Method Article

Applicazione della vermimetria a flusso per la quantificazione e l'analisi del microbioma intestinale di Caenorhabditis elegans

DOI:

10.3791/64605

⸱

March 31st, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research and Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, 2Development, Disease Models and Therapeutics Program, Graduate School of Biomedical Sciences, Baylor College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Caenorhabditis elegans è un potente modello per esaminare i determinanti molecolari che guidano le interazioni ospite-microbioma. Presentiamo una pipeline ad alto rendimento che profila i livelli di colonizzazione del microbioma intestinale dei singoli animali insieme ad aspetti chiave della fisiologia di C. elegans.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La composizione del microbioma intestinale può avere un impatto drammatico sulla fisiologia dell'ospite durante lo sviluppo e la vita dell'animale. Misurare i cambiamenti di composizione nel microbioma è fondamentale per identificare le relazioni funzionali tra questi cambiamenti fisiologici. Caenorhabditis elegans è emerso come un potente sistema ospite per esaminare i driver molecolari delle interazioni ospite-microbioma. Con la sua pianta corporea trasparente e i microbi naturali marcati con fluorescenza, i livelli relativi di microbi all'interno del microbioma intestinale di un singolo animale di C. elegans possono essere facilmente quantificati utilizzando un grande selezionatore di particelle. Qui descriviamo le procedure per l'impostazione sperimentale di un microbioma, la raccolta e l'analisi delle popolazioni di C. elegans nella fase di vita desiderata, il funzionamento e la manutenzione del selezionatore e le analisi statistiche dei set di dati risultanti. Discutiamo anche le considerazioni per l'ottimizzazione delle impostazioni del selezionatore in base ai microbi di interesse, lo sviluppo di strategie di gating efficaci per le fasi di vita di C. elegans e come utilizzare le capacità del selezionatore per arricchire le popolazioni animali in base alla composizione del microbioma intestinale. Esempi di potenziali applicazioni saranno presentati come parte del protocollo, incluso il potenziale di scalabilità per applicazioni ad alto throughput.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'evoluzione animale è sotto costante influenza microbica1. Da diversi microbi presenti nell'ambiente, gli ospiti animali acquisiscono partner specifici2 che estendono le capacità dell'ospite e guidano la sua fisiologia e suscettibilità alle malattie3. Ad esempio, le analisi metagenomiche del microbioma intestinale hanno scoperto classi metaboliche arricchite di geni microbici che possono conferire una maggiore raccolta e immagazzinamento di energia nei topi obesi4, molti dei quali si trovano anche nel microbioma intestinale umano5. C'è ancora un grande bisogno di stabilire relazioni causali e individuare i determinanti molecolari dell'impatto del microbioma, anche se i progressi sono stati ostacolati dalle complessità del microbioma e dalla trattabilità dei sistemi ospiti per lo screening su larga scala.

L'organismo modello C. elegans fornisce una piattaforma per far progredire la comprensione molecolare dei legami tra microbioma e fisiologia dell'ospite. C. elegans possiede 20 cellule intestinali con uno strato mucoso e strutture di villi. Queste cellule sono dotate di abbondanti geni chemorecettori che rilevano i prodotti microbici e producono molecole antimicrobiche che potenzialmente regolano i loro colonizzatori intestinali 6,7. Questa biologia conservata di C. elegans ha portato a un numero enorme di scoperte nella segnalazione dell'ospite che regola i microbi intestinali, tra cui la segnalazione dell'insulina, il TGF-beta e la MAP chinasi 8,9,10.

C. elegans utilizza i microbi sia come dieta per la crescita durante lo sviluppo che come microbioma da adulti. Con l'avanzare dell'età, alcuni microbi possono accumularsi eccessivamente nel lume intestinale e la relazione ospite-microbo si sposta dalla simbiosi alla patogenesi11. Nel suo habitat naturale, C. elegans incontra una vasta gamma di specie batteriche12,13. Il sequenziamento dell'rDNA 16S da campioni rappresentativi raccolti in habitat naturali (frutti marci, fusto vegetale e vettori animali) ha rivelato che il microbioma naturale di C. elegans è dominato da quattro phyla batterici: Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes e Actinobacteria. All'interno di queste divisioni si trova una grande variazione nella diversità e nella ricchezza dei batteri in base all'habitat12,13,14,15. Sono state istituite diverse comunità definite, tra cui le collezioni di 63 membri (BIGbiome)16 e 12 membri (CeMbio) che rappresentano i principali generi di microbioma creati per la comunità di ricerca di C. elegans 17. Sia i microbiomi che i ceppi componenti possono avere un impatto diverso sulla fisiologia di C. elegans, come le dimensioni corporee, i tassi di crescita e le risposte allo stress 9,16,17. Questi studi forniscono risorse ed esempi per stabilire C. elegans come modello per la ricerca sul microbioma.

Qui viene presentato un flusso di lavoro basato su Large Particle Sorter (LPS) (Figura 1) che utilizza il sistema C. elegans per misurare simultaneamente la composizione del microbioma e le misure di base della fisiologia dell'ospite su scala di popolazione. Dal punto di vista microbico, il flusso di lavoro è adattabile per assemblare un microbioma definito o singoli microbi per testare la robustezza e la plasticità della comunità con interazioni microbiche crescenti. Dal punto di vista dell'ospite, il flusso di lavoro consente saggi ad alto rendimento per misurare i livelli di colonizzazione dei microbi fluorescenti nel microbioma e la lettura fisiologica dell'ospite in termini di sviluppo, dimensioni corporee e riproduzione. Nel complesso, il modello di microbioma di C. elegans consente di individuare i determinanti metabolici e genetici che modulano la fisiologia dell'ospite.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparazione della miscela di microbioma

  1. Timbrare o striare i batteri da un brodo congelato di glicerolo su una piastra di brodo di lisogenia (LB) o su un terreno di crescita appropriato e far crescere durante la notte a una temperatura ottimale in base ai ceppi batterici di interesse (in genere 25 °C per i microbi naturali di C. elegans ).
  2. Dalla piastra LB, utilizzare una singola colonia di ciascun isolato batterico (ad esempio, 12 batteri della collezione CeMbio) per inoculare 800 μL di terreno LB in pozzetti separati di una piastra a pozzetti profondi da 1 mL. Incubare per una notte alla temperatura ottimale agitando a 250 giri/min.
    NOTA: Questo protocollo è ottimizzato per l'uso con microbiomi naturali definiti (ad es. CeMbio), ma può essere facilmente adattato per i singoli microbi mediante crescita in condizioni appropriate o altri recipienti di coltura (provette).
  3. Valutare la crescita di ciascun microbo mediante spettrofotometria. Trasferire un'aliquota da 20 μL a 80 μL di LB e aggiungere la soluzione a una piastra trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti. Misurare l'OD600 su un lettore di piastre.
  4. Dopo la crescita notturna, centrifugare la piastra di coltura a pozzetti profondi a 4.000 x g per 10 minuti per pellet batterici e rimuovere il surnatante mediante aspirazione utilizzando un collettore di aspirazione a 96 pozzetti o una pipetta multicanale.
  5. Utilizzando i valori di OD 600, normalizzare la concentrazione di ciascun microbo a un OD finale di600 di 1,0 utilizzando un terreno sterile M9.
  6. Se si combinano microbi, determinare la quantità di coltura batterica necessaria per l'esperimento e creare una miscela master del microbioma combinando volumi uguali di ciascun ceppo batterico in una provetta di dimensioni sufficienti (ad esempio, provette da 5 mL o 15 mL).
  7. Individuare 30-50 μL di microbi con un OD finale600 di 1,0 al centro di ciascuna piastra contenente agar del terreno di crescita del nematode (NGM) o del pozzetto18. Lasciare che il microbioma seminato cresca durante la notte a una temperatura ottimale (25 °C qui).
    NOTA: Preparare in anticipo le piastre di agar NGM secondo le istruzioni contenute nel Wormbook o utilizzando polvere di NGMpremiscelata 18. Ad esempio, vengono aggiunti 3 mL di NGM per le piastre a 12 pozzetti e 1,5 mL per le piastre a 24 pozzetti.

2. Preparazione di C. elegans sincronizzato per la crescita sul microbioma

  1. Far crescere circa 100 vermi su piastre NGM (6 cm di diametro) seminate con Escherichia coli OP50, fino a quando i vermi raggiungono l'età adulta gravida. Ai fini di questo protocollo, è stato utilizzato il ceppo N2 di C. elegans , anche se il protocollo può essere facilmente adattato ad altri ceppi di nematodi.
  2. Aggiungere 6 mL di tampone M9 (più lo 0,01% di tritone X-100; M9-TX) alla piastra, pipettando su e giù per lavare via circa 100 vermi adulti gravidi in una provetta conica da 15 ml.
  3. Prepara la soluzione di candeggina appena preparata mescolando due parti di candeggina con una parte di NaOH 5 M.
  4. Centrifugare i vermi a 3.000 x g per 30 secondi per pellettare i vermi. Aspirare per ridurre il volume a 4 ml, quindi aggiungere 2 ml di soluzione di candeggina.
  5. Chiudere bene il coperchio e agitare il tubo. Monitorare i vermi adulti nella soluzione con uno stereomicroscopio con un ingrandimento 10x. Quando i corpi adulti iniziano a rompersi, in genere dopo 3,5 minuti, interrompere l'agitazione e centrifugare a 3.000 x g per 30 secondi.
  6. Aspirare a un volume minimo con una pipetta. Risospendere, centrifugare e aspirare quattro volte in M9-TX per lavare via la candeggina.
  7. Risospendere in 4-6 mL di M9-TX e posizionare la provetta su un rotatore durante la notte, consentendo alle uova di schiudersi e sincronizzarsi allo stadio L1.
  8. Il giorno successivo, prelevare 10 μL di vermi L1 in M9-TX dalla provetta e lasciarli cadere su una capsula di Petri pulita. Conta il numero di vermi L1 viventi sotto uno stereomicroscopio con un ingrandimento totale di 20x.
  9. In base alla densità L1, pipettare il volume appropriato per far cadere ~50 larve L1 sincronizzate sul bordo delle piastre NGM seminate nel microbioma e incubare a 20 °C. Lascia crescere i vermi fino all'età desiderata (Giorno 2 o Giorno 3 dell'età adulta).

3. Raccolta della popolazione di vermi per l'analisi del microbioma intestinale

  1. Lavare via i vermi dal prato batterico con 1-2 ml di M9-TX in una piastra profonda sterilizzata da 2 mL a 96 pozzetti.
    NOTA: Per i ceppi microbici che creano biofilm significativi, agitare la piastra con liquido per 5 minuti per rompere i detriti microbici.
  2. Centrifugare la piastra a pozzetti profondi a 300 x g per 1 minuto per pellettare i vermi, quindi rimuovere il liquido utilizzando un collettore di aspirazione.
    NOTA: Gli utenti possono utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere manualmente il liquido se non è disponibile un collettore di aspirazione. Assicurarsi che i puntali delle pipette non tocchino il fondo dei pozzetti per evitare la perdita di campioni di vermi.
  3. Aggiungere 1,8 mL di M9-TX a ciascun pozzetto della piastra a pozzetti profondi utilizzando una pipetta multicanale da 1,2 mL. Mescolare pipettando su e giù un paio di volte e centrifugare a 300 x g per 1 min. Ripeti questo passaggio quattro volte per rimuovere i batteri nel liquido.
  4. Dopo il lavaggio finale, portare il volume in ogni pozzetto a 100 μL utilizzando il collettore di aspirazione.
    NOTA: Per separare gli adulti dalle larve usando la gravità, lasciare la piastra sul banco per 30-60 s, consentendo ai vermi adulti di affondare sul fondo del pozzo. Quindi, aspirare la piastra per rimuovere le larve dalla sospensione.
  5. Aggiungere 100 μL di levamisolo 10 mM in M9-TX a ciascun pozzetto e lasciare che i vermi si paralizzino per 5 minuti. Dopo il trattamento con levamisolo, aggiungere il 4% della soluzione di candeggina descritta al punto 2.3 in ciascun pozzetto per 2 minuti per ridurre i grumi batterici, se necessario. Lavare con M9-TX due volte dopo il trattamento con candeggina e aspirare fino a un volume finale di 100 μL dopo il secondo lavaggio.
  6. Trasferire i worm su una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti contenente 150 μL di levamisolo da 10 mM in M9-TX. Mantieni la densità dei vermi a 50-100 per pozzetto e dividi i vermi in più pozzetti se la popolazione è troppo affollata.

4. Impostazione del selezionatore di particelle di grandi dimensioni e dell'autocampionatore

  1. Accendere il compressore d'aria, il computer e lo strumento LPS. Controllare e svuotare il serbatoio di scarico. Quindi, aggiungere 500 ml di candeggina nel serbatoio di scarico vuoto. Controllare e riempire la guaina e i serbatoi dell'acqua se il volume è basso. Assicurarsi che il gruppo conduttore fluidico e ottico (FOCA) da 250 μm sia in posizione.
  2. Eseguire le particelle di controllo per il controllo qualità. Aprire il software dello strumento LPS. Nella finestra del software, selezionare Abilita laser per accendere i laser a 488 nm e 561 nm.
    NOTA: È possibile saltare i passaggi 4.2-4.5 se le particelle di controllo sono state eseguite nelle 2 settimane precedenti e l'UFAC non è stato modificato in quel periodo.
  3. Selezionare Imposta > particelle di controllo. Selezionare No nel prompt per passare alle impostazioni predefinite. Vortex le particelle di controllo (10 mL dH2O e 10 mL di particelle di controllo in una provetta conica da 50 mL) prima di ogni utilizzo e caricarle sulla porta del campione.
  4. Quando si è pronti, fare clic su Acquisisci per registrare 500 eventi. Assicurati che la frequenza degli eventi sia compresa tra 15 e 30 eventi/s.
    NOTA: Se la frequenza degli eventi non è compresa tra 15 e 30 eventi/s, è necessario contattare un tecnico per regolare le impostazioni della macchina.
  5. Esaminare il coefficiente di variazione (CV) per tutti i parametri. Se CV < 15%, il controllo di qualità è superato e il software LPS può essere chiuso. Se CV > 15%, eseguire di nuovo e regolare i micrometri con particelle di controllo appena realizzate per allineare il laser con la cella di flusso.
  6. Collegare e accendere l'autocampionatore. Aprire il software dello strumento autocampionatore. In questo modo si apre l'autocampionatore e il software LPS. Nella finestra del software LPS, vai a File > Nuovo esperimento, quindi File > Nuovo campione. Selezionare Abilita laser per accendere laser a 488 nm e 561 nm se non è già stato fatto.
  7. È possibile creare modelli per i dot plot di acquisizione utilizzando i canali TOF (Time of Flight), EXT (EXT) e fluorescenti nella finestra del software LPS. Un buon numero massimo di partenza per catturare tutti i vermi è 8.000 per TOF ed EXT. Le scale di fluorescenza variano in base a ciascun microbo. Includere campioni di vermi di controllo cresciuti su microbo non fluorescente (ad esempio, OP50) e ciascun microbo fluorescente da solo (se si mescolano microbi) come controlli in ogni esperimento.
    1. Fare clic con il pulsante destro del mouse all'interno del corpo di un grafico per modificare la scala. Utilizzare animali di controllo come gli adulti del Day 1 o gli L1 sincronizzati (o la popolazione di interesse) per assistere nella selezione del gating TOF ed EXT.
  8. Nella finestra del campionatore automatico, selezionare Prime. Vai su File > Apri script per selezionare lo script incorporato corretto, quindi fai clic su OK.
    1. Solo per l'analisi, selezionare lo script con Acquisisci. Per l'ordinamento, selezionare lo script con Dispense. Per l'acquisizione da piastre a 96 pozzetti, selezionare lo script con 96 pozzetti; Per l'acquisizione da piastre a 384 pozzetti, selezionare lo script con 384 pozzetti. Per il volume del campione (40 o 100 μL), selezionare lo script con il volume corrispondente.
  9. Andare su Modello piastra nel menu del software dell'autocampionatore per selezionare i pozzetti desiderati per l'analisi. Caricare i campioni di controllo. Dopo che la piastra è stata caricata sul tavolino dell'autocampionatore e fissata, premere Run Plate nella finestra dell'autocampionatore. Salvare il file quando richiesto.
    NOTA: I campioni di controllo e le impostazioni possono essere eseguiti con una provetta conica da 50 mL sulla porta del campione LPS prima di collegare il campionatore LP.
  10. Al termine dell'acquisizione, fare clic sul pulsante Memorizza dati nella barra multifunzione superiore nella finestra del software LPS e salvare nuovamente i dati.

5. Analisi delle caratteristiche di C. elegans e dei livelli di microbioma intestinale per animale

  1. I dati grezzi vengono archiviati in tre tipi di file: .lmd, .bxr3, .txt. Caricare il file di testo etichettato .txt nel programma R per l'analisi. Completare i passaggi riportati di seguito in R19.
  2. Utilizzare il pacchetto tidyverse20 come framework per l'analisi.
  3. Utilizzando la funzione ggplot (inclusa in tidyverse) traccia i dati LPS utilizzando i valori TOF come asse x e i valori EXT come asse y. Un grafico normale mostrerà due nuvole di punti. Assicurati che uno sia vicino all'origine e all'asse x, indicando particelle più piccole come larve e piccoli detriti e che il secondo gruppo di particelle sia verso l'alto a destra del grafico e rappresenti i nematodi adulti.
  4. Utilizzando questo raggruppamento come guida, scegliere i valori di cut-off TOF ed EXT adeguati. Il gating può variare in base ai ceppi di C. elegans su diversi microbi in base ai cambiamenti nella fisiologia (ad esempio, gli animali scuri rispetto a quelli chiari o i cambiamenti nel trasporto delle uova possono alterare i coefficienti EXT).
  5. Utilizzare il sottoinsieme di funzioni per separare adulti e larve mediante gating TOF ed EXT. Nell'esempio riportato di seguito, utilizzare le impostazioni TOF > 1.200 e EXT > 1.000 per il gate per gli animali adulti.
  6. Analizzare i set di dati risultanti per le differenze statistiche; usare la funzione t-test in R per questo esperimento.
    1. Per determinare l'impatto del microbioma sulle dimensioni e sulla densità ottica di C. elegans, confrontare i valori TOF ed EXT, rispettivamente, tra le condizioni. Il TOF è un indicatore delle dimensioni dei vermi e può indicare cambiamenti nei tassi di crescita degli animali in momenti specifici. I cambiamenti dell'EXT sono maggiori tra la fine dello sviluppo e l'età adulta a causa della luce diffusa dalle uova e possono essere utilizzati per valutare i cambiamenti nei tempi di tale transizione e fecondità. Valutare la proporzione e le distribuzioni della progenie se sono state mantenute durante le analisi.
    2. Per determinare i cambiamenti nei livelli di colonizzazione del microbioma intestinale, normalizzare prima i valori di fluorescenza (ad esempio, colonne rosse o verdi) dividendo per i singoli valori TOF per ciascun animale. Man mano che i vermi crescono di dimensioni e diventano adulti, anche il volume del loro intestino aumenta. La normalizzazione aiuta a ridurre gli artefatti derivanti dalle differenze nella distribuzione delle dimensioni degli animali campione. Utilizzare animali normalizzati per valutare i cambiamenti nella colonizzazione del microbioma intestinale in tutte le condizioni.
      NOTA: un esempio di dati grezzi e gli script R corrispondenti sono disponibili in Supplementary File 1 JOVE_worm_microbiome.txt e Supplementary File 2 JOVE_worm_microbiome.r. Vedere la Figura 2 e la Figura 3 per un esempio rappresentativo di queste analisi dell'ospite e del microbioma utilizzando due batteri fluorescenti.

6. Selezione degli animali di C. elegans in base alle caratteristiche del microbioma intestinale

  1. Raccogliere una popolazione di C. elegans cresciuta su microbi marcati con fluorescenza (ad esempio, RFP) come descritto nel passaggio 3. I vermi devono essere posti in provette coniche da 50 mL con un minimo di 5 mL di campione. Punta a circa 2.000 vermi/mL compresi tutti gli adulti e la prole.
    NOTA: Questa operazione può essere eseguita anche in una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti utilizzando il campionatore LP. Mantenere la densità dei vermi a 50-100 per pozzetto.
    1. Se è stato utilizzato il campionatore LP, spegnere e scollegare il campionatore LP. Ricollegare le linee di campionamento e di spurgo all'LPS prima di eseguire lo smistamento.
  2. Apri il software LPS, vai su File > Nuovo esperimento , quindi su File > Nuovo campione. Create un dot plot con TOF sull'asse x ed Estinzione sull'asse y. Create un altro grafico a punti con TOF sull'asse x e rosso sull'asse y. Utilizzare la stessa scala degli assi e le stesse impostazioni laser utilizzate in precedenza. Selezionare Abilita laser per l'accensione di laser a 488 nm e 561 nm
    NOTA: se questi grafici sono stati creati in precedenza, passare a File > Open Experiment e File > Open Sample per caricare i grafici.
    1. Posizionare la provetta del campione di controllo sulla porta del campione. Nella finestra di dialogo Acquisisci/Eroga fare clic su Acquisisci. Salvare il file quando richiesto. Dopo aver misurato un numero sufficiente di vermi per distinguere le popolazioni, fare clic su Interrompi.
      NOTA: Le portate devono essere di circa 15-30 eventi/s. In caso contrario, regolare le concentrazioni di vermi per garantire che i singoli animali vengano analizzati o selezionati per goccia. Nell'LPS, i vermi passano attraverso il percorso del laser in diverse posizioni (dritta o arricciata o piegata). Possono impiegare una quantità di tempo diversa per passare il laser e il rilevatore a seconda delle loro posizioni.
    2. Nel dot plot TOF vs Extinction disegna un cancello intorno alla popolazione adulta. Nel TOF vs Red dot plot disegna i cancelli intorno alle aree con valori di rosso alti e bassi come regioni di interesse per i vermi adulti con diversi livelli di colonizzazione del microbioma. Vai a Visualizza > gerarchia di controllo e assicurati che i cancelli fluorescenti siano elencati sotto il cancello della popolazione adulta. Dopo aver ottimizzato le impostazioni, vai a File > Salva esperimento e File > Salva campione.
      NOTA: Nell'esempio riportato di seguito, selezionare gli animali in base alle porte TOF/EXT per gli adulti e ordinarli in pool che presentano un'alta o bassa colonizzazione con batteri fluorescenti rossi che esprimono proteine. Tuttavia, qualsiasi combinazione di parametri misurati dall'LPS può essere utilizzata per identificare la popolazione o le popolazioni di interesse.
  3. Prima dello smistamento, assicurarsi che sia stato caricato l'apparecchio di raccolta appropriato. Per caricare la piastra a 96 pozzetti sull'apparecchio di raccolta, selezionare Carica piastra A > Sposta nella sezione Sposta fase della finestra di dialogo Acquisisci/Eroga per consentire alla piastra di raccolta di spostarsi in una posizione preparata per il caricamento di una piastra a 96 pozzetti.
  4. Per lo smistamento in blocco, selezionare la dimensione appropriata della provetta e fare clic su Sposta per caricare una provetta conica da 15 mL o 50 mL. Nella sezione Ordinamento (Sorting) della finestra di dialogo Acquisisci/Eroga (Acquire/Dispense), scegliete il gate di smistamento dall'elenco a discesa delle regioni create. Immettere il numero di oggetti della regione definita da erogare a una provetta di raccolta direttamente sotto l'ugello della cella di flusso. Fare clic sul pulsante Ordinamento in blocco nella finestra di dialogo Acquisisci/Eroga.
  5. Per il dosaggio su una piastra a 96 pozzetti, andare a Configurazione delle piastre > > Piastre calibrate > Piastra a 96 pozzetti. Quindi vai a Visualizza > modello di piastra, seleziona i pozzetti in cui verranno ordinati i vermi, inserisci il numero di oggetti da ordinare in ciascun pozzetto e seleziona le aree chiuse di interesse. Se più di una regione recintata verrà ordinata nella stessa piastra, selezionare la casella Gate Each Well. Fare clic su OK per salvare le modifiche.
  6. Dopo aver assegnato i numeri e le posizioni di ordinamento, fare clic sui pulsanti Fill Plate (Riempi piastra ) nella finestra di dialogo Acquisisci/Eroga (Acquire/Dispense) per avviare l'erogazione su una piastra a 96 pozzetti.
    1. Prima di riempire l'intera piastra a 96 pozzetti, eseguire lo smistamento di prova di un sottogruppo di animali o controlli in una piastra a 96 pozzetti e analizzarla utilizzando uno stereomicroscopio per assicurarsi che siano stati ordinati i numeri appropriati e le popolazioni animali desiderate. Una volta confermata l'accurata cernita, ripetere i passaggi 6.3-6.6 per i campioni sperimentali. Fare clic sul pulsante Memorizza dati sulla barra multifunzione in alto nella finestra del software LPS per salvare nuovamente i dati.
      NOTA: Tutte le misurazioni (EXT, TOF, RFP, GFP, ecc.) possono essere raccolte anche per gli animali selezionati e confrontate con quelli che non sono stati selezionati. Ciò può consentire l'esecuzione simultanea delle modalità di analisi e ordinamento, se lo si desidera.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Definizione dei gate di popolazione di adulti e larve
Qui, i C. elegans L1 sincronizzati sono stati coltivati su una piastra NGM seminata con E. coli OP50 (Eco), una dieta standard di laboratorio. Le popolazioni di C. elegans sono state raccolte per l'analisi LPS dopo 96 o 120 ore di crescita a 20 °C (Figura 2A). Un dot plot dell'estinzione (EXT, un proxy della densità del corpo) rispetto al tempo di volo (TOF, un proxy della lunghezza del corpo...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La vermimetria a flusso è stata utilizzata per caratterizzare i geni e le vie di C. elegans contro la colonizzazione e la tossicità dei patogeni in diversi studi21,22. Qui, viene presentato un approccio ad alto rendimento che utilizza C. elegans per studiare come i microbiomi intestinali modulano la fisiologia dell'ospite. Rispetto ai metodi esistenti che utilizzano unità formanti colonie (CFU) o il sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni NIH DP2DK116645 (a BSS), dal premio pilota della Fondazione Dunn e dalla sovvenzione NASA 80NSSC22K0250 (a BSS). Questo progetto è stato anche sostenuto dal Cytometry and Cell Sorting Core presso il Baylor College of Medicine con il finanziamento del CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), del NIH (S10 OD025251, CA125123 e RR024574) e l'assistenza di Joel M. Sederstrom, oltre a una sovvenzione per la strumentazione per la sovvenzione LPS NIH (S10 OD025251). Alcuni ceppi sono stati forniti dal CGC, che è finanziato dall'Ufficio NIH dei programmi di infrastruttura di ricerca (P40 OD010440).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette da centrifuga a fondo conico da 15 mLVWR10026-076
96 piastre a pozzetti profondi (1 mL)AxygenP-DW-11-C
96 piastre a pozzetti profondi (2 mL)AxygenP-DW-20-C
Piastra Costar a 96 pozzettiCorning3694
AgarMillipore SigmaÈ sufficiente anche l'agar batteriologico standard.
Collettore di aspirazioneV& P scientificVP1171A
CandegginaClorox
Soluzione di candeggina Miscelare la candeggina con l'ipoclorito di sodio 5M 2:1 (v/v)
Lettore multimodale per imaging cellulareBiotekCytation 5Misurazione del OD batterico
CentrifugaThermo scientific Sorvall Legend XTRPer piastra a 96 pozzetti e tubi conici
Microscopio fluorescenteNikonTiE
ggplot: Vari strumenti di programmazione R per la rappresentazione grafica dei dati.Pacchetto RVersione 3.3.2
Autocampionatore di particelle di grandidimensioni Union BiometricaLP Sampler
Selezionatore di particelle di grandidimensioni Union BiometricaCOPAS Biosorter
LevamisoleFisherAC187870100
Brodo di lisogenesi (LB)RPIL24066Le ricette casalinghe standard LB con Bacto-triptone, estratto di lievito e NaCl sono anche sufficiente.
Soluzione M9 22 mM KH2PO4 monobasico, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Terreno di crescita RPIN81800-1000,01 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4 aggiunto dopo autoclave.
RStudioGNUVersione 1.3.1093
Ipoclorito di sodioSigma-Aldrich5M NaOH
StereomicroscopioNikonSMZ745
Piastre di Petri sterili da 10 cm di diametroCorning351029
Piastre sterili a 12 pozzettiVWR10062-894
Piastre sterili a 24 pozzettiVWR10062-896
Piastre di Petri sterili da 6 cm di diametroCorning351007
Triton X-100Sigma-AldrichT8787

References

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