Uno dei principali fattori che determinano i fenotipi cellulari negli eucarioti è l'espressione genica. Il controllo dell'espressione genica è essenziale e si basa su più proteine e RNA, dalla trascrizione ai processi di traduzione1. Le alterazioni lungo questi passaggi possono scatenare diverse malattie. Il processamento e lo splicing dell'RNA costituiscono un importante gruppo di reazioni responsabili della generazione di molecole di RNA mature 2,3,4,5. Lo splicing rimuove gli introni e unisce gli esoni per generare una molecola di RNA matura in grado di svolgere attività funzionali e strutturali. L'efficienza e i tassi di splicing hanno un grande impatto sui fenotipi osservati in diverse condizioni6.
Lo splicing viene eseguito da un complesso macchinario macromolecolare chiamato spliceosoma, che è composto da cinque snRNA e più di 100 proteine 5,7. Oltre ai componenti proteici principali, gli spliceosomi hanno proteine trans-agenti, che potrebbero influenzare direttamente la regolazione di questo processo 8,9. L'importanza dello splicing si riflette nell'ampio spettro di malattie causate da alterazioni di questo processo, tra cui disturbi neurodegenerativi, malattie neuromuscolari e diversi tipi di cancro 3,10,11. Lo studio della dinamica dello splicing e dell'assemblaggio dello spliceosoma può avere un grande impatto sulla comprensione della biologia di questi disturbi.
L'assemblaggio dello spliceosoma inizia con l'associazione dello snRNP U1 con una regione specifica del pre-mRNA recentemente trascritto, il sito di splicing 5' 5,8. L'accoppiamento efficiente e il riconoscimento dei siti di splicing 5' da parte dell'snRNA U1 non solo definiscono i siti di splicing che dovrebbero essere utilizzati, ma controllano anche quali pre-RNA verranno sottoposti a splicing per primi o in modo più efficiente 6,12,13. L'uso di diversi siti di splicing può generare più isoforme alternative di RNA maturi dallo stesso gene. Lo splicing alternativo è una delle principali fonti di diversità proteomica, consentendo la generazione degli RNA e delle proteine necessarie durante lo sviluppo o in diverse cellule e tessuti 14,15. I trascritti alternativi dell'RNA possono generare isoforme proteiche troncate o non funzionali, che potrebbero causare malattie10,16. Pertanto, i componenti proteici del complesso U1 snRNP hanno un importante ruolo regolatorio nello splicing1. La galectina-1 e la galectina-3 (Gal1 e Gal3) sono componenti dell'U1 snRNP17,18. Voss et al.19 propongono un metodo di frazionamento dell'estratto nucleare per ottenere complessi arricchiti con snRNP Gal3-U1 in grado di salvare l'attività di splicing in cellule impoverite di U1. Questa analisi contribuisce a comprendere il meccanismo di associazione di Gal3 agli spliceosomi, e approcci simili possono essere utilizzati per esplorare altre potenziali proteine regolatrici dello splicing.
Il legame di U1 snRNP ai siti di splicing 5' è un importante mediatore della fedeltà di splicing20. Le mutazioni nei siti di splicing 5' sono critiche e causano la perdita dell'appaiamento U1 snRNP, con conseguenti difetti di splicing2. La fibrosi cistica, ad esempio, è causata da un sito di splicing 5' mutato nel geneCFTR 21. Wong et al.22 descrivono un metodo per compensare le mutazioni del sito di splicing 5' con mutazioni complementari negli snRNA U1. L'approccio promuove con successo l'inclusione dell'esone, generando RNA maturi e provocando il salvataggio da difetti di splicing. Oltre ad offrire una possibile terapia basata sull'RNA per queste malattie, questo approccio può essere utile per l'analisi di singole sequenze regolatorie nei pre-mRNA23.
La fedeltà dell'associazione dell'snRNA U1 ai siti di splicing è stata esplorata anche nel sistema modello di lievito di van der Feltz24. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato ampiamente utilizzato per esplorare la cinetica di splicing e l'assemblaggio dello spliceosoma25. La cinetica di splicing e la composizione dello spliceosoma sono ben conservate negli eucarioti e il lievito è stato ampiamente utilizzato per monitorare la formazione di complessi intermedi durante l'assemblaggio26. Il test reporter ACT1-CUP1 si basa sull'espressione di una coppia di geni: ACT1, che contiene un introne con sequenze ottimali del sito di splicing, e CUP1, che esprime un chelante del rame, proteggendo la cellula dai danni causati da questo ione metallico. CUP1 viene espresso solo se ACT1 è giuntato correttamente, creando quindi il sistema reporter27. La crescita cellulare in condizioni con diverse concentrazioni di rame può essere monitorata per valutare l'efficienza di splicing di diverse sequenze di introni o utilizzando diverse proteine regolatrici. van der Feltz24 presenta un metodo per analizzare gli effetti di una proteina regolatrice di splicing utilizzando questo sistema reporter e saggi di vitalità del rame. Un approccio simile può essere utilizzato per progettare variazioni nelle sequenze di introni in combinazione con diverse proteine per affrontare il successo dello splicing nei lieviti.
Oltre all'associazione snRNP, il legame delle proteine è essenziale durante l'assemblaggio dello spliceosoma1. Il controllo dell'attività dello spliceosoma dipende direttamente dalla sua composizione proteica e dalle interazioni che si verificano durante la sua formazione. Le caratteristiche strutturali e funzionali dei componenti proteici sono importanti per attivare il complesso 5,7. Carvalho et al.28 utilizzano un approccio basato sul metodo Grafix, che si basa sulla reticolazione non reversibile delle proteine nell'analisi del gradiente di glicerolo. Questa analisi riguarda la composizione delle proteine e le interazioni transitorie che si verificano durante l'assemblaggio, che possono essere critiche per l'assemblaggio del complesso attivo e il successo dello splicing. L'analisi di altri complessi macromolecolari dinamici con questo approccio può essere molto utile e fornire informazioni sull'organizzazione e le interazioni delle proteine.
La chimica e la velocità di splicing sono influenzate anche dall'associazione dinamica dei diversi componenti dello spliceosoma8. Recentemente, l'uso di inibitori dello splicing a piccole molecole ha rivelato che passaggi specifici possono essere bloccati in vitro a causa della ridotta velocità delle reazioni di splicing29,30. Basei et al.31 presentano un metodo per analizzare lo splicing alternativo sull'influenza del fattore regolatore dello splicing, Nek4. Viene affrontata la prevalenza di isoforme di trascrizione che portano a fenotipi pro o antitumorali nelle cellule HEK293 utilizzando un minigene. L'errata regolazione dello splicing o l'uso diverso dei siti di splicing possono portare a una generazione alternativa di trascritti, causando diversi tipi di cancro16. L'uso di modulatori o inibitori dello splicing durante la terapia può determinare le scelte del sito di splicing, definendo quindi le isoforme alternative generate, sia pro - che anti-tumorali. Paclitaxel e cisplatino sono attualmente utilizzati come agenti chemioterapici. Con l'uso del minigene E1A, vengono affrontati gli effetti di questi farmaci nello splicing alternativo. L'analisi dello splicing alternativo utilizzando minigeni è una strategia importante per monitorare gli effetti delle proteine transagenti e dei cambiamenti di splicing sulla terapia e sull'uso di farmaci specifici.
In questa linea, è stato riportato che molti microRNA intronici (miRNA) sono associati a fenotipi tumorali32,33. Il controllo e la regolazione della sintesi e della biogenesi dei miRNA intronici possono essere associati al controllo delle reazioni di splicing. I miRNA possono modulare la stabilità e la prevalenza degli mRNA nelle cellule, influenzando la stabilità dell'RNA e il tasso di traduzione34 . Gatti da Silva e Coltri35 descrivono un sistema reporter per valutare la biogenesi e la maturazione dei miRNA intronici, che può essere direttamente collegato ad alterazioni nei fenotipi cellulari e alla determinazione di caratteristiche pro o anti-tumorali. Con la modulazione della proteina regolatrice dello splicing HuR, il sistema consente l'analisi della biogenesi e dell'attività funzionale di un miRNA oncogenico intronico.
L'analisi del pre-splicing dell'RNA e la maturazione di diversi RNA in cellule specifiche sarà essenziale per comprendere e interpretare l'informazione genomica. Gli spliceosomi di lieviti e mammiferi sono conservati e la ricerca di base può migliorare l'uso dei diversi metodi applicati alla terapia e alla biomedicina. Nonostante la grande quantità di dati genomici attualmente disponibili, l'espressione di queste informazioni nei fenotipi potrebbe essere cellulo-specifica e dipendente dal processamento e dallo splicing dell'RNA. Comprendere la complessa regolamentazione di questo processo sarà essenziale per la ricerca futura.