Analisi unicellulare dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae all'interno del tessuto vegetale

Sommario

Il presente protocollo descrive un metodo che consente l'analisi dell'espressione genica unicellulare su popolazioni di Pseudomonas syringae coltivate all'interno dell'apoplasto della pianta.

Abstract

Una pletora di microrganismi patogeni attacca costantemente le piante. Il complesso di specie Pseudomonas syringae comprende batteri patogeni delle piante Gram-negativi di particolare rilevanza per un ampio numero di ospiti. P. syringae entra nella pianta dalla superficie fogliare e si moltiplica rapidamente all'interno dell'apoplasto, formando microcolonie che occupano lo spazio intercellulare. L'espressione costitutiva delle proteine fluorescenti da parte dei batteri consente la visualizzazione delle microcolonie e il monitoraggio dello sviluppo dell'infezione a livello microscopico. I recenti progressi nell'analisi di singole cellule hanno rivelato la grande complessità raggiunta dalle popolazioni batteriche isogeniche clonali. Questa complessità, indicata come eterogeneità fenotipica, è la conseguenza delle differenze cellula-cellula nell'espressione genica (non legate a differenze genetiche) tra la comunità batterica. Per analizzare l'espressione dei singoli loci a livello di singola cellula, sono state ampiamente utilizzate fusioni trascrizionali in proteine fluorescenti. In condizioni di stress, come quelle che si verificano durante la colonizzazione dell'apoplasto della pianta, P. syringae si differenzia in sottopopolazioni distinte in base all'espressione eterogenea di geni chiave di virulenza (cioè il sistema di secrezione di tipo III Hrp). Tuttavia, l'analisi a singola cellula di una determinata popolazione di P. syringae recuperata dal tessuto vegetale è impegnativa a causa dei detriti cellulari rilasciati durante l'interruzione meccanica intrinseca ai processi di inoculazione ed estrazione batterica. Il presente rapporto descrive un metodo sviluppato per monitorare l'espressione dei geni P. syringae di interesse a livello di singola cellula durante la colonizzazione di piante di Arabidopsis e fagioli. Vengono descritte la preparazione delle piante e le sospensioni batteriche utilizzate per l'inoculazione mediante camera a vuoto. Qui viene spiegato anche il recupero dei batteri endofiti dalle foglie infette mediante estrazione di liquido apoplastico. Sia l'inoculazione batterica che i metodi di estrazione batterica sono ottimizzati empiricamente per ridurre al minimo il danno alle cellule vegetali e batteriche, risultando in preparati batterici ottimali per la microscopia e l'analisi della citometria a flusso.

Introduzione

I batteri patogeni mostrano differenze nei diversi fenotipi, dando origine alla formazione di sottopopolazioni all'interno di popolazioni geneticamente identiche. Questo fenomeno è noto come eterogeneità fenotipica ed è stato proposto come strategia di adattamento durante le interazioni batterio-ospite¹. I recenti progressi nella risoluzione ottica dei microscopi confocali, della citometria a flusso e della microfluidica, combinati con proteine fluorescenti, hanno favorito l'analisi a singola cellula delle popolazioni batteriche².

La Pseudomonas syringae Gram-negativa è un batterio pa....

Protocollo

1. Preparazione delle piante

1. Preparare le piante di Arabidopsis Col-0 seguendo i passaggi seguenti.
   1. Riempire un vaso di 10 cm di diametro con un mix di substrato vermiculite e pianta 1:3 (vedi Tabella dei materiali), precedentemente annaffiato, e coprire il vaso con una rete metallica di 15 cm x 15 cm con fori da 1,6 mm x 1,6 mm. Regolare la rete metallica sul terreno bagnato usando un elastico (Figura 1A).
   2. Con uno stuzzicadenti bagnato, semina i semi di Arabidopsis nei fori della rete metallica. Metti tre o quattro semi in posizioni distanti all'interno del vaso (

Risultati

L'espressione del sistema di secrezione di tipo III è essenziale per la crescita batterica all'interno della pianta. L'espressione tempestiva dei geni T3SS è ottenuta attraverso una regolazione complessa, al centro della quale c'è il fattore sigma della funzione extracitoplasmatica (ECF) HrpL, l'attivatore chiave dell'espressione dei geni correlati a T3SS¹¹. Un'analisi dell'espressione di hrpL è stata precedentemente effettuata utilizzando una fusione trascrizionale localizzata dal cromos.......

Discussione

Il metodo qui presentato descrive una procedura non invasiva che consente l'infiltrazione di batteri nel tessuto fogliare vegetale, consentendo la rapida inoculazione di grandi volumi riducendo al minimo la distruzione del tessuto. Una delle caratteristiche del complesso di specie P. syringae è la capacità di sopravvivere e proliferare all'interno dell'apoplast della pianta e sulla superficie della pianta come epifita¹⁴. Pertanto, non si può escludere la possibilità che i batteri estratti.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrino coprioggetti			Nessun requisito speciale
Rete metallica da 1,6 x 1,6 mm	Buzifu		Rete dello schermo in fibra di vetro
Vasi da 10 cm di diametro Nessun			requisito speciale Piastre
		di Petri da 140 mm	Nessun requisito speciale
Siringa			Nessun requisito speciale
Provette coniche da 50 mL	Sarstedt
Agarosio	Merk
Ampicillina sodica	GoldBio
Agar batteriologico	Roko
Microscopio confocale Stellaris	Leica Microsystems
FACSVerse cell analyzer	BD Biosciences
Fiji software
Gentamicina solfato	Duchefa	G-0124
Kanamicina monosolfato	Fitotecnologia	K378
MgCl2	Merk
NaCl	Merk
Parafilm	Pechiney Imballaggio
Substrato			Nessun requisito speciale
Silwet L-77	Cromton Europe Ltd
Stuzzicadenti			Nessun requisito speciale
Pinzetta
Tryptone	Merk
Camera a vuoto 25 cm di diametro	Kartell	554
Pompa a vuoto	GAST	DOA-P504-BN
Vermiculite			Nessun requisito speciale
Estratto di lievito	Merk