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Articolo metodologico

Ricostituzione della citoarchitettura e della funzione dei tessuti epiteliali umani su un chip d'organo open-top

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DOI:

10.3791/64633

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17 febbraio 2023

 ,  ,  , 
1Merk Sharp & Dohme LLC, 2Department of Biomedical Engineering, University of Cincinnati, 3Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

In questo articolo

Sommario

Il presente protocollo descrive le capacità e le modalità di coltura essenziali dell'Open-Top Organ-Chip per il successo della creazione e della maturazione di colture organo-on-chip a tutto spessore di tessuti primari (pelle, alveolo, vie aeree e intestino), fornendo l'opportunità di indagare diversi aspetti funzionali dell'interfaccia di nicchia epiteliale/mesenchimale e vascolare umana in vitro.

Abstract

Quasi tutti gli organi umani sono rivestiti con tessuti epiteliali, comprendenti uno o più strati di cellule strettamente collegate organizzate in strutture tridimensionali (3D). Una delle funzioni principali degli epiteli è la formazione di barriere che proteggono i tessuti sottostanti da insulti fisici e chimici e agenti infettivi. Inoltre, gli epiteli mediano il trasporto di nutrienti, ormoni e altre molecole di segnalazione, spesso creando gradienti biochimici che guidano il posizionamento cellulare e la compartimentazione all'interno dell'organo. A causa del loro ruolo centrale nel determinare la struttura e la funzione degli organi, gli epiteli sono importanti bersagli terapeutici per molte malattie umane che non sono sempre catturate dai modelli animali. Oltre alle ovvie differenze tra specie, condurre studi di ricerca sulla funzione barriera e sulle proprietà di trasporto degli epiteli negli animali è ulteriormente aggravato dalla difficoltà di accedere a questi tessuti in un sistema vivente. Mentre le colture cellulari umane bidimensionali (2D) sono utili per rispondere a domande scientifiche di base, spesso producono scarse previsioni in vivo . Per superare questi limiti, nell'ultimo decennio, una pletora di piattaforme biomimetiche microingegnerizzate, note come organs-on-a-chip, sono emerse come una promettente alternativa ai tradizionali test in vitro e sugli animali. Qui, descriviamo un Open-Top Organ-Chip (o Open-Top Chip), una piattaforma progettata per modellare tessuti epiteliali specifici dell'organo, tra cui pelle, polmoni e intestino. Questo chip offre nuove opportunità per ricostituire l'architettura multicellulare e la funzione dei tessuti epiteliali, compresa la capacità di ricreare una componente stromale 3D incorporando fibroblasti tessuto-specifici e cellule endoteliali all'interno di un sistema meccanicamente attivo. Questo Open-Top Chip fornisce uno strumento senza precedenti per studiare le interazioni epiteliali/mesenchimali e vascolari a più scale di risoluzione, dalle singole cellule ai costrutti tissutali multistrato, consentendo così la dissezione molecolare della diafonia intercellulare degli organi epitelializzati in salute e malattia.

Introduzione

Storicamente, gli scienziati hanno fatto affidamento sulla sperimentazione animale preclinica per la scoperta di farmaci, ma un numero crescente di questi metodi è stato messo in discussione a causa della scarsa correlazione con il risultato umano1. L'attuazione dei principi delle "3R" per sostituire, ridurre e perfezionare la sperimentazione animale esorta gli scienziati a trovare nuovi metodi alternativi in vitro per supportare la valutazione preclinica del rischio tossicologico e chimicologico2. Tuttavia, molti modelli in vitro sviluppati fino ad oggi mancano dell'architettura biologica, della complessità cellulare e dell'ambiente meccanico necessari per ricapitolare la natura dinamica degli organi viventi umani 3,4.

I sistemi preclinici convenzionali in vitro impiegano tipicamente monocolture 2D di cellule umane coltivate su una superficie plastica rigida. Questi metodi forniscono uno strumento per condurre semplici studi meccanicistici e consentono un rapido screening dei farmaci candidati. A causa del loro costo relativamente basso e dell'elevata robustezza, i modelli 2D sono spesso abbinati a sistemi automatici ad alta produttività e utilizzati per la rapida identificazione di potenziali candidati farmaci durante la fase iniziale del processo di sviluppo del farmaco 5,6. Tuttavia, tali modelli 2D non forniscono un approccio traslazionale per la modellazione delle risposte a livello tissutale, a livello di organo o sistemiche ai candidati terapeutici, che è necessario per previsioni accurate della sicurezza e dell'efficacia dei farmaci durante la fase preclinica del loro sviluppo. Le colture cellulari piatte non ricapitolano il microambiente tissutale nativo, compresa la complessa interazione multicellulare, le proprietà biomeccaniche e l'architettura tridimensionale (3D) dei tessuti umani7. Le cellule che crescono su una superficie piana spesso non acquisiscono un fenotipo maturo e, quindi, non possono rispondere agli stimoli farmacologici come farebbero nel tessuto nativo. Ad esempio, le cellule epiteliali alveolari umane primarie coltivate in vitro mostrano un fenotipo squamoso e perdono marcatori fenotipici chiave, comprese le proteine tensioattive C e B (SP-C e SP-B)8. Oltre all'insufficiente differenziazione, le cellule primarie diventano spesso insensibili ai fattori di stress biologici in vitro, poiché alcuni percorsi biochimici associati all'infiammazione dei tessuti diventano non funzionali9. Tale perdita della funzione cellulare sembra essere principalmente associata all'uso di substrati rigidi e alla mancanza di fattori solubili rilasciati naturalmente dalle cellule stromali tessuto-specifiche come i fibroblasti polmonari e le cellule muscolari lisce10,11.

Comprendere che la mancanza di complessità chemio-fisica e biologica limita il comportamento fisiologico delle cellule in vitro ha favorito lo sviluppo di modelli multicellulari più sofisticati, che hanno dimostrato di catturare meglio la complessità dei tessuti umani al di fuori del corpo12,13. Dalla creazione dei primi modelli di co-coltura nei primi anni 197014, l'introduzione di idrogel sintetici e naturali ha migliorato significativamente la capacità di imitare i microambienti tissutali nativi ed è diventato uno strumento inestimabile per guidare la differenziazione cellulare, guidare l'auto-organizzazione delle cellule in strutture simili ai tessuti e il ripristino delle funzioni tissutali native15,16. Ad esempio, se coltivate nell'appropriata impalcatura 3D, le cellule umane possono auto-organizzarsi in strutture funzionali come sferoidi o organoidi, esprimendo marcatori di cellule staminali, e sono in grado di auto-rinnovarsi17. Al contrario, le cellule umane (comprese le cellule staminali), se coltivate su substrati 2D tradizionali, invecchiano rapidamente e subiscono la senescenza dopo pochi passaggi18. Inoltre, gli idrogel possono essere "personalizzati" per adattarsi a specifiche proprietà del tessuto come porosità, dimensione dei pori, spessore delle fibre, viscoelasticità, topografia e rigidità o ulteriormente ingegnerizzati con componenti cellulari derivati dai tessuti e / o molecole bioattive che consentono l'emulazione delle condizioni fisiologiche o patologiche19,20. Nonostante il loro enorme potenziale per i test farmacologici, i modelli 3D basati sull'idrogel utilizzati nella ricerca farmaceutica non riassumono completamente la complessa citoarchitettura dei tessuti in vivo e mancano di importanti stimoli emodinamici e meccanici normalmente presenti nel corpo umano, tra cui pressione idrostatica, allungamento ciclico e taglio dei fluidi21.

I sistemi microfisiologici (MPS) come gli Organs-on-chip (OOC) sono recentemente emersi come strumenti in grado di catturare risposte fisiologiche complesse in vitro22,23. Questi modelli utilizzano spesso l'uso di piattaforme microfluidiche, che consentono la modellazione del microambiente dinamico degli organi viventi.

Abbiamo combinato i principi della bioingegneria tissutale 3D e della meccanobiologia per creare un modello Open-Top Chip di tessuto epiteliale umano complesso. Questo ci ha permesso di ricapitolare da vicino il microambiente multicellulare e dinamico dei tessuti epiteliali. Ciò include segnali biochimici e biomeccanici specifici del tessuto naturalmente presenti negli organi viventi, ma spesso trascurati dai tradizionali modelli in vitro 24. L'Open-Top Chip incorpora due compartimenti: un compartimento vascolare (Figura 1A) e un compartimento stromale (Figura 1B) separati da una membrana porosa, consentendo la diffusione dei nutrienti tra le due camere (Figura 1C). Il compartimento vascolare è esposto a flusso continuo di fluido per ricapitolare lo stress fisiologico di taglio, mentre il design estensibile della camera stromale consente di modellare la tensione meccanica associata ai movimenti respiratori o alla peristalsi intestinale. Il compartimento stromale ospita l'impalcatura idrogel 3D sintonizzabile progettata per supportare la crescita fisiologica dei fibroblasti tessuto-specifici. Possiede un coperchio rimovibile che facilita l'istituzione di un'interfaccia aria-liquido, una condizione che consente una maggiore emulazione della fisiologia umana dei tessuti della mucosa e l'accesso diretto al tessuto per la somministrazione di farmaci direttamente sullo strato epiteliale. La Figura 1 supplementare cattura alcuni dei componenti chiave del progetto Open-Top Chip, comprese le dimensioni e i compartimenti biologici (Figura supplementare 1A-D), nonché le principali fasi tecniche descritte in questo protocollo (Figura supplementare 1E).

La perfusione del chip Open-Top si ottiene con una pompa peristaltica programmabile (Figura 1D). La configurazione della pompa peristaltica consente di eseguire contemporaneamente 12 chip Open-Top. La maggior parte degli incubatori può ospitare due configurazioni che consentono la coltura di un massimo di 24 chip per incubatore. Lo stretching meccanico è ottenuto utilizzando un regolatore di pressione del vuoto programmabile su misura (Figura 1E). È costituito da un regolatore di vuoto elettropneumatico controllato elettronicamente da un convertitore digitale-analogico. In altre parole, il regolatore di vuoto elettropneumatico genera un profilo di vuoto sinusoidale con un'ampiezza e una frequenza determinate dall'utente. La deformazione ciclica compresa tra 0% e 15% viene generata applicando una pressione negativa al canale del vuoto del chip Open-Top ad un'ampiezza compresa tra 0 e -90 kPa e una frequenza di 0,2 Hz. Si tratta di un sistema su misura equivalente all'unità di deformazione Flexcell disponibile in commercio precedentemente adottata e descritta in altri documenti25. Per imitare la deformazione meccanica del tessuto associata, ad esempio, al movimento respiratorio del polmone o alla peristalsi dell'intestino, l'attuatore pneumatico applica onde sinusoidali di vuoto/deformazione la cui grandezza e ampiezza possono essere regolate per corrispondere al livello fisiologico di deformazione e frequenza che le cellule umane sperimentano nel loro tessuto nativo.

Qui, descriviamo un metodo efficiente e riproducibile per ingegnerizzare e coltivare equivalenti di epitelio organotipico su una piattaforma prototipo Open-Top Chip. Consente la generazione di modelli di organi complessi come pelle, alveolo, vie aeree e colon, integrando un flusso di fluido vascolare e uno stretching meccanico. Descriveremo gli aspetti tecnici chiave che devono essere considerati durante l'implementazione dei principi dell'ingegneria tissutale per la generazione di modelli epiteliali complessi. Discuteremo i vantaggi e le possibili limitazioni del design attuale.

Una panoramica delle principali fasi utilizzate per ottenere la maturazione dei tessuti e degli organi, compresi i parametri di flusso e allungamento, è riportata in: Figura 2 per la pelle, Figura 3 per l'alveolo, Figura 4 per le vie aeree e Figura 5 per l'intestino. Ulteriori informazioni sulla composizione dei mezzi e sui reagenti utilizzati per la coltura dei diversi modelli di organi sono incluse nelle tabelle supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 3 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino).

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Protocollo

I colonoidi umani sono stati ottenuti da resezioni intestinali in conformità con le linee guida del Comitato istituzionale per la biosicurezza dell'ospedale pediatrico di Cincinnati (IBC 2017-2011).

1. Attivazione della superficie

  1. Preparazione del buffer di attivazione
    1. Posizionare il reticolante e i reagenti tampone solvente sotto l'armadio di biosicurezza (BSC) e lasciarli equilibrare a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti prima dell'uso.
    2. Ricostituire 5 mg di reticolante in 5 mL del tampone solvente utilizzando un contenitore sterile impermeabile alla luce o un tubo conico trasparente da 15 mL avvolto in un foglio di alluminio per proteggere la soluzione reticolante dall'esposizione diretta alla luce.
    3. Vortice la soluzione per 1 minuto per rimuovere tutti i grumi, quindi pipettare 50 μL della soluzione reticolante direttamente nel canale inferiore del chip e 150 μL nella camera aperta.
    4. Rimuovere qualsiasi eccesso di soluzione reticolante dalla superficie del chip utilizzando un aspiratore. Quindi pipettare ulteriori 50 μL della soluzione reticolante direttamente nel canale inferiore del chip e 150 μL nella camera aperta per rimuovere eventuali bolle d'aria rimanenti.
  2. Attivazione con macchina reticolante UV
    1. Rimuovere delicatamente il coperchio dal chip sotto il BSC e conservarlo in un contenitore sterile.
    2. Trasferire i trucioli contenenti la soluzione reticolante in una capsula di Petri, chiudere la capsula di Petri per evitare la contaminazione e posizionare la capsula con i trucioli sotto la macchina reticolante UV.
      NOTA: rimuovere il coperchio della piastra di Petri per massimizzare l'esposizione ai raggi UV.
    3. Impostare la reticolatrice UV con una lunghezza d'onda di picco di 365 nm ad un'intensità di 100 μJ/cm2 e accendere la luce UV per 20 minuti.
      NOTA: Dopo 20 minuti di trattamento UV, la soluzione reticolante apparirà più scura (marrone).
    4. Riportare i trucioli sotto il BSC e aspirare la soluzione reticolante ossidata. Quindi, sciacquare tutti i trucioli tre volte con il tampone solvente e lasciare asciugare i trucioli sotto il BSC per 5-10 minuti per completare la funzionalizzazione chimica della superficie del polidimetilsilossano (PDMS).

2. Preparazione dello stroma equivalente

  1. Preparazione del tampone di ricostruzione 10x (100 ml)
    1. Sciogliere 2,2 g di bicarbonato di sodio in 75 mL di 0,067 M NaOH in acqua bidistillata.
    2. Aggiungere 4,76 g di HEPES e portare il volume a 100 ml utilizzando acqua distillata doppiamente.
    3. Filtrare sterile la soluzione sotto la BSC utilizzando un filtro monouso sterile a bottiglia con membrana da 0,22 μm.
      NOTA: La soluzione è stabile per circa 6 mesi se conservata a 4 °C.
  2. Stima del volume della soluzione pre-gel
    1. Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 150 μL (volume interno della camera centrale aperta) per stimare la quantità di soluzione pre-gel necessaria per l'esperimento:
      Volume necessario = (Numero di chip x 150) μL
    2. Preparare la soluzione di collagene pre-gel su ghiaccio mescolando: 1 volume di 10x EMEM contenente le cellule di scelta, 1 volume di tampone di ricostruzione 10x (vedere punto 2.1), 8 volumi di soluzione di collagene I (10 mg/ml) e 1 μL di soluzione 1 N NaOH per ogni mg di collagene I.
      NOTA: Si consiglia di preparare un volume extra +15% per tenere conto degli errori sperimentali; L'esempio descritto nella sezione 2.2 fornisce una procedura dettagliata passo-passo per preparare una soluzione pre-gel sufficiente per 12 chip e un volume extra del 15%.
  3. Preparazione della soluzione pre-gel per lo stroma equivalente (per 12 chip)
    1. Portare le seguenti soluzioni sotto il BSC su ghiaccio: 10x EMEM; 10x Buffer di ricostruzione (vedere il punto 2.1); Soluzione di collagene I (10 mg/ml); e soluzione sterile 1 N NaOH.
    2. Colture di cellule mesenchimali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente, quindi dissociare le cellule usando tripsina o altri metodi come raccomandato dal fornitore di cellule. Raccogliere le celle in un pellet mediante centrifugazione a 250 x g per 5 minuti a 24 °C.
    3. Risospendere il pellet cellulare in 225 μL di EMEM 10x ghiacciato e aggiungere 225 μL di tampone di ricostruzione 10x ghiacciato (vedere punto 2.1). Mescolare la soluzione pipettando delicatamente su e giù, quindi aggiungere 1.800 μL di soluzione di collagene I ghiacciata.
    4. Pipettare su e giù 5-6 volte, evitando bolle per mescolare la soluzione pre-gel mentre si è sul ghiaccio.
  4. Incorporazione dello stroma equivalente su chip (per 12 chip)
    1. Neutralizzare la soluzione pre-gel con 18 μL di 1 N NaOH. Mescolare delicatamente pipettando su e giù 5-6 volte, quindi pipettare 150 μL di idrogel carico di cellule nella camera centrale del chip Open-Top evitando bolle.
      NOTA: se è necessaria la micropatterning, passare al passaggio successivo (sezione 3).
    2. Raggruppare i trucioli in piastre di Petri separate, compreso un tappo a tubo da centrifuga riempito con 2 ml diddH 2O sterile in ciascuna capsula di Petri, e incubare le piastre di Petri nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2.
      NOTA: Dopo 90 minuti, l'idrogel carico di cellule sarà completamente polimerizzato.

3. Micropatterning superficiale (opzionale)

  1. Eseguire la micromodellazione superficiale dell'idrogel stromale dopo il pipettaggio dell'idrogel di collagene neutralizzato (ancora allo stato liquido) utilizzando timbri stampati in 3D.
    NOTA: I francobolli stampati in 3D possono essere ottenuti in vari disegni personalizzabili, come precedentemente descritto altrove24.
  2. Pipettare 20 μL della soluzione di collagene neutralizzato I pre-gel sulla superficie modellata di un timbro sterile stampato in 3D e inserire il timbro all'interno (in alto) della camera aperta mentre l'idrogel stromale è ancora in forma liquida.
  3. Rimuovere qualsiasi residuo di idrogel che potrebbe fuoriuscire dalla parte superiore della camera aperta utilizzando un aspiratore (o una pipetta). Raggruppare tutti i trucioli in piastre di Petri separate e includere un tappo a tubo conico da 15 mL da 15 mL riempito con 2 mL diddH 2O sterile in ciascuna capsula di Petri.
  4. Incubare tutte le piastre di Petri a 37 °C, 5% CO2 per 90 minuti, quindi riportare i trucioli sotto la BSC e rimuovere delicatamente i timbri usando una pinzetta di precisione per ridurre il rischio di danneggiare l'idrogel.

4. Rivestimento della superficie epiteliale e vascolare con proteine ECM tessuto-specifiche

  1. Rivestimento della camera microfluidica vascolare con proteine della matrice extracellulare
    1. Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 20 μL (volume del canale vascolare) per stimare il volume della soluzione di rivestimento ECM vascolare richiesta per l'esperimento:
      Volume necessario = (Numero di chip x 20) μL
      NOTA: si consiglia di preparare un volume aggiuntivo del 15% per tenere conto degli errori sperimentali.
    2. Preparare la soluzione di rivestimento ECM vascolare per tutti i chip (ad esempio, 300 μL per 12 chip) utilizzando PBS o HBSS ghiacciati.
      NOTA: Fare riferimento alla tabella specifica organo-protocollo nella sezione materiali supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino) per identificare i reagenti specifici e la composizione ECM raccomandata.
    3. Pipettare 20 μL di soluzione di rivestimento ECM vascolare nel canale vascolare di ciascun chip.
  2. Rivestimento della superficie apicale dell'equivalente stromale con proteine della matrice extracellulare
    1. Moltiplicare il numero di chip necessari per l'esperimento per 50 μL (volume del canale vascolare) per stimare il volume della soluzione di rivestimento ECM epiteliale necessaria per l'esperimento:
      Volume necessario = (Numero di chip x 50) μL
      NOTA: si consiglia di preparare un volume extra del 15% per tenere conto degli errori sperimentali.
    2. Preparare una soluzione di rivestimento ECM sufficiente per tutti i chip (ad esempio, 750 μL per 12 chip) in PBS o HBSS ghiacciato e trasferire 50 μL di soluzione di rivestimento ECM epiteliale direttamente sulla superficie dell'idrogel.
      NOTA: Fare riferimento alla tabella specifica organo-protocollo nella sezione materiali supplementari (Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree e Tabella supplementare 4 per l'intestino) per identificare i reagenti specifici e la composizione ECM raccomandata.
    3. Raggruppare i trucioli in piastre di Petri separate, compresa una centrifuga da 15 mL di tappo conico riempito con 2 mL di ddH2O sterile in ciascuna capsula di Petri, e incubare le piastre di Petri nell'incubatore a 37 °C, 5% CO 2 per2 ore prima di procedere con la semina delle cellule epiteliali.

5. Seminare cellule epiteliali sull'equivalente stromale

  1. Coltura cellulare epiteliale
    1. Colture di cellule epiteliali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente.
    2. Dissociare le cellule utilizzando procedure enzimatiche proteolitiche come raccomandato dal fornitore di cellule.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati, raccogliere cellule epiteliali a basso passaggio (P1-P2) durante la fase di crescita attiva quando raggiungono tra il 70% e il 90% di confluenza.
    3. Una volta dissociate, centrifugare le cellule e raccoglierle come pellet.
    4. Risospendere le cellule epiteliali alla densità appropriata di cellula/frammento come indicato nella tabella specifica del protocollo d'organo.
      NOTA: In questo studio, la soluzione cellulare è stata utilizzata a una densità di 3 x 10 6 cellule / ml per la pelle, 1 x 10 6 cellule / ml per l'alveolo, 6 x 10 6 cellule / ml per le vie aeree e 8 x 10 6 frammenti / ml per l'intestino.
  2. Semina delle cellule epiteliali
    1. Trasferire i chip dall'incubatore al BSC. Aspirare la soluzione di rivestimento dal canale vascolare e sciacquare il canale microfluidico vascolare tre volte con 50 μL di terreno di coltura cellulare endoteliale fresco.
    2. Aspirare la soluzione di rivestimento dalla superficie dell'idrogel e sciacquare la superficie stromale tre volte con 100 μL di terreno di coltura cellulare epiteliale fresco per rimuovere qualsiasi soluzione di rivestimento in eccesso.
    3. Aspirare il terreno ascendente e seminare la superficie dell'idrogel con 50 μL della sospensione cellulare epiteliale utilizzando la densità cellulare appropriata, come indicato nelle tabelle supplementari, quindi trasferire nuovamente i trucioli nell'incubatore per 2 ore (o durante la notte per i colonoidi).
    4. Risciacquare delicatamente la superficie dell'idrogel con il terreno di coltura cellulare due volte per rimuovere i detriti cellulari. Infine, rinfrescare il mezzo mediante autoclave in contenitori autoclavabili sigillati e collegare i trucioli alla pompa peristaltica.

6. Collegamento dei chip al flusso

  1. Preparazione delle parti fluidiche
    1. Tagliare 2 pollici di tubo di trasferimento in elastomero termoplastico (TPE) a base di polipropilene biocompatibile (Table of Materials) per preparare il tubo microfluidico corto necessario per collegare i chip ai serbatoi dei fluidi.
    2. Tagliare 7,5 pollici di tubi di trasferimento TPE biocompatibili per produrre il lungo tubo microfluidico.
    3. Preparare abbastanza connettori metallici da 18 G e 19 G (tabella dei materiali).
      NOTA: Si raccomanda di preparare e sterilizzare i tubi e i connettori descritti nei punti 6.1.1 e 6.1.2 almeno 1 giorno prima di collegare i chip aperti alle pompe peristaltiche.
    4. Forare il coperchio di ciascun serbatoio medio con un ago ipodermico da 4 pollici (tabella dei materiali).
  2. Degasaggio medio
    1. Lasciare che il terreno di coltura cellulare si equilibri a temperatura ambiente (RT).
    2. Trasferire il volume del mezzo necessario in un tubo filtrante conico.
    3. Applicare una pressione di vuoto negativa di -20 PSI per degassare il fluido (filtrazione guidata dal vuoto).
      NOTA: Se non è disponibile un vuoto, il terreno di coltura cellulare può essere lasciato equilibrare nell'incubatore durante la notte per ottenere risultati simili.
  3. Preparare il chip Open-Top per il flusso del fluido
    1. Portare i trucioli e le parti fluidiche sterili sotto il BSC e allineare il coperchio (parte superiore) del chip Open-Top per sigillare il prototipo di chip Open-Top prima di iniziare il flusso del fluido.
    2. Pipettare 200 μL del terreno di coltura cellulare degassato (vedere tabelle organo-specifiche) nella porta di ingresso di entrambi i canali superiore e inferiore del chip prestando attenzione per evitare bolle.
    3. Pipettare 300 μL del terreno di coltura nel tubo microfluidico corto per innescare la superficie interna dei tubi e collegare il tubo corto agli ingressi dei canali superiore e inferiore del chip.
  4. Collegare e innescare le superfici microfluidiche
    1. Posizionare i serbatoi medi nel rack dell'azienda, collegare l'ago ipodermico all'ingresso inferiore dei trucioli e, infine, ospitare tutti i trucioli nei supporti dell'alloggiamento all'interno dell'incubatore.
    2. Collegare i chip alla pompa peristaltica, quindi ispezionare tutti i connettori per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano perdite visibili di terreni di coltura cellulare.
    3. Utilizzare il pulsante di spurgo sulla pompa e tenerlo premuto per circa 15 secondi o fino a quando le goccioline del terreno di coltura cellulare appaiono alla fine del tubo di deflusso.
    4. Utilizzare il sistema di controllo sulla pompa per impostare la portata organo-chip appropriata (Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5).

7. Manutenzione dei chip

  1. Manutenzione del chip dell'organo
    1. Preparare un terreno di coltura cellulare fresco per l'epitelio e/o l'endotelio ed eseguire le fasi di degasaggio (come precedentemente descritto al punto 6.2).
    2. Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire i trucioli dall'incubatore al BSC e rimuovere il volume di fluido rimasto nei serbatoi.
    3. Sostituire i terreni di coltura cellulare nei serbatoi di ingresso superiore e inferiore con 5 ml di terreno di coltura cellulare fresco e riposizionare i supporti dell'alloggiamento del chip nell'incubatore. Collegare i chip alla pompa peristaltica e riavviare il flusso.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria.
    4. Ripetere i passaggi 7.1.1-7.1.3 a giorni alterni, come da Figura 2, Figura 3, Figura 4 e Figura 5.
  2. Creazione di un'interfaccia aria-liquido (ALI)
    1. Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire i trucioli dall'incubatore all'armadio di biosicurezza e rimuovere il volume di mezzo rimasto nel serbatoio superiore.
    2. Aspirare delicatamente tutto il fluido dal canale microfluidico superiore e bloccare il tubo microfluidico corto collegato agli ingressi superiori utilizzando clip leganti per ridurre l'evaporazione del fluido e il mantenimento di ALI.
    3. Posizionare il chip Open-Top sui supporti dell'alloggiamento nell'incubatore e ricollegare i chip alla pompa peristaltica.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria.
    4. Riprendere il flusso avviando la pompa peristaltica.
  3. Stretching (opzionale)
    1. Mettere in pausa la pompa peristaltica e collegare le porte del vuoto dei chip al modulo del vuoto utilizzando due lunghi tubi microfluidici per chip.
    2. Utilizzare il modulo vuoto per regolare l'impostazione di allungamento in base alla condizione raccomandata per ciascun organo, come specificato all'interno delle tabelle di protocollo degli organi: Tabella supplementare 1 per la pelle; Tabella supplementare 2 per l'alveolo; Tabella supplementare 2 per le vie aeree; e Tabella supplementare 4 per l'intestino.
    3. Ispezionare visivamente le connessioni dei tubi per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano goccioline visibili di gocciolamento medio.
    4. Riprendere il flusso avviando la pompa peristaltica.

8. Semina di cellule endoteliali nel compartimento vascolare

  1. Preparare cellule e chip per la semina delle cellule vascolari
    1. Coltivare le cellule endoteliali tessuto-specifiche come indicato dai fornitori fino all'80% -90% confluente. Dissociare le cellule utilizzando una procedura enzimatica proteolitica (come raccomandato dal fornitore) e, infine, risospendere le cellule endoteliali in una soluzione di 3 x 106 cellule / ml.
      NOTA: Per ottenere i migliori risultati, raccogliere le cellule endoteliali a basso passaggio (P2-P4) durante la fase di crescita attiva quando raggiungono tra il 70% e il 90% di confluenza.
    2. Metti in pausa la pompa peristaltica. Trasferire i chip dall'incubatore al BSC, scollegare i chip dai serbatoi dei supporti e da qualsiasi tubo collegato, quindi raggruppare i chip in piastre di Petri separate.
    3. Rinfrescare il terreno di coltura cellulare del compartimento epiteliale con terreno di coltura cellulare epiteliale fresco. Risciacquare il canale vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale fresco due volte, quindi aspirare il mezzo dal compartimento vascolare.
  2. Semina delle cellule endoteliali
    1. Seminare il canale inferiore (vascolare) con 25 μL di sospensione di cellule endoteliali (3 x 106 cellule / ml), capovolgere i chip per consentire alle cellule endoteliali di attaccarsi alla superficie superiore della camera microfluidica.
      NOTA: Aggiungere 50 μL di sospensione cellulare per chip (600 μL per 12 chip).
    2. Raggruppare le patatine in piastre di Petri. Rimetterli nell'incubatore a 37 °C, 5% di CO2, e lasciare che le cellule endoteliali si attacchino per 1 ora.
    3. Dopo 1 ora, trasferire i chip dall'incubatore al BSC. Risciacquare il canale vascolare con terreno di coltura cellulare endoteliale due volte per rimuovere i detriti cellulari.
    4. Ripetere i passaggi 8.2.1-8.2.2 per seminare nuovamente il canale vascolare con cellule endoteliali e posare i trucioli in piano per facilitare l'adesione delle cellule endoteliali alla superficie inferiore del canale vascolare.
  3. Ricollegare il chip al flusso
    1. Riempire il serbatoio del mezzo vascolare con il terreno di coltura cellulare vascolare degassato sotto la BSC.
    2. Riposizionare i trucioli all'interno dei contenitori dell'alloggiamento del chip e ricollegare i trucioli ai serbatoi medi su un'estremità alla pompa peristaltica all'altra estremità.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare la funzione Purge per aggiornare rapidamente il mezzo al compartimento vascolare e ridurre il rischio di bolle d'aria.
    3. Ispezionare visivamente le connessioni microfluidiche per assicurarsi che tutti i chip siano collegati correttamente e che non vi siano goccioline visibili di gocciolamento medio. Quindi, riprendere il flusso del fluido avviando la pompa peristaltica.

9. Saggi comuni degli endpoint

  1. Disconnettere i chip per i test degli endpoint
    1. Mettere in pausa la pompa peristaltica, scollegare con attenzione i chip dalla pompa ed estrarre i supporti dell'alloggiamento del chip. Trasferire il/i porta-alloggiamento del chip dall'incubatore al BSC e liberare i chip.
    2. Lavare delicatamente la camera centrale dell'Open-Top Chip con il terreno di coltura cellulare epiteliale e il canale vascolare con il terreno di coltura dell'endotelio due volte per rimuovere eventuali detriti cellulari.
    3. Rimuovere il coperchio dell'Open-Top Chip per accedere al compartimento apicale del chip utilizzando una pinzetta.
  2. Immunocolorazione per microscopia a fluorescenza
    1. Procedere con la fissazione, la permeabilizzazione e il blocco convenzionali del campione.
      NOTA: In questo studio, i campioni sono stati fissati in 200 μL di paraformaldeide (PFA) al 4% per 1 ora, seguito da risciacquo con PBS, permeabilizzazione in Triton X-100 allo 0,1% per 40 minuti e blocco in albumina sierica bovina all'1% per 1 ora.
    2. Incubare i trucioli con anticorpi primari (Table of Materials) a 4 °C durante la notte. e quindi lavare due volte i compartimenti epiteliali ed endoteliali dei chip con 200 μL di PBS. Quindi, procedere con gli anticorpi secondari appropriati per 2 ore.
      NOTA: Diluire gli anticorpi primari e gli anticorpi secondari in PBS + 1% BSA ad una diluizione di 1:100 (anticorpo primario) e 1:200 (anticorpo secondario).
  3. Immunoistochimica
    1. Estrarre gli equivalenti stromali dalla camera principale del chip Open-Top usando una pinzetta, raccoglierli in un tubo da 1,5 ml riempito con formalina tamponata neutra al 10% e incubare per almeno 24 ore.
    2. Trasferire l'equivalente stromale fisso al processore tissutale e seguire i passaggi seguenti per ottenere una disidratazione ottimale del campione.
      1. Immergere l'idrogel in etanolo al 70% per 90 minuti.
      2. Rimuovere l'etanolo al 70% e immergere l'idrogel in etanolo all'80% per 90 minuti.
      3. Rimuovere l'etanolo all'80% e immergere l'idrogel in etanolo al 95% per 90 minuti.
      4. Rimuovere l'etanolo al 95% e immergere l'idrogel in etanolo al 100% per 90 minuti due volte.
      5. Rimuovere l'etanolo al 100% e immergere l'idrogel in una soluzione di xilene per 120 minuti due volte.
      6. Rimuovere la soluzione di xilene e infiltrare gli equivalenti stromali trattati nella cera di paraffina per 120 minuti (~ 2 h) due volte.
    3. Incorporare gli equivalenti stromali infiltrati in blocchi di paraffina sezionati.
    4. A questo punto, gli equivalenti stromali possono essere sezionati come blocchi di paraffina usando un microtomo e trattati secondo le tecniche istologiche convenzionali26.

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Risultati

Micropatterning superficiale
Il micropatterning della matrice extracellulare (ECM) può essere utilizzato per replicare la configurazione spaziale dell'interfaccia della cripta intestinale. La configurazione Open-Top Chip può essere modificata per integrare timbri microstrutturati specificamente progettati per imitare la topografia naturale dell'interfaccia epitelio-stroma del colon (Figura 6A,B) e delle cripte intestinali su scala micrometrica (Figura 6C-E

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Discussione

L'Open-Top Chip rappresenta una piattaforma abilitante per studiare la complessa interazione cellulare che si verifica tra endotelio, stroma ed epitelio in un microambiente controllato, in tempo reale. Questa tecnologia offre vantaggi critici rispetto alle colture organotipiche e organoidi convenzionali, come l'integrazione di segnali fisici e biochimici rilevanti per ricostituire il microambiente del tessuto umano, tra cui taglio fluidico (flusso), allungamento ciclico e ricostruzione della topografia della superficie e...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano i seguenti interessi finanziari/relazioni personali, che possono essere considerati come potenziali interessi concorrenti: Varone Antonio è un ex dipendente di Emulate Inc. e può detenere partecipazioni in Emulate.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x EMEM Lonza12-684FMedio; Stroma
Ago calibro 18MicroGroup316H18RWTubo in acciaio inox 316 saldato, 18RW Full Hard 
Ago calibro 19MicroGroup316H19RWTubo in acciaio inox 316 saldato, 19RW Full Hard
2-Stop PharMed BPT Cole-PalmerEW-95723-12Tubo, 0,25 mm, 12/confezione
70% etanolo e salviette  -  - Per la sterilizzazione delle superfici 
8-Bromoadenosina 3′,5′-sale sodico monofosfato ciclico (8-Br-cAMP)SigmaB7880Integratore medio 
A-83-01 Tocris 2939
AdeninaSigmaA9795
DMEM/F12 avanzatoCelleThermo 12634010
Lifeline Cell TechnologyFC-0016
Foglio di alluminio  -  -  -
Cellule alveolariCell BiologicsH6621
Anti-ABCA3   ABCAM ab24751 Anticorpo monoclonale di topo [3C9] 
Anti-Aquaporin5 Alexa Fluor 647 ABCAM ab215225   Anticorpo monoclonale di coniglio [EPR3747]   
Anti-acquaporina5 ABCAM ab92320 Anticorpo monoclonale di coniglio [EPR3747] 
Tubulina anti-beta IV   ABCAM ab11315 Anticorpo monoclonale di topo [ONS.1A6] 
Anti-CD31 (PECAM-1) ABCAM ab9498 Anticorpo monoclonale di topo [JC/70A]   
Anti-CK5   ABCAM ab75869 Coniglio ricombinante monoclonale [AY1E6] 
Anti-citocheratina 10   ThermoFisher MA5-13705 Anticorpo monoclonale di topo (DE-K10) 
Anti-citocheratina 14   ABCAM ab7800 Anticorpo monoclonale di topo 
Anti-E-Caderina   ABCAM ab1416   Anticorpo monoclonale di topo 
Anti-Filaggrin   ThermoFisher PA5-79267 Anticorpo policlonale di coniglio   
Anti-HTI-56 Terrazza Biotech TB-29AHT1-56   Anticorpo monoclonale di topo (IgG1) 
Anti-HTII-280 Terrazza Biotech TB-27AHT2-280 Anticorpo monoclonale di topo (IgM) 
Anti-involucrina   ThermoFisher MA5-11803 Anticorpo monoclonale di topo (SY5) 
Anti-Isoforme TA p63-&alfa;, -β, -γ    Biolengend 618902 Anticorpo policlonale di coniglio   
Anti-Ki67   ABCAM ab8191 Anticorpo monoclonale di topo [B126.1] 
Anti-LAMP3   ABCAM ab111090 Anticorpo policlonale di coniglio 
Anti-Maturo SP-B Sette ColliWRAB-48604 Anticorpo policlonale di coniglio 
Anti-MUC5AC   ThermoFisher PA5-34612 Anticorpo policlonale di coniglio   
Anti-Mucina-2 SantaCruz Biotechnologysc-7314Anticorpo monoclonale di topo (IgG1) 
Anti-p63   Dako GA662 Anticorpo monoclonale di topo p63 Proteina (Dako Omnis)  Clone DAK-p63 
Anti-PCNA   ThermoFisher PA5-32541 Anticorpo policlonale di coniglio   
Anti-podoplanina (AT-1&alfa;)   ABCAM ab128994 Anticorpo policlonale di coniglio 
Anti-Pro + Proteina Tensioattivo Maturo B ABCAM ab40876 Anticorpo policlonale di coniglio 
Anti-tensioattivo C     Sette Colli  WRAB-9337   Anticorpo policlonale di coniglio 
Anti-Uteroglobina/SCGB1A1 Hycult Biotech HM2178 Anticorpo monoclonale di topo [AY1E6] 
Anti-VE-caderina   ABCAM ab33168 Anticorpo policlonale di coniglio   
Anti-ZO-1   ThermoFisher 33-9100 Anticorpo monoclonale di topo [1A12] 
Acido ascorbicoSigmaA4544
Pipette di aspirazione Corning / Falco357558 2 mL, polistirolo, confezionato singolarmente
Punte di aspirazione  -  - Sterile (autoclavato) 
B27
BSA (10X) in soluzione PBS   ThermoFisher 37525 Agente bloccante 
Cloruro di calcioSigmaC7902
CHIR 99021Tocris4423
Collagene IAdvanced Biomatrix513310 mg/mL (Stroma)
Collagene I Advanced BioMatrix50053 mg/mL (ECM vascolare)
Collagene IVSigma  C5533
Collagene-IVSigmaC5533-5MG Collagene da placenta umana, 5 mg in polvere, ricostituito a 1 mg/mL 
Fibroblasti del colon Biologici cellulari  H6231
Cellule endoteliali microvascolari del colon  Cell BiologicsH6203 
Tubi conici    -  - 15 ml e 50 ml in polipropilene, sterile 
Reticolante (ER-1) Emulare 104615 mg di polvere 
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindolo, dilattato)   ThermoFisher D3571 Sonda DNA 
Fibroblasti dermiciATCCPCS-201-010
Cellule endoteliali microvascolari dermicheATCCCRL-3243
DesametasoneSigmaD4902
DMEMThermoFisher11054020
DMEM/F-12 GIBCO 
DMEM/F-12, GlutaMAX   GIBCO Codice 10565-018 Terreno basale per ALI medio 
Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 488)   ABCAM ab150105 Anticorpo secondario anti-topo asino   
Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 568)   ABCAM ab175472 Anticorpo secondario anti-topo asino 
Asino Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 647)   ABCAM ab150107 Anticorpo secondario anti-topo asino 
Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 488)   ABCAM   ab150073 Anticorpo secondario anti-topo asino 
Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 568)   ABCAM ab175470 Anticorpo secondario anti-topo asino 
Asino Anti-Coniglio IgG H& L (Alexa Fluor 647)   ABCAM ab150075 Anticorpo secondario anti-topo asino 
Dulbecco' s PBS (DPBS-/-) (senza Ca2+, Mg2+) Corning 21-031-CV 1x 
Fattore di crescita epidermico (EGF) umano, ricombinante in E. coliPromoCellC-60170Integratore di terreno
F-12 Ham' sInvitrogen 21700-108Per ECM vascolare
FibriCol BioMatrix avanzato 5133-20ML Soluzione di collagene-I (10 mg/mL)
FibronectinaCorning356008
Fibronectina, umano, naturale,   Corning 47743-654 fibronectina plasmatica umana 
Pinzette di precisione a punta fine Aven18056USA Pinzetta di precisione Technik Style 5B-SA in acciaio inossidabile
GlutamaxInvitrogen 21700-108
Glutamax Invitrogen 
IgG H& L (Alexa Fluor 594)   ABCAM ab150080 Anticorpo secondario anti-topo di capra   
Capra Anti-Topo IgG H& L (Alexa Fluor 647)   ABCAM ab150115 Anticorpo secondario anti-topo di capra   
Capra Anti-Topo IgG H& L (FITC)   ABCAM ab6785 Anticorpo secondario anti-topo di capra   
Capra Anti-Topo IgG1 Alexa Fluor 568   ThermoFisher A-21124 Anticorpo secondario IgG1 anti-topo di capra 
Capra Anti-Topo IgM Alexa Fluor 488   ThermoFisher A-21042 Anticorpo secondario IgM anti-topo di capra 
Aspiratore a vuoto portatile Corning 4930  - 
Siero HyClone FetalClone II inattivato a caldo (FCS) Emocitometro GE Healthcare Life SciencesSH30066.03
 -  - - 
Eparina sale sodico dalla mucosa intestinale suinaSigmaH3149
HEPESThermo 15630080
Human [Leu15] - Gastrin SigmaG9145
Colonoidi umaniOttenuti da resezionicliniche Ottenuti da resezioni cliniche
Proteina ricombinante EGF umanaThermoPHG0311L
fattore di crescita epiteliale umano Termo 
Siero HyClone FetalClone II (Stati Uniti)  GE Healthcare SH30066.02HI   FBS sterile  inattivato a caldo 
Idrocortisone 21-emiuccinato sale sodicoSigmaH4881
Idrocortisone PromoCell   C-64420 Integratore medio   
Secchiello per il ghiaccio  -  -  - 
Ismatec IPC-N Cole-PalmerEW-78000-41Pompa peristaltica digitale a bassa velocità; q24-Channel (1 per 12 chip)
ITESBioWhittaker17-839Z
Fattore di crescita dei cheratinociti (KGF), noto anche come fattore di crescita dei fibroblasti basici 7 (FGF-7), umano, ricombinante in HEKPromoCellC-63821
CheratinocitiATCCPCS-200-010
Laminina BiolaminaCT521-0501 
Laminina, 521 CTG (CT521) Biolamina  CT521-0501 laminina umana ricombinante 521       
Fibroblasti polmonaricellulari biologiciH6013
Fibroblasti polmonariLifeline Cell TechnologyFC-0049
Cellule endoteliali microvascolari polmonariLonzaCC-2527
Cellule muscolari lisce polmonariLifeline Cell TechnologyFC-0046
Contatore manuale  -  -  -
Tubi di trasferimento Masterflex (TPE) Cole-PalmerFV-96880-02PharMed BPT, 1/32" ID x 5/32"
OD Medium 199, senza rosso fenoloThermo 
Provetta per microcentrifuga  -    -   1,5 ml, sterile 
Microscopio (con fotocamera)  -  - Per l'imaging in campo chiaro 
N2Sigma17502001
N-acetil cisteinaSigmaA5099
Noggin (HEK293T terreno condizionato)SigmaN17001
Siero di capra normale   ThermoFisher 50062Z Soluzione bloccante   
O-fosfosriletanolammina SigmaP0503
Paraformaldeide (4% in peso/vol)   EMS 15710 Agente fissante 
Penicillina StreptomicinaGIBCO15140122
Penicillina-streptomicina Sigma P4333 10.000 U/mL; 10 mg/mL 
Puntali per pipette    -  - P20, P200 e P1000  Pipetta sterile a bassa adesione
Gilson  F167380 P20, P200 e P1000 
PluriQ Serum Replacement (o in alternativa KO Serum replacement)AMSBIO (o Thermo)N/A (o C1910828010)
Poly-L-Lysine coated glass slides   Sigma P0425 Vetrini
PrimocinInvivoGenant-pm-1
ProgesteroneSigmaP8783
ProLong Gold   ThermoFisher P36931 Montaggio antisbiadimento con DAPI 
Acido retinoico SigmaR2625
ROCK inibitore (Y27632)TocrisTB1254-GMP/10
R-spondina (HEK293T terreno condizionato)SigmaSCC111
SAGM SingleQuots integratori LonzaCC-4124
SAGMTM Terreno di crescita delle cellule epiteliali delle piccole vie aeree BulletKitTM LonzaCC-4124 Integratori medi 
SB2001190 Tocris 1264/10
Pipette sierologiche  -  - 2 mL, 5 mL, 10 mL e 25 mL di endotossina bassa, sterile.
Terreno di crescita delle cellule epiteliali delle piccole vie aeree (SAGM)LonzaCC-4124 
Tampone solvente (ER-2) Emulare 10462Flacone da 25 mL
Steriflip-HV MilliporeSE1M003M00Tubo conico filtrante sterile
Sterilin 100 mm Piastre di Petri quadrateThermo103Sterile, 1 per 6 chip 
Palloni T25 -  -  -
Palloni T75 -  -  - 
Tri-iodotironinaSigmaT5516
Triton X-100 (0,3% (vol/vol)   Sigma T8787 Agente di permeabilizzazione 
Blu di tripano Sigma 93595 Soluzione allo 0,4% 
Soluzione TrypEE Sigma 12604013 Soluzione per il distacco delle cellule 
TWEEN-20 Sigma P2287 Agente di permeabilizzazione 
Forno a luce UV (frequenza di picco 365nm, intensità di 100 & micro; J/cm2)VWR21474-598UVP, Long Range UV, 365 nm 60Hz Modello CL-1000L
Configurazione del vuoto  -  - Pressione minima: -70 kPa 
Fattore di crescita dell'endotelio vascolare 165 (VEGF-165) umano, ricombinante in E. coliPromoCellC-64420
VEGF-165   PromoCell   C-64420 Integratore medio 
Fattore di Von Willebrand coniugato FITC   ABCAM ab8822 Anticorpo policlonale di pecora 
Bagnomaria (o perline)  -  - Impostato su 37 ° C 
Wnt3A (L-Wnt3A fluido condizionato)ATCCCRL-2647
epiteliali delle vie aeree Termobloccante 17504044 1132008235050061PHG031111043023

Riferimenti

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