Analisi unicellulare dell'espressione dei geni di Pseudomonas syringae all'interno del tessuto vegetale

I batteri patogeni mostrano differenze nei diversi fenotipi, dando origine alla formazione di sottopopolazioni all'interno di popolazioni geneticamente identiche. Questo fenomeno è noto come eterogeneità fenotipica ed è stato proposto come strategia di adattamento durante le interazioni batterio-ospite¹. I recenti progressi nella risoluzione ottica dei microscopi confocali, della citometria a flusso e della microfluidica, combinati con proteine fluorescenti, hanno favorito l'analisi a singola cellula delle popolazioni batteriche².

La Pseudomonas syringae Gram-negativa è un batterio patogeno delle piante archetipico a causa della sua importanza sia accademica che economica³. Il ciclo vitale di P. syringae è legato al ciclo dell'acqua⁴. P. syringae entra negli spazi intercellulari tra le cellule del mesofillo, la foglia della pianta apoplasta, attraverso aperture naturali come stomi o ferite⁵. Una volta all'interno dell'apoplasto, P. syringae si basa sul sistema di secrezione di tipo III (T3SS) e sugli effettori traslocati di tipo III (T3E) per sopprimere l'immunità delle piante e manipolare le funzioni cellulari delle piante a beneficio del patogeno⁶. L'espressione di T3SS e T3E dipende dal regolatore principale HrpL, un fattore sigma alternativo che si lega ai motivi hrp-box nella regione del promotore dei geni bersaglio⁷.

Generando fusioni trascrizionali localizzate dal cromosoma a geni proteici fluorescenti a valle del gene di interesse, è possibile monitorare l'espressione genica in base ai livelli di fluorescenza emessi^{a livello 8} di singola cellula. Utilizzando questo metodo, è stato stabilito che l'espressione di hrpL è eterogenea sia all'interno di colture batteriche coltivate in laboratorio che all'interno di popolazioni batteriche recuperate dalla pianta apoplast ^8,9. Sebbene l'analisi dell'espressione genica a livello monocellulare sia tipicamente eseguita in colture batteriche coltivate in terreni di laboratorio, tali analisi possono essere effettuate anche su popolazioni batteriche che crescono all'interno della pianta, fornendo così preziose informazioni sulla formazione di sottopopolazioni nel contesto naturale. Un potenziale limite per l'analisi delle popolazioni batteriche estratte dalla pianta è che i metodi classici di inoculazione mediante infiltrazione a pressione della siringa nell'apoplast, seguita dall'estrazione batterica mediante macerazione del tessuto fogliare, generano tipicamente una grande quantità di detriti vegetali cellulari che interferiscono con l'analisi a valle¹⁰. La maggior parte dei detriti cellulari è costituita da frammenti autofluorescenti di cloroplasti che si sovrappongono alla fluorescenza GFP, con risultati fuorvianti.

Il presente protocollo descrive il processo di analisi dell'eterogeneità dell'espressione genica di singole cellule in due patosistemi modello: quello formato da P. syringae pv. ceppo di pomodoro DC3000 e Arabidopsis thaliana (Col-0), e l'altro dal P. syringae pv. phaseolicola ceppo 1448A e piante di fagioli (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). Viene proposto un metodo di inoculazione basato sull'infiltrazione sotto vuoto utilizzando una camera a vuoto e una pompa, risultando in un metodo rapido e privo di danni per infiltrarsi nelle foglie intere. Inoltre, come miglioramento rispetto ai protocolli convenzionali, viene utilizzato un metodo più delicato per estrarre la popolazione batterica dall'apoplast che riduce significativamente la rottura dei tessuti, basato sull'estrazione del liquido apoplastico applicando cicli di pressione positiva e negativa utilizzando una piccola quantità di volume all'interno di una siringa.

1. Preparazione delle piante

1. Preparare le piante di Arabidopsis Col-0 seguendo i passaggi seguenti.
   1. Riempire un vaso di 10 cm di diametro con un mix di substrato vermiculite e pianta 1:3 (vedi Tabella dei materiali), precedentemente annaffiato, e coprire il vaso con una rete metallica di 15 cm x 15 cm con fori da 1,6 mm x 1,6 mm. Regolare la rete metallica sul terreno bagnato usando un elastico (Figura 1A).
   2. Con uno stuzzicadenti bagnato, semina i semi di Arabidopsis nei fori della rete metallica. Metti tre o quattro semi in posizioni distanti all'interno del vaso (Figura 1B, C).
   3. Coprire i vasi con una cupola di plastica per mantenere alta l'umidità relativa e incubarli per 72 h a 4 °C per la stratificazione.
      NOTA: La stratificazione (incubazione ad alta umidità e bassa temperatura, come descritto) migliora il tasso di germinazione e sincronia dei semi.
   4. Trasferire i vasi in una camera di crescita delle piante in condizioni di breve durata (8 ore di luce/16 ore di buio a 21 °C, intensità luminosa: 100 μmol·m−²·s⁻¹, umidità relativa: 70%).
   5. Dopo la germinazione dei semi (8-10 giorni), utilizzare le pinzette per rimuovere la maggior parte delle piantine, mantenendo una piantina in ciascuna delle posizioni del vaso (sei piantine / vaso) (Figura 1D). Rimuovere la cupola di plastica per scoprire i vasi.
      NOTA: Le piante saranno pronte all'uso 4-5 settimane dopo la germinazione.
2. Preparare le piante di fagiolo Phaseolus vulgaris (cultivar Canadian Wonder).
   1. Coprire il fondo di una capsula di Petri con un pezzo di carta assorbente bagnato e posizionare i semi di fagioli sopra di esso. Sigillare la capsula di Petri con nastro chirurgico e incubare a 28 °C per 3-4 giorni (Figura 2A).
   2. Trasferire i semi germinati in un vaso di 10 cm di diametro riempito con una miscela di substrato 1:3 umido di vermiculite-pianta.
   3. Incubare in una camera di crescita delle piante in condizioni di lunga giornata (16 ore di luce/8 ore di buio a 23 °C, intensità luminosa: 100 μmol·m−²·s⁻¹, umidità relativa: 70%).
      NOTA: Le piante saranno pronte per l'uso 10 giorni dopo la germinazione (Figura 2B).

2. Inoculazione di Arabidopsis e piante di fagioli

NOTA: In questo studio, i ceppi P. syringae pv. pomodoro DC3000 e P. syringae pv. phaseolicola 1448A.

1. Preparare l'inoculo di P. syringae.
   1. Filtrare il ceppo di interesse di P. syringae da uno stock di glicerolo a -80 °C su una piastra LB (10 g/L di triptone, 5 g/L di NaCl, 5 g/L di estratto di lievito e 16 g/L di agar batteriologico, vedi Tabella dei materiali) integrata con gli antibiotici appropriati. Incubare a 28 °C per 40-48 h.
      NOTA: L'uso di antibiotici è raccomandato se il ceppo di interesse porta un plasmide o un gene di resistenza genomica. Le concentrazioni antibiotiche raccomandate per P. syringae sono le seguenti: kanamicina (15 μg/ml), gentamicina (10 μg/ml), ampicillina (300 μg/ml) (vedere Tabella dei materiali).
   2. Raschiare via la biomassa batterica e risospendere in 5 ml di 10 mM MgCl₂. Misurare l'OD₆₀₀ e regolare a 0,1 aggiungendo 10 mM MgCl₂.
      NOTA: Un OD₆₀₀ di 0,1 di una coltura di P. syringae corrisponde a 5 x 10⁷ CFU·mL⁻¹.
   3. Eseguire diluizioni seriali in 10 mM MgCl₂ per raggiungere una concentrazione finale di inoculo di 5 x 10⁵ CFU·mL⁻¹. Preparare 200 ml di inoculo per le piante di Arabidopsis e 50 ml per le piante di fagioli.
   4. Subito prima dell'inoculazione, aggiungere il tensioattivo Silwett L-77 (vedi tabella dei materiali) ad una concentrazione finale dello 0,02% per l'inoculazione dei fagioli e dello 0,01% per l'arabidopsis. Si noti che Silwett è in qualche modo dannoso per il tessuto Arabidopsis.
2. Eseguire l'infiltrazione sotto vuoto.
   1. Per l'infiltrazione di Arabidopsis, posizionare due bastoncini di legno che formano una X sopra il vaso (Figura 1E) e posizionare il vaso rivolto verso il basso su una capsula di Petri di 14 cm di diametro contenente l'inoculo da 200 ml (Figura 1F).
   2. Per l'inoculazione delle foglie di fagiolo, introdurre la foglia in una provetta conica da centrifuga da 50 mL contenente l'inoculo (Figura 2C).
   3. Inserire le piante immerse nella soluzione di inoculo in una camera a vuoto (Figura 1G e Figura 2D) e dare un impulso di 500 mbar per 30 s per infiltrarsi nelle foglie. Ripetere l'impulso del vuoto 2-3 volte fino a quando la foglia è completamente infiltrata (Figura 1H e Figura 2E).
   4. Scolare la soluzione di inoculo in eccesso con un pezzo di carta e riportare le piante nella loro camera di crescita corrispondente.

3. Estrazione di batteri dall'apoplast

1. Quattro giorni dopo l'inoculazione, tagliare la parte aerea della pianta di Arabidopsis o la foglia inoculata dalla pianta di fagioli e metterla in una siringa da 20 ml senza ago (Figura 2G). Per le foglie di fagiolo, arrotolare la foglia su se stessa, lasciando la faccia abassiale verso l'esterno, come mostrato nella Figura 2F.
2. Aggiungere un volume sufficiente di acqua distillata per coprire il tessuto (di solito 10-15 ml).
3. Inserire lo stantuffo e, con la siringa in posizione verticale con la punta rivolta verso l'alto, rimuovere l'aria in eccesso e le bolle d'aria all'interno della siringa picchiettando delicatamente il cilindro fino a quando tutta l'aria si trova vicino alla punta. Far scorrere quindi lo stantuffo per estrarre l'aria. Una volta che c'è meno aria possibile all'interno della siringa, coprire la punta del cilindro della siringa con pellicola di paraffina.
4. Premere con attenzione lo stantuffo per generare una pressione positiva fino a quando il tessuto diventa più scuro (Figura 1I e Figura 2H). Quindi, tirare lo stantuffo per generare una pressione negativa (Figura 1J e Figura 2I). Ripeti questo passaggio 3-5 volte.
5. Rimuovere la pellicola di paraffina e lo stantuffo e raccogliere il fluido contenente i batteri estratti dall'apoplasto, come nella figura 2J.

4. Analisi unicellulare dei batteri estratti dall'apoplasto

1. Visualizza al microscopio confocale seguendo i passaggi seguenti.
   1. Preparare una soluzione di agarosio all'1,5% in acqua distillata. Una volta fuso, aggiungere un volume sufficiente a riempire lo spazio tra due vetrini da microscopia affiancati e posizionare un altro vetrino sopra di esso (Figura 3). Lasciateli asciugare per 15 minuti e rimuovete con cura il vetrino posto sulla parte superiore. Utilizzando una lama, tagliare il tampone di agarosio in pezzi da 5 mm x 5 mm subito prima dell'uso.
   2. Parallelamente, centrifugare 1 mL dei batteri estratti dall'apoplasto a 12.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente, rimuovere con attenzione il surnatante usando una pipetta e risospendere il pellet in 20 μL di acqua per concentrare le cellule. Porre una goccia di 2 μL delle cellule concentrate su un coprivetrino di 0,17 mm e coprire la goccia con un pezzo di 5 mm x 5 mm del tampone di agarosio precedentemente ottenuto nella fase 1, come illustrato nella figura 3.
   3. Visualizza la preparazione batterica al microscopio confocale (vedi Tabella dei materiali). Per identificare i batteri fluorescenti verdi, utilizzare il laser di eccitazione a 488 nm e un filtro di emissione che va da 500 nm a 550 nm. Per identificare tutti i batteri, utilizzare il campo luminoso e unire entrambi i campi.
   4. Elaborare le immagini confocali utilizzando le Figi (vedi Tabella dei materiali). Per fare ciò, utilizzare il plug-in MicrobeJ per identificare il contorno della cellula batterica e misurare l'intensità della fluorescenza all'interno.
      NOTA: l'acquisizione di immagini da batteri isolati (non raggruppati) è raccomandata per questa analisi.
2. Eseguire analisi mediante citometria a flusso.
   1. Prendi un'aliquota delle sospensioni di batteri estratti dall'apoplasto da analizzare usando il citometro a flusso. Acquisisci 100.000 eventi.
   2. Per discriminare tra batteri e detriti vegetali, analizzare l'apoplast estratto da una pianta non inoculata e confrontare il dot plot che mostra la sua dimensione della cellula di diffusione diretta (FSC) rispetto alla dimensione della cellula di dispersione laterale (SSC) con quella della sospensione batterica estratta dall'apoplasto. Per identificare i batteri non fluorescenti, utilizzare gli apoplasti estratti dalle piante inoculate con batteri isogeni non fluorescenti e confrontare le loro emissioni fluorescenti.

L'espressione del sistema di secrezione di tipo III è essenziale per la crescita batterica all'interno della pianta. L'espressione tempestiva dei geni T3SS è ottenuta attraverso una regolazione complessa, al centro della quale c'è il fattore sigma della funzione extracitoplasmatica (ECF) HrpL, l'attivatore chiave dell'espressione dei geni correlati a T3SS11. Un'analisi dell'espressione di hrpL è stata precedentemente effettuata utilizzando una fusione trascrizionale localizzata dal cromosoma a un gene gfp senza promotore a valle e seguendo i modelli di espressione mediante microscopia confocale e citometria a flusso9. Queste fusioni sono generate attraverso l'integrazione omologa mediata da ricombinazione di costrutti codificati da plasmidi generati attraverso PCR e clonaggio tradizionale e trasportano le ultime 500 coppie di basi dell'ORF del gene di interesse (incluso il codone STOP) e 500 coppie di basi della sequenza immediatamente a valle, fiancheggiando il sito di legame del ribosoma e l'ORF del gene reporter di fluorescenza da utilizzare (in questo caso, GFP), seguita da una cassetta di resistenza agli antibiotici (in questo caso, il gene NPT2 che conferisce resistenza alla kanamicina). Pertanto, è stato stabilito che le popolazioni di P. syringae estratte dall'apoplasta che esprimono geni correlati a T3SS, inclusa hrpL, sono eterogenee nella pianta 9. Su questo precedente, i risultati rappresentativi della microscopia a fluorescenza confocale e dell'analisi citometrica a flusso dell'espressione di hrpL sono mostrati in singole cellule batteriche dei ceppi modello Pph 1448A (Pph) e Pto DC3000 (Pto), estratti dalle foglie di fagiolo o Arabidopsis, rispettivamente, dopo colonizzazione dell'apoplasto fogliare (Figura 4). In ogni ceppo, il gene hrpL cromosomico P. syringae porta una fusione trascrizionale a valle in un gene gfp senza promotore che consente di monitorare l'attività del promotore nativo hrpL seguendo i livelli di espressione di GFP 8,9.

I batteri estratti da Apoplast possono essere utilizzati per diverse analisi. Qui, 300 μL dei suddetti ceppi batterici reporter sono stati estratti dall'apoplast di piante infette di Arabidopsis o fagioli e utilizzati per l'acquisizione dei dati utilizzando un sistema di citometro a flusso (vedi Tabella dei materiali). L'emissione laser a 488 nm e il filtro FITC sono stati utilizzati per il rilevamento GFP. L'analisi della citometria a flusso mostra la distribuzione della fluorescenza nelle singole cellule batteriche all'interno della popolazione. L'espressione eterogenea di hrpL può essere chiaramente osservata mediante citometria a flusso nel Pto estratto da apoplasto di Arabidopsis e nel Pph estratto dall'apoplasto di fagiolo, inclusi i batteri HrpLOFF (non che esprimono GFP), e questi risultati sono supportati dall'esame microscopico dei campioni corrispondenti (Figura 4). I grafici dot plot (pannelli di sinistra) mostrano la distribuzione dell'intensità di fluorescenza della GFP rispetto alla dimensione delle cellule nella popolazione (Figura 4A), mentre gli istogrammi mostrano l'intensità di fluorescenza della GFP rispetto alla conta cellulare (Figura 4B). Queste due diverse rappresentazioni grafiche dei dati di citometria consentono al ricercatore di stabilire sottili sfumature visive e fornire informazioni complementari. Come controllo per l'autofluorescenza batterica, è stato utilizzato il corrispondente ceppo wild-type non GFP (pannello superiore in Figura 4A e istogramma grigio in Figura 4B). Ciò consente di identificare l'area del grafico in cui vengono visualizzati i batteri non GFP all'interno della popolazione. Le analisi di citometria a flusso generano anche dati quantitativi. Ad esempio, le percentuali di cellule HrpLON (fluorescenti) vengono estratte in popolazioni di Pto e Pph estratte da apoplasti. La figura 4C mostra come le percentuali di HrpLON fossero superiori alle corrispondenti percentuali di cellule HrpLOFF (non fluorescenti) in queste popolazioni, in particolare nel modello Pto. Questi dati possono anche essere utilizzati per calcolare la fluorescenza media o mediana per l'intera popolazione. In questo particolare esperimento, è stata ottenuta l'intensità media di fluorescenza GFP, che era più alta per la popolazione di Pto rispetto a Pph, in linea con la sua più alta percentuale di cellule ON. I livelli medi costituiscono dati a livello di popolazione paragonabili ai dati ottenuti attraverso tecniche non a singola cellula come RT-qPCR o RNAseq. Infine, viene mostrato anche il robusto coefficiente di variazione (RCV)12, calcolato come terzo quartile meno il primo quartile diviso per la mediana. L'RCV è spesso utilizzato negli studi di citometria a flusso per stimare la dispersione dei dati (cioè l'eterogeneità dell'espressione all'interno della popolazione)13. Nel presente studio, l'RCV era leggermente più alto per Pph che per Pto, sebbene la differenza non fosse sufficiente a caratterizzare la distribuzione dell'espressione all'interno delle popolazioni di questi due ceppi come significativamente diversi. L'eterogeneità dell'espressione di hrpL può essere confermata visivamente con le immagini al microscopio confocale (Figura 4D). L'uso di cuscinetti di agar per la preparazione al microscopio si traduce in una visualizzazione più semplice e immagini di qualità superiore delle singole cellule poiché spinge i batteri su un singolo strato e impedisce il movimento batterico. Le procedure di inoculazione ed estrazione batterica descritte in questo protocollo riducono al minimo la quantità di detriti vegetali all'interno del preparato batterico, consentendo così l'analisi dell'espressione batterica con queste diverse tecniche (Figura 4).

Figura 1: Inoculazione batterica ed estrazione di apoplast utilizzando piante di Arabidopsis. (A) Preparazione della pentola con la rete metallica opportunamente fissata. (B) Semina con uno stuzzicadenti per distribuirli come indicato alla lettera C). D) piante di Arabidopsis pronte per l'inoculazione. (E) Due bastoncini di legno facilitano l'immersione delle piante nella soluzione batterica senza raggiungere il vaso o il terreno (F). (G) L'insieme può essere collocato all'interno della camera a vuoto. (H) Le foglie infiltrate diventano più scure dopo aver rilasciato il vuoto dalla camera. (I) Le foglie staccate vengono poste in una siringa da 20 ml e coperte d'acqua. (J) Cicli di pressione positiva e negativa provocano l'estrazione dei batteri apoplastici. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Inoculazione batterica ed estrazione di apoplast utilizzando piante di fagioli. (A) Germinazione dei semi di fagioli in piastre di Petri rivestite con carta igienica bagnata. B) Pianta di fagioli pronta per l'inoculazione. C) Foglia di fagiolo immersa nella soluzione batterica contenuta in una provetta da 50 ml. (D) Le foglie vengono inoculate all'interno di una camera a vuoto fino a quando il tessuto diventa più scuro (E). (F) La foglia di fagiolo viene arrotolata, inserita in una siringa da 20 ml e coperta con acqua (G). (H) Cicli di pressione positiva e negativa (I) provocano l'estrazione dei batteri apoplastici che possono essere recuperati in un tubo (J). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Rappresentazione schematica dell'impostazione e della preparazione dell'agar pad. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Analisi dei batteri estratti dall'apoplasto ottenuti da Arabidopsis o foglie di fagiolo 4 giorni dopo l'inoculazione con P. syringae pv. pomodoro (Pto) o P. syringae pv. phaseolicola (Pph), rispettivamente. L'espressione di hrpL::gfp è monitorata come fluorescenza GFP. (A) L'analisi della citometria a flusso è rappresentata come un dot plot (forward scatter [dimensione della cella] vs. intensità di fluorescenza GFP). I batteri non GFP indicano un ceppo wild-type di Pto o Pph. La linea verticale delimita il 99% della popolazione non-GFP. (B) L'analisi della citometria a flusso è rappresentata come istogrammi (conta cellulare vs. intensità di fluorescenza GFP). L'istogramma grigio rappresenta il ceppo non-GFP. (C) I dati quantitativi sono stati generati dall'analisi della citometria a flusso. La percentuale di celle ON e OFF viene calcolata in base alla distribuzione mostrata nel dot plot. La media indica la fluorescenza media ottenuta nell'esperimento. Il coefficiente di variazione robusto (RCV) è calcolato come terzo quartile meno il primo quartile diviso per la mediana. (D) Immagini al microscopio a fluorescenza che mostrano livelli eterogenei di GFP associati all'espressione di hrpL. Le frecce bianche evidenziano i batteri che mostrano bassi livelli o nessuna fluorescenza GFP. Barra scala: 3 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.