Generazione e imaging di organoidi epiteliali di topo e umani da tessuto mammario normale e tumorale senza passaggio

Serena L. Cornelius; Megan M. Colonnetta; Katherine E. Lake; Clayton A. Smith; Yu-An Zhang; Evanthia T. Roussos-Torres; Sangeetha M. Reddy; Elizabeth H. Chen; Isaac S. Chan

doi:10.3791/64626

Articolo metodologico

Generazione e imaging di organoidi epiteliali di topo e umani da tessuto mammario normale e tumorale senza passaggio

DOI:

10.3791/64626

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11 novembre 2022

Serena L. Cornelius¹^,² , Megan M. Colonnetta²^,³^,⁴^,⁵ , Katherine E. Lake¹^,² , Clayton A. Smith¹^,² , Yu-An Zhang¹^,² , Evanthia T. Roussos-Torres⁶ , Sangeetha M. Reddy¹^,² , Elizabeth H. Chen²^,³^,⁴^,⁵ , Isaac S. Chan¹^,²^,³^,⁴

¹Department of Internal Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Texas Southwestern Medical Center, ²Harold C. Simmons Comprehensive Cancer Center, University of Texas Southwestern Medical Center, ³Department of Molecular Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, ⁴Hamon Center for Regenerative Science and Medicine, University of Texas Southwestern Medical Center, ⁵Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center, ⁶Division of Medical Oncology, Norris Comprehensive Cancer Center, Keck School of Medicine, University of Southern California

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo discute un approccio per generare organoidi epiteliali dal tessuto mammario primario normale e tumorale attraverso la centrifugazione differenziale. Inoltre, sono incluse istruzioni per la coltura tridimensionale e l'imaging immunofluorescente di organoidi incorporati.

Abstract

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Gli organoidi sono un metodo affidabile per modellare il tessuto degli organi grazie alle loro proprietà auto-organizzanti e alla conservazione della funzione e dell'architettura dopo la propagazione dal tessuto primario o dalle cellule staminali. Questo metodo di generazione di organoidi rinuncia alla differenziazione di singole cellule attraverso passaggi multipli e utilizza invece la centrifugazione differenziale per isolare organoidi epiteliali mammari da tessuti dissociati meccanicamente ed enzimaticamente. Questo protocollo fornisce una tecnica semplificata per produrre rapidamente organoidi epiteliali piccoli e grandi sia dal tessuto mammario di topo che da quello umano, oltre alle tecniche per l'incorporazione di organoidi nel collagene e nella matrice extracellulare basale. Inoltre, vengono fornite istruzioni per la fissazione in gel e la colorazione immunofluorescente allo scopo di visualizzare la morfologia e la densità degli organoidi. Queste metodologie sono adatte per una miriade di analisi a valle, come la co-coltura con cellule immunitarie e la modellazione di metastasi ex vivo tramite il saggio di invasione del collagene. Queste analisi servono a chiarire meglio il comportamento cellula-cellula e creare una comprensione più completa delle interazioni all'interno del microambiente tumorale.

Introduzione

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La capacità di modellare le cellule epiteliali in vitro è stata il fondamento della moderna ricerca biomedica perché cattura caratteristiche cellulari che non sono accessibili in vivo. Ad esempio, la crescita di linee cellulari epiteliali in un piano bidimensionale può fornire una valutazione dei cambiamenti molecolari che si verificano in una cellula epiteliale durante la proliferazione¹. Inoltre, la misurazione della regolazione dinamica tra segnalazione ed espressione genica è limitata nei sistemi in vivo ². Nella ricerca sul cancro, la modellazione della linea cellulare epiteliale del cancr....

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Protocollo

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Tutti i tessuti di topo utilizzati in questo manoscritto sono stati raccolti eticamente in conformità con i regolamenti e le linee guida dell'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Texas Southwestern Medical Center. Allo stesso modo, tutti i pazienti hanno acconsentito prima della donazione di tessuti sotto la supervisione di un Institutional Review Board (IRB) e i campioni sono stati deidentificati.

NOTA: Questo protocollo descrive la generazione di organoidi dal tessuto primario.

1. Preparazione notturna dei materiali

Per l'incorporazione nella matrice....

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Risultati

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Le immagini presenti nella Figura 1 forniscono un esempio di organoidi epiteliali mammari wild-type e tumorali provenienti da tessuti umani e murini. Un'illustrazione a colpo d'occhio del metodo per isolare gli organoidi epiteliali attraverso la centrifugazione differenziale è fornita nel flusso di lavoro del fumetto nella Figura 1A, che mostra che i tessuti primari di specie diverse possono essere trattati in modi quasi identici mentre producono tessuto epiteli.......

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Discussione

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Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per generare organoidi tumorali. Questo protocollo evidenzia un metodo per generare organoidi tumorali direttamente dal tumore senza passare. Utilizzando questo metodo, gli organoidi tumorali sono producibili entro poche ore dall'inizio della procedura e generano quasi il 100% di organoidi vitali rispetto al 70% riportato in letteratura³¹. In confronto, altri metodi richiedono il passaggio seriale delle cellule in organoidi per diverse settimane. .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato da finanziamenti forniti da METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa's Research Foundation e NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Riconosciamo l'assistenza della University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, una risorsa condivisa presso il Simmons Comprehensive Cancer Center, che è supportata in parte dal National Cancer Institute con il numero di premio P30 CA142543. Un ringraziamento speciale a tutti i membri del Chan Lab.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
10 mM di tampone HEPES	Gibco
100x antibiotico-antimicotico	Gibco	15240-096
100x Tecnologie Glutamax	Life	35050-061	Integratore di glutammina
100x Insulina-Transferrina-Selenio (ITS)	Tecnologie per la vita	51500-056
100x Penicillina/Streptomicina (Penna/Streptomicina)	Sigma	P4333
10x DMEM	Sigma	D2429
50 mL/0,2 &; micro; m pallone filtrante	Fisher	#564-0020
Amfotericina B	Life Technologies	15290-018
bFGF	Sigma	F0291
Soluzione BSA (32%)	Sigma
Tossina del colera	Sigma	C8052
CO₂-Indipendente dal fluido	Gibco	18045-088
Collagenasi A	Sigma	C2139
Desossiribonucleasi I da pancreas bovino (DNasi)	Sigma	D4263
DMEM con 4500 mg/L di glucosio, piruvato di sodio e bicarbonato di sodio, senza L-glutammina, liquido, filtrato sterile, adatto per colture cellulari	Sigma	D6546	Terreno basale comune
D-MEM/F12	Tecnologie per la vita	#10565-018
salina tamponata con fosfato di Dulbecco (D-PBS)	Sigma	#D8662	PBS
Siero fetale bovino (FBS)	Sigma
Gentamicina	Tecnologie per la vita	#15750-060
Fattore di crescita epidermico umano (EGF)	Sigma	E9644
Idrocortisone	Sigma	H0396
Insulina	Sigma
Matrigel	Corning	#354230	Matrice extracellulare basale (BECM)
NaOH (1 N)	Sigma	S2770
Collagene a coda di ratto I	Corning
RPMI-1640 media	Fisher
Tripsina	Tecnologie per la vita	Codice 27250-018

15630080#A9576 Soluzione del terreno basale.#F0926#I9278354236SH3002701

Riferimenti

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Ghandi, M., et al. Next-generation characterization of the cancer cell line encyclopedia. Nature. 569 (7757), 503-508 (2019).
Roarty, K., Echeverria, G. V. Laboratory models for investigating breast cancer therapy resistance and metastasis. Fron....

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Centrifugazione differenziale inclusione di organoidi matrice di collagene colorazione immunofluorescente microambiente tumorale saggio di invasione degli organoidi co coltura di organoidi imaging di organoidi

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