Questo protocollo descrive l'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nella parete cieca di topi immunodeficienti. Il modello ricapitola la malattia metastatica del carcinoma colorettale avanzato e consente la valutazione di nuovi farmaci terapeutici in uno scenario clinicamente rilevante di metastasi polmonari ed epatiche.
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Articolo metodologico
L'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate dal paziente nei topi ricapitola il cancro colorettale avanzato
In questo articolo
Sommario
Abstract
Nell'ultimo decennio, sono stati stabiliti modelli preclinici più sofisticati per il cancro del colon-retto (CRC) utilizzando cellule tumorali derivate da pazienti e tumori 3D. Poiché gli organoidi tumorali derivati dal paziente possono mantenere le caratteristiche del tumore originale, questi modelli preclinici affidabili consentono lo screening dei farmaci antitumorali e lo studio dei meccanismi di resistenza ai farmaci. Tuttavia, la morte correlata al CRC nei pazienti è per lo più associata alla presenza di malattia metastatica. È quindi essenziale valutare l'efficacia delle terapie antitumorali in modelli in vivo che ricapitolino realmente le caratteristiche molecolari chiave delle metastasi tumorali umane. Abbiamo stabilito un modello ortotopico basato sull'iniezione di cellule tumorali derivate da pazienti affetti da CRC direttamente nella parete cieca dei topi. Queste cellule tumorali sviluppano tumori primari nel cieco che metastatizzano al fegato e ai polmoni, che si osservano frequentemente nei pazienti con CRC avanzato. Questo modello murino di CRC può essere utilizzato per valutare le risposte ai farmaci monitorate mediante tomografia microcomputerizzata (μCT), un metodo di imaging su piccola scala clinicamente rilevante in grado di identificare facilmente tumori primari o metastasi nei pazienti. Qui, descriviamo la procedura chirurgica e la metodologia necessaria per impiantare cellule tumorali derivate dal paziente nella parete cieca di topi immunodeficienti.
Introduzione
Il cancro del colon-retto (CRC) è la seconda causa di morte per cancro in tutto il mondo1. La capacità di generare modelli tumorali in vitro o in vivo derivati da cellule tumorali di singoli pazienti ha fatto progredire la medicina di precisione in oncologia. Nell'ultimo decennio, gli organoidi derivati da pazienti (PDO) o xenotrapianti (PDX) sono stati utilizzati da molti gruppi di ricerca in tutto il mondo2. I PDO sono strutture multicellulari in vitro che assomigliano alle caratteristiche del tessuto tumorale originale e possono auto-organizzarsi e auto-rinnovarsi3. Questi promettenti modelli in vitro possono essere utilizzati con successo per lo screening dei farmaci e per facilitare la ricerca traslazionale. D'altra parte, i modelli PDX ricapitolano fedelmente il CRC originale a tutti i livelli rilevanti, dall'istologia ai tratti molecolari e alla risposta ai farmaci 2,4.
In vivo I modelli PDX sono per lo più coltivati come tumori sottocutanei in topi immunodeficienti. Utilizzando questo approccio, i PDX sono diventati il gold standard nella ricerca sul cancro, in particolare per lo studio della sensibilità o della resistenza ai farmaci. Tuttavia, i decessi correlati al CRC sono per lo più associati alla presenza di lesioni metastatiche nel fegato, nel polmone o nella cavità peritoneale e nessuno dei due approcci (PDO o PDX) può ricapitolare il setting clinico avanzato. Inoltre, è stato dimostrato che il sito specifico di crescita del tumore determina importanti caratteristiche biologiche che hanno un impatto sull'efficacia dei farmaci e sulla prognosi della malattia2. Pertanto, vi è un urgente bisogno di stabilire modelli preclinici che possano essere utilizzati per valutare l'efficacia dei farmaci antitumorali in un contesto metastatico clinicamente rilevante6.
Gli scanner per tomografia microcomputerizzata (μCT) possono funzionare come scanner TC clinici in scala ridotta, fornendo imaging di tumori primari e metastasi nei topi con una risoluzione dell'immagine in scala proporzionale a quella delle immagini TC dei pazienti oncologici7. Per contrastare lo scarso contrasto dei tessuti molli della tecnica μCT, è possibile utilizzare mezzi di contrasto iodati radiologici per migliorare il contrasto e valutare il carico tumorale. Utilizzando un approccio a doppio contrasto, lo iodio orale e intraperitoneale viene somministrato in tempi diversi. Il mezzo di contrasto somministrato per via orale aiuta a definire i limiti tra il tessuto tumorale e il contenuto del cieco all'interno dell'intestino. D'altra parte, il mezzo di contrasto somministrato per via intraperitoneale permette di individuare i limiti esterni della massa tumorale, che frequentemente cresce e invade il peritoneo8.
Il manoscritto descrive un protocollo per eseguire l'impianto ortotopico di cellule tumorali derivate da pazienti nella parete cieca di topi immunodeficienti e la metodologia per monitorare la crescita del tumore intestinale utilizzando la scansione μCT. Il presente manoscritto mostra che il modello ricapitola lo scenario clinico dei tumori intestinali avanzati e della malattia metastatica nei pazienti affetti da CRC che non possono essere studiati utilizzando modelli PDO o PDXO. Poiché i modelli ortotopici PDX di CRC ricapitolano lo scenario clinico dei pazienti con CRC, concludiamo che sono i migliori ad oggi per testare l'efficacia dei farmaci antitumorali nei tumori intestinali avanzati e nella malattia metastatica.
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Protocollo
Il consenso informato scritto è stato ottenuto da tutti i pazienti. Il progetto è stato approvato dal Comitato Etico di Ricerca dell'Ospedale Universitario Vall d'Hebron, Barcellona, Spagna (ID approvazione: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). I campioni di tessuto del colon umano consistevano in biopsie da aree non necrotiche di adenocarcinomi primari o metastasi epatiche, corrispondenti a pazienti con cancro del colon e del retto sottoposti a resezione del tumore. Gli esperimenti sono stati condotti seguendo la direttiva dell'Unione Europea sulla cura degli animali (86/609/CEE) e sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del VHIR-Istituto di Ricerca Vall d'Hebron (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA e 12/18 CEEA).
NOTA: Femmina NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) topi di 8 settimane di età sono stati acquistati da Charles River Laboratories.
1. Derivazione delle cellule del paziente
- Estrazione del tumore
NOTA: La seguente procedura viene eseguita in una cabina biologica a temperatura ambiente (RT) nella struttura per animali.- Ottenere campioni tumorali dagli interventi chirurgici o dalle biopsie dei pazienti e dai PDX che crescono per via sottocutanea nei topi.
- Per l'iniezione ortotopica, preparare le cellule tumorali da modelli tumorali PDX sottocutanei consolidati invece di tessuto ottenuto direttamente dai pazienti9.
- Generare tumori PDX inoculando una sospensione di 1 x 105 cellule tumorali in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (50 μL) miscelata con matrice Matrigel (50 μL) per via sottocutanea nel fianco di topi NOD-SCID2.
- Misurare la crescita del tumore utilizzando un calibro a giorni alterni.
NOTA: È importante sottolineare che il nostro laboratorio ha generato una biobanca di oltre 350 modelli PDX. I modelli tumorali CRC-PDX utilizzati nel protocollo sono modelli PDX consolidati in laboratorio che sono stati amplificati più di tre passaggi nei topi e hanno superato i criteri di inclusione/esclusione con un risultato positivo (Tabella 1).
- Misurare la crescita del tumore utilizzando un calibro a giorni alterni.
- Sopprimere i topi mediante lussazione cervicale quando i tumori sottocutanei raggiungono la dimensione massima stabilita dal CEEA (1 cm di diametro), o quando gli animali raggiungono i criteri di endpoint.
- Estrarre il tumore e rimuoverlo con cura dalla pelle e dal tessuto non tumorale circostante utilizzando forbici e pinze.
- Conservare i tumori prelevati in PBS a 4 °C fino alla fase successiva.
NOTA: Dissociare i tumori in sospensione cellulare il prima possibile dopo la rimozione dalla loro posizione originale nelle lesioni dei pazienti o negli xenotrapianti sottocutanei nei topi. La vitalità cellulare è significativamente ridotta 24 ore dopo la rimozione del tessuto, con conseguente impianto inefficiente nei topi riceventi.
- Preparazione delle cellule
NOTA: La seguente procedura viene eseguita in un armadio biologico a temperatura ambiente (RT) nella sala di coltura dei tessuti.- Dissociare i tumori utilizzando una lama in una piastra di coltura di 10 cm con 1 mL di terreno CoCSCM 6Ab completo (Tabella 2) (per facilitare la macinazione). Collocare il campione omogeneo dissociato in una provetta conica da 15 mL.
- Aggiungere il terreno CoCSCM 6Ab completo a un volume finale di 5 mL (utilizzare non più di 3 mL di campione dissociato nella stessa provetta).
NOTA: Il CRC primario resecato dai pazienti è naturalmente contaminato da batteri e funghi. È essenziale rimuovere gli agenti patogeni presenti nel campione originale del paziente utilizzando un cocktail di sei antibiotici (penicillina, streptomicina, fungizone, kanamicina, gentamicina e nistatina). L'iniezione di cellule tumorali contaminate da batteri in topi immunodeficienti può provocare la morte degli animali. - Incubare con 50 μL di DNasi I (0,08 kU/mL) e 50 μL di collagenasi (1,5 mg/mL) (mezzo di digestione; Tabella 2) per 1 ora a 37 °C in un incubatore per colture cellulari, in posizione 45°. Mescolare bene la soluzione ogni 15 minuti con una pipetta da 5 mL prima dell'incubazione.
NOTA: Dissociare il tessuto tumorale e digerirlo pipettando più volte per ottenere una soluzione unicellulare. Questo è essenziale per contare le cellule prima dell'iniezione nei topi riceventi e quindi ottenere un impianto omogeneo di cellule tumorali. - Aggiungere 5 mL di terreno CoCSCM 6Ab completo e mescolare bene con una pipetta da 5 mL.
- Ordinare la soluzione con un colino cellulare da 100 μm utilizzando una nuova provetta sterile da 50 mL.
- Centrifugare le cellule ordinate a 500 x g per 8 minuti a RT.
- Aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 3 mL di 1x soluzione tampone di lisi per globuli rossi.
- Incubare per 10 minuti a RT.
- Aggiungere 3 mL di terreno CoCSCM 6Ab completo, pipettare il campione e centrifugare a 500 x g per 10 minuti a RT. Aspirare il surnatante.
- Risospendere il pellet con 5-10 mL di terreno CoCSCM 6Ab completo e utilizzare un contatore di cellule per calcolare il numero totale di cellule.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 10 minuti a RT e risospendere in 10 mL di PBS.
- Risospendere il pellet per ottenere una concentrazione di 20 x 106 cellule/mL e mescolare bene per ottenere una sospensione cellulare omogenea.
- Preparare siringhe da 29 G (ago U 100 da 0,5 mL, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) per l'iniezione nel cieco nella coltura tissutale (una siringa/topo). Caricare 50 μL della sospensione di cellule tumorali (1 x 106 cellule/iniezione) nella siringa e tenerla in ghiaccio. Assicurarsi che le bolle d'aria vengano rimosse dalla sospensione cellulare.
NOTA: L'eliminazione delle bolle d'aria quando le cellule tumorali sono caricate nella siringa è essenziale per evitare l'iniezione di un volume eccessivo nella parete del cieco, che potrebbe causare la rottura del tessuto e la perdita del campione. È imperativo mescolare bene la sospensione cellulare quando si carica la siringa per evitare dimensioni irregolari del tumore tra i topi nello stesso esperimento.
2. Iniezione ortotopica nel cieco
NOTA: La seguente procedura viene eseguita su un banco in una stanza priva di agenti patogeni specifici (SPF) presso la struttura per animali. L'attrezzatura utilizzata viene preventivamente pulita e sterilizzata. Inoltre, viene nuovamente sterilizzato in uno sterilizzatore portatile tra individui o zone della struttura per animali.
- Pulire il sito chirurgico spruzzando con detergente disinfettante e strofinando.
- Depilare l'addome dei topi usando una macchina per la depilazione del topo.
- Posizionare il mouse in posizione supina. Utilizzare isoflurano al 2% per anestetizzare l'animale. Confermare l'effetto dell'anestesia pizzicando delicatamente l'estremità e osservando l'assenza di stimolazione.
- Applicare una goccia da 50-100 μL di unguento veterinario (3 mg/g Lacryvisc) negli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
- Disinfettare l'addome del topo strofinando più volte con clorexidina o iodio povidone con movimenti circolari.
- Praticare un'incisione longitudinale di 1 cm sul basso ventre utilizzando le forbici chirurgiche. Separare con cura la pelle in ogni sito per presentare il peritoneo che si trova sotto la pelle.
- Praticare un'incisione di 0,5-1 cm nella membrana peritoneo, abbastanza grande da esternare l'intestino cieco.
NOTA: Esteriorizzare il cieco senza manipolare eccessivamente gli organi interni, il che potrebbe aumentare notevolmente la letalità della procedura. - Isolare accuratamente il cieco dal topo utilizzando una garza sterile pretagliata.
- Inumidire il cieco con soluzione salina durante l'intera procedura.
- Immobilizzare il cieco afferrandolo con cautela con una pinza e introdurre l'ago superficialmente nella parete del cieco. Evitare i capillari e i vasi sanguigni nel sito di iniezione. Rimuovere le bolle dalla sospensione cellulare.
- Iniettare lentamente tutti i 50 μL di sospensione delle cellule tumorali. Di solito ci vogliono circa 10 secondi per la somministrazione. Evitare di perforare il lume cieco con l'ago, poiché ciò comporta l'eliminazione della sospensione delle cellule tumorali dal corpo attraverso la peristalsi intestinale.
NOTA: L'iniezione della sospensione di cellule tumorali nel cieco dei topi è la fase più impegnativa dell'intera procedura. In questa parte del protocollo devono essere utilizzate una luce intensa focalizzata sul sito di iniezione e una lente d'ingrandimento. Introdurre l'ago parallelamente alla superficie del cieco. Il cieco è un tessuto molto fragile; Pertanto, l'immobilizzazione del cieco deve essere eseguita utilizzando una pinza chirurgica e applicando una leggera pressione per evitare la rottura del tessuto con conseguente emorragia. Il successo dell'impianto si traduce in una bolla bianca (pellet di cellule) nella parete del cieco. Se la bolla non può essere visualizzata, può indicare che il cieco è stato perforato e le cellule sono terminate nel lume del cieco, con conseguente eliminazione da parte del tratto intestinale. - Dopo l'iniezione, rimuovere lentamente l'ago dal cieco e applicare una leggera pressione sul sito di iniezione con un applicatore con punta di cotone, per evitare la fuoriuscita delle cellule tumorali e ridurre un leggero sanguinamento.
- Pulisci il cieco con soluzione salina per rimuovere eventuali detriti.
- Riportare il cieco nell'addome dell'animale.
- Chiudere il peritoneo con punti di sutura 5/0.
- Chiudere la pelle dell'addome con punti di sutura 5/0.
- Somministrare antibiotici post-operatori (100 mg/kg di amoxicillina o 20 mg/kg di enrofloxacina) e analgesici (5 mg/mL di metacam/meloxicam) mediante iniezione sottocutanea. Posiziona i mouse su un termoforo e tienili lì fino a quando non si sono completamente ripresi. Quindi, riportali nella gabbia con altri animali.
3. Valutazione della crescita del tumore ortotopico mediante scansione μCT
NOTA: La seguente procedura viene eseguita nella piattaforma di imaging preclinico (PIP) della struttura per animali.
- Eseguire tutte le procedure sugli animali seguendo i regolamenti del comitato etico istituzionale.
- Iniziare a monitorare il volume del tumore con μCT 2 settimane dopo l'iniezione cellulare e successivamente ogni settimana.
- Diluire il mezzo di contrasto iopamiro (300 mg/mL) in soluzione salina, in un rapporto di 3:1 per entrambe le dosi. Somministrare 300 mL di iopamiro per via orale.
NOTA: A causa dello scarso contrasto dei tessuti molli della μCT, si consiglia l'uso di un mezzo di contrasto per migliorare la sensibilità della tecnica. Il protocollo prevede una somministrazione orale di un agente a base di iodio (iopamiro) per delimitare il carico tumorale intraluminale e una somministrazione intraperitoneale secondaria dello stesso agente per definire il carico tumorale nella faccia viscerale dell'intestino. In precedenza sono stati eseguiti esperimenti pilota per determinare il tempo esatto necessario al mezzo di contrasto per arrivare al cieco dei topi prima della sua eliminazione. Nel caso dello iopamiro, è di circa 2 ore. - Dopo 2 ore, somministrare un'iniezione intraperitoneale di 300 mL di iopamiro precedentemente diluito. La somministrazione aiuta a definire i limiti tumorali nella faccia parietale.
- Anestetizzare gli animali con isoflurano al 2%.
- Dopo aver verificato che l'animale sia correttamente anestetizzato pizzicando la zampa del topo, posizionare l'animale nel letto di scansione della μCT. La posizione migliore è supina (a faccia in su).
- Nel software di controllo, avviare la modalità live (modalità fluoroscopia) per posizionare l'area addominale nel campo visivo (FOV) dello scanner. Per fare ciò, spostare il letto in avanti e indietro e lateralmente fino a raggiungere la posizione desiderata. Ruotare il tubo a raggi X e il rilevatore di 90° e spostare il letto di scansione sull'asse y per centrare completamente l'animale.
- Utilizzare i seguenti parametri per le immagini di scansione μCT: FOV di 30 mm, tempo di acquisizione di 26 s, tensione di corrente di 90 kV e amperaggio di corrente di 200 μA, utilizzando un sistema di imaging FX μCT.
- Riportare gli animali nelle loro gabbie per il recupero al termine della scansione. Fornire supporto termico e monitorare gli animali fino a quando non si riprendono dall'anestesia prima di tornare all'alloggio.
- L'acquisizione μCT produce un file di 250 Mb per ogni scansione. I file di dati creati hanno un formato VOX. Per renderli accessibili a qualsiasi software di analisi delle immagini, convertire i file in formato DICOM utilizzando il software di gestione del database del μCT. Memorizzare il batch di file creati in un disco rigido portatile per analizzarli utilizzando qualsiasi computer con software di imaging disponibile.
NOTA: Durante l'analisi delle immagini, il cieco è localizzato come un intestino dilatato con un contenuto radiodenso (iopamiro), spesso nella parte sinistra dell'addome caudale. Nella flessura viscerale dell'intestino cieco si osserva un ispessimento della parete, rispetto alle regioni intestinali adiacenti. L'ispessimento corrisponde alla crescita del tumore. - Una volta localizzato il tumore, trova il diametro più alto nelle diverse viste (assiale, coronale e sagittale). Misurare questi tre assi e calcolare il volume del tumore seguendo la formula dell'ellissoide: volume = 4/3π x (semiasse x semiasse x semiasse x semiasse z)10.
4. Intervento terapeutico nei topi portatori di tumori ortotopici
- Monitorare settimanalmente i topi portatori di tumori ortotopici.
- Quando viene rilevato un segnale di scansione μCT tumorale nella maggior parte dei topi, eseguire un'altra scansione μCT la settimana successiva per confermare la presenza del tumore.
NOTA: Il tempo per iniziare il trattamento dipende dal modello PDX utilizzato e varia da 3 a 12 settimane dopo l'inoculazione delle cellule tumorali nell'intestino cieco. - Randomizzare i topi in quattro gruppi: un gruppo veicolo (n = 10-15 topi), un gruppo di test farmacologico (n = 10-15 topi), un gruppo di chemioterapia standard (n = 10-15 topi) e un gruppo di trattamento combinato (n = 10-15 topi).
- Trattare i topi per via intraperitoneale con soluzione fisiologica (gruppo veicolo), il farmaco in esame (20 mg/kg) (gruppo in esame), irinotecan (50 mg/kg) (gruppo standard di cura) o il farmaco in esame (20 mg/kg) con irinotecan (50 mg/kg) (gruppo di trattamento combinato). Eseguire la somministrazione una volta alla settimana fino alla fine dell'esperimento.
- Monitorare settimanalmente la crescita del tumore mediante scansione μCT durante tutto il corso dell'esperimento.
- Alla fine dell'esperimento, sopprimere i topi mediante lussazione cervicale e raccogliere fegati, polmoni e qualsiasi altra possibile lesione in altri organi.
- Includere i campioni di tessuto in cassette e incubarli in formalina al 4% per una notte. Utilizzare il tessuto intestinale di un topo senza tumore nel cieco come controllo.
- Rimuovere le cassette dalla formalina e incubare con etanolo al 70% per almeno 3 ore.
- Incorporare le cassette con paraffina, utilizzando i protocolli standard della struttura di istopatologia.
- Eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) dal cieco, dal fegato e dal polmone, utilizzando i protocolli standard della struttura istopatologica.
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Risultati
I topi impiantati ortotopicamente con cellule tumorali derivate dal paziente sono stati monitorati settimanalmente mediante scansione μCT. Alla fine dell'esperimento, gli animali sono stati soppressi. L'intestino, la ceca (Figura 1A,B), il fegato, i polmoni e qualsiasi altra possibile lesione sono stati raccolti, inclusi in una cassetta e fissati con formalina al 4% durante la notte. Il tessuto intestinale di un topo senza tumore nel cieco è stato utilizzato come controllo (...
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Discussione
Negli ultimi decenni, molte nuove terapie antitumorali sono state sviluppate e testate in pazienti con diversi tipi di tumore, incluso il cancro del colon-retto (CRC). Sebbene in molti casi siano stati osservati risultati promettenti nei modelli preclinici, l'efficacia terapeutica nei pazienti con CRC metastatico avanzato è stata spesso limitata. Pertanto, vi è un urgente bisogno di modelli preclinici che consentano di testare l'efficacia di nuovi farmaci terapeutici in uno scenario metastatico clinicamente rilevante.
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Ringraziamenti
Ringraziamo la Fondazione Cellex, la rete CIBERONC e l'Instituto de Salud Carlos III per il loro sostegno. Inoltre, ringraziamo anche la piattaforma di imaging preclinico presso l'Istituto di Ricerca Vall d'Hebron (VHIR), dove sono stati eseguiti gli esperimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| REAGENTE | |||
| Apo-transferrina | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Integratore | Life Technologies SA (Spagna) | 17504044 | |
| Soluzione acquosa di clorexidina 2% | DH MATERIALE MÉ DICO, S.L. | ||
| Collagenasi | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucosio | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 & micro; g | |
| FGF di base | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spagna) | 15290026 | |
| Gentamicina | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | ||
| Eparina Sale Sodico | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulina | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| isoflurano | - | - | |
| Kanamicina | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | ||
| L-Glutammina | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | ||
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Aminoacidi non essenziali | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | ||
| Nistatina | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spagna) | 15140122 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| Tampone di lisi RBC | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Piruvato di sodio | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | ||
| selenito di sodio | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| FORNITURE ESSENZIALI | |||
| settimane NOD. Topi CB17-Prkdcscid/NcrCrl | - | - | |
| BD Micro-Fine 0,5 ml U 100 ago 0,33 mm (29G) x 12,7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | ||
| Blade #24 | - | - | |
| Filtro cellulare 100 &-micro; m | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Pinze e forbici chirurgiche | - | - | |
| Cuscinetto riscaldante | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, gel oftalmico | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON& JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µ Sistema di imaging per TC | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
