Applicazione della vermimetria a flusso per la quantificazione e l'analisi del microbioma intestinale di Caenorhabditis elegans

Summary

Caenorhabditis elegans è un potente modello per esaminare i determinanti molecolari che guidano le interazioni ospite-microbioma. Presentiamo una pipeline ad alto rendimento che profila i livelli di colonizzazione del microbioma intestinale dei singoli animali insieme ad aspetti chiave della fisiologia di C. elegans.

Abstract

La composizione del microbioma intestinale può avere un impatto drammatico sulla fisiologia dell'ospite durante lo sviluppo e la vita dell'animale. Misurare i cambiamenti di composizione nel microbioma è fondamentale per identificare le relazioni funzionali tra questi cambiamenti fisiologici. Caenorhabditis elegans è emerso come un potente sistema ospite per esaminare i driver molecolari delle interazioni ospite-microbioma. Con la sua pianta corporea trasparente e i microbi naturali marcati con fluorescenza, i livelli relativi di microbi all'interno del microbioma intestinale di un singolo animale di C. elegans possono essere facilmente quantificati utilizzando un grande selezionatore di particelle. Qui descriviamo le procedure per l'impostazione sperimentale di un microbioma, la raccolta e l'analisi delle popolazioni di C. elegans nella fase di vita desiderata, il funzionamento e la manutenzione del selezionatore e le analisi statistiche dei set di dati risultanti. Discutiamo anche le considerazioni per l'ottimizzazione delle impostazioni del selezionatore in base ai microbi di interesse, lo sviluppo di strategie di gating efficaci per le fasi di vita di C. elegans e come utilizzare le capacità del selezionatore per arricchire le popolazioni animali in base alla composizione del microbioma intestinale. Esempi di potenziali applicazioni saranno presentati come parte del protocollo, incluso il potenziale di scalabilità per applicazioni ad alto throughput.

Introduction

L'evoluzione animale è sotto costante influenza microbica¹. Da diversi microbi presenti nell'ambiente, gli ospiti animali acquisiscono partner specifici² che estendono le capacità dell'ospite e guidano la sua fisiologia e suscettibilità alle malattie³. Ad esempio, le analisi metagenomiche del microbioma intestinale hanno scoperto classi metaboliche arricchite di geni microbici che possono conferire una maggiore raccolta e immagazzinamento di energia nei topi obesi⁴, molti dei quali si trovano anche nel microbioma intestinale umano⁵

Protocol

1. Preparazione della miscela di microbioma

1. Timbrare o striare i batteri da un brodo congelato di glicerolo su una piastra di brodo di lisogenia (LB) o su un terreno di crescita appropriato e far crescere durante la notte a una temperatura ottimale in base ai ceppi batterici di interesse (in genere 25 °C per i microbi naturali di C. elegans ).
2. Dalla piastra LB, utilizzare una singola colonia di ciascun isolato batterico (ad esempio, 12 batteri della collezione CeMbio) per inoculare 800 μL di terreno LB in pozzetti separati di una piastra a pozzetti profondi da 1 mL. Incubare per una notte alla temperatura ottimale agitando....

Results

Definizione dei gate di popolazione di adulti e larve
Qui, i C. elegans L1 sincronizzati sono stati coltivati su una piastra NGM seminata con E. coli OP50 (Eco), una dieta standard di laboratorio. Le popolazioni di C. elegans sono state raccolte per l'analisi LPS dopo 96 o 120 ore di crescita a 20 °C (Figura 2A). Un dot plot dell'estinzione (EXT, un proxy della densità del corpo) rispetto al tempo di volo (TOF, un proxy della lunghezza del corpo.......

Discussion

La vermimetria a flusso è stata utilizzata per caratterizzare i geni e le vie di C. elegans contro la colonizzazione e la tossicità dei patogeni in diversi studi^21,22. Qui, viene presentato un approccio ad alto rendimento che utilizza C. elegans per studiare come i microbiomi intestinali modulano la fisiologia dell'ospite. Rispetto ai metodi esistenti che utilizzano unità formanti colonie (CFU) o il sequenziamento dell'amplicone dell'rRNA 16S

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette da centrifuga a fondo conico da 15 mL	VWR	10026-076
96 piastre a pozzetti profondi (1 mL)	Axygen	P-DW-11-C
96 piastre a pozzetti profondi (2 mL)	Axygen	P-DW-20-C
Piastra Costar a 96 pozzetti	Corning	3694
Agar	Millipore Sigma		È sufficiente anche l'agar batteriologico standard.
Collettore di aspirazione	V& P scientific	VP1171A
Candeggina	Clorox
Soluzione di candeggina			Miscelare la candeggina con l'ipoclorito di sodio 5M 2:1 (v/v)
Lettore multimodale per imaging cellulare	Biotek	Cytation 5	Misurazione del OD batterico
Centrifuga	Thermo scientific	Sorvall Legend XTR	Per piastra a 96 pozzetti e tubi conici
Microscopio fluorescente	Nikon	TiE
ggplot: Vari strumenti di programmazione R per la rappresentazione grafica dei dati.	Pacchetto R	Versione 3.3.2
Autocampionatore di particelle di grandi	dimensioni Union Biometrica	LP Sampler
Selezionatore di particelle di grandi	dimensioni Union Biometrica	COPAS Biosorter
Levamisole	Fisher	AC187870100
Brodo di lisogenesi (LB)	RPI	L24066	Le ricette casalinghe standard LB con Bacto-triptone, estratto di lievito e NaCl sono anche sufficiente.
Soluzione M9			22 mM KH2PO4 monobasico, 42,3 mM Na2HPO4, 85,6 mM NaCl, 1 mM MgSO4
Nematode Terreno di crescita RPI		N81800-1000,0	1 mM CaCl2, 25 mM KPO4 pH 6,0, 1 mM MgSO4 aggiunto dopo autoclave.
RStudio	GNU	Versione 1.3.1093
Ipoclorito di sodio	Sigma-Aldrich		5M NaOH
Stereomicroscopio	Nikon	SMZ745
Piastre di Petri sterili da 10 cm di diametro	Corning	351029
Piastre sterili a 12 pozzetti	VWR	10062-894
Piastre sterili a 24 pozzetti	VWR	10062-896
Piastre di Petri sterili da 6 cm di diametro	Corning	351007
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787