizzato per la preparazione della soluzione di colorazione e destaing SDS-PAGE
AcrylamideHi-media, IndiaMB068Utilizzato per la preparazione del gel SDS-PAGE
Pursolfato di ammonioHi-media, IndiaMB003Utilizzato per la preparazione del gel SDS-PAGE
Bis-acrilammideHi-media, IndiaMB005Utilizzato per la preparazione del gel SDS-PAGE
Blu luciliiant Coomassie G-250Hi-media, IndiaMB092Utilizzato per la preparazione della soluzione di colorazione e destaing SDS-PAGE
Blu Coomassie briliiant R-250Hi-media, IndiaMB153Utilizzato per la preparazione del saggio di Bardford Glicole
etilenico chitosanoSigma-aldrich, USAE1502Utilizzato per preparare la chitina del glicole etilenico e la chitina del glicole etilenico è stato utilizzato come substrato per la reazione enzimatica
D-glucosioHi-media, IndiaMB037Utilizzato come componente del supporto.
ImidazoleHi-media, IndiaGRM1864Utilizzato nel tampone di lisi
LattosioHi-media, IndiaGRM017Utilizzato come componente del supporto.
MetanoloFinar, India30930LC250Utilizzato per la preparazione della soluzione di colorazione e destaing SDS-PAGE
Cloruro di sodio (NaCl)Hi-media, IndiaMB023Utilizzato nel tampone di lisi
Acido fosforicoHi-media, IndiaMB157Utilizzato per la preparazione del saggio di Bardford
dodecil solfato di sodio (SDS)Hi-media, IndiaGRM6218Utilizzato per la preparazione del gel SDS-PAGE
Sodio fosfato bibasico anidroHi-media, IndiaMB024Utilizzato per preparare la tubercolosi per i terreni e il tampone per la reazione enzimatica.
Fosfato di sodio monobasico anidroHi-media, IndiaGRM3964Utilizzato per preparare la tubercolosi per terreni e tampone per la reazione enzimatica.
Tetrametiletilendiammina (TEMED)Hi-media, IndiaMB026Utilizzato per la preparazione del gel SDS-PAGE
Tris baseHi-media, IndiaMB029Utilizzato per la preparazione del gel SDS-PAGE
TriptoneHi-media, IndiaRM7707Utilizzato come componente del supporto.
Estratto di lievitoHi-media, IndiaRM027Utilizzato come componente multimediale.
Equipment
AlphaImager Unità di documentazione su gel HPProteinSimple, USA92-13823-00Utilizzato per acquisire fotografie SDS-PAGE
Miscelatore da bancoEppendorf, Germania 9.776 660Utilizzato per conservare per la reazione enzimatica con adattatore da 2 mL
Agitatore per bioincubatoreStrumenti Trishul, India13410622Utilizzato per incubare colture batteriche a diverse temperature e
RPM BiospettrofotometroEppendorf, Germania 6135000009Utilizzato per effettuare tutte le letture spettroscopiche
Centrifuga di raffreddamentoEppendorf, Germania 5805000017Utilizzato per centrifugare la coltura, il lisato e tutti gli altri protocolli di centrifugazione
Bagno a seccoLabnet International, USAS81522039Utilizzato per denaturare il campione proteico per
le micropipetteEppendorf, Germania 3123000900Utilizzato attraverso il protocollo per le misurazioni del volume
Agitatore a bilanciereStrumenti Trishul, India11770719Utilizzato per agitare il gel SDS-PAGE per la colorazione e la decolorazione
dell'unità SDS-PAGEBio-Rad, USA1658001FCUtilizzato per lanciare ed eseguire il gel SDS-PAGE
UltrasonicoSonics & Materials, Inc., USAVCX 130Utilizzato per lisare la cellula batterica mediante ultrasonicazione
Bilanciadi pesatura Sartorius, GermaniaBSA124 SUtilizzato per misurare il peso in tutto il protocollo
Dispositivi
Nanosep Dispositivi centrifughi con membrana Omega (3 kDa)PALL life sciences, USAOD003C33Utilizzato per separare l'enzima dopo il substrato trattamento
SoftwaresVersionesviluppata presso
MINITAB17.0  (Versione di prova)  The Pennsylvania State UniversityUtilizzato per progettare il modello sperimentale e analizzare i dati
ImageJ1.53oNational Institutes of Health (NIH)Utilizzato per analizzare il livello di espressione utilizzando SDS-PAGE image
Plasmid
pET22b (+) DNA— NovagenMerck- Millipore, USA69744Immagazzinato a &meno; 20 gradi C
Cellule
E. coli Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, USA70956Mantenuto a Luria– Bertani (LB) brodo contenente il 25% di glicerolo a − 80 gradi E
SDS-PAGE

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