Method Article

Metodi e protocolli per l'imaging dal vivo in fase di sviluppo

DOI:

10.3791/64642

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January 13th, 2023

1Department of Neurobiology and Department of Neurosurgery of Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Liangzhu Laboratory, MOE Frontier Science Center for Brain Science and Brain-machine Integration, State Key Laboratory of Brain-machine Intelligence, Zhejiang University, 3NHC and CAMS Key Laboratory of Medical Neurobiology, Zhejiang University

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTICOLI DISCUSSI:

Januschke, J., Loyer, N. Applicazioni di immobilizzazione di tessuti di Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo. Giornale degli esperimenti visualizzati. (166), 10.3791/61954 (2020).

Li, T., Luo, L. Un sistema di espianti per studi di imaging time-lapse dell'assemblaggio del circuito olfattivo in Drosophila. Giornale degli esperimenti visualizzati. (176), 10.3791/62983 (2021).

Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. Imaging in vivo di tessuto cerebrale completamente attivo in larve di zebrafish sveglie e giovani mediante rimozione del cranio e della pelle. Giornale degli esperimenti visualizzati. (168), 10.3791/62166 (2021).

Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Imaging simultaneo dal vivo di più embrioni di insetti in microscopi a fluorescenza a foglio luminoso basati su camera di campionamento. Giornale degli esperimenti visualizzati. (163), 10.3791/61713 (2020).

Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS imaging di cellule vive durante lo sviluppo neuronale. Giornale degli esperimenti visualizzati. (168), 10.3791/62165 (2021).

Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Imaging label-free delle dinamiche di accumulo lipidico in Caenorhabditis elegans utilizzando la microscopia a scattering Raman stimolata. Giornale degli esperimenti visualizzati. (171), 10.3791/61870 (2021).

Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Ablazioni di volume profonde e spazialmente controllate utilizzando un microscopio a due fotoni nella gastrula del pesce zebra. Giornale degli esperimenti visualizzati. (173), 10.3791/62815 (2021).

Discussion

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Lo sviluppo è caratterizzato dal cambiamento dinamico delle strutture a livello di organelli, cellule e organi. La capacità dell'imaging time-lapse di raccogliere informazioni quadridimensionali dalla stessa struttura nelle sue condizioni fisiologiche lo rende una tecnica ideale per studiare il processo dinamico di sviluppo 1,2,3,4,5,6. La grande quantità di dati raccolti attraverso l'imaging dal vivo consente anche l'analisi quantitativa dello sviluppo. Sebbene l'imaging time-lapse sia stato più ampiamente utilizzato per la coltura cellulare a strato singolo, l'imaging di tessuti vivi tridimensionali o animali è molto più impegnativo a causa di difficoltà tecniche, come la diffusione della luce di tessuti vivi, lo sviluppo di una strategia di montaggio e di un metodo di etichettatura appropriati, il mantenimento di condizioni fisiologiche normali durante un lungo periodo di imaging, l'accessibilità a un microscopio adatto, and so on. Queste sfide limitano l'uso dell'imaging dal vivo in molti laboratori. In questa raccolta di metodi, sette articoli hanno riportato nuovi metodi di preparazione di campioni vivi, etichettatura e manipolazione basata su laser. Tutti questi metodi facilitano l'imaging dal vivo dei processi di sviluppo da diverse angolazioni.

L'imaging diretto delle regioni profonde è tecnicamente impegnativo a causa della forte dispersione di tessuti vivi. Questa dispersione può essere minimizzata dall'esposizione degli organi interni attraverso la dissezione, migliorando così la risoluzione spaziale delle immagini. In questa raccolta, Januschke e Loyer7 hanno descritto un protocollo per sezionare il cervello larvale di Drosophila e un metodo di montaggio che utilizza coaguli di Fibrina. Questa strategia di montaggio ha consentito l'imaging time-lapse utilizzando microscopi invertiti di più campioni sullo stesso piatto, poiché richiedeva solo l'aggiunta di fibrinogeno e trombina. Li e Luo8 hanno presentato un protocollo per la dissezione di un espiante antenne-cervello da pupe di mosca e una condizione di coltura ex vivo che ha mantenuto il normale sviluppo del circuito olfattivo per 24 ore. Il loro sistema ha permesso di visualizzare il targeting assonale e dendritico nell'assemblaggio di un circuito olfattivo di mosca dalla sua condizione fisiologica. Questo sistema di espiantazione è adatto per microscopi a due fotoni e microscopi a foglio luminoso a reticolo con imaging basato su ottica adattiva, consentendo sia l'imaging continuo a lungo termine che l'imaging veloce con un'elevata risoluzione spazio-temporale in un breve periodo di tempo. Schramm et al.9 hanno sviluppato una procedura chirurgica minimamente invasiva per rimuovere la pelle e la cartilagine molle del cranio del pesce zebra attraverso il micro-peeling. Ciò ha permesso loro di osservare alcuni eventi chiave nelle fasi successive dello sviluppo, tra cui la differenziazione neuronale, la maturazione, la plasticità e il transitorio del Ca2+ fino a 30 giorni dopo la fecondazione. Ha anche permesso loro di eseguire l'imaging dal vivo dopo la pigmentazione delle pelli larvali di zebrafish. Oltre alla dissezione, anche il montaggio appropriato dei campioni è fondamentale per l'imaging dal vivo. Ratke et al.10 hanno presentato un quadro sperimentale per l'imaging simultaneo dal vivo di più embrioni di mosca utilizzando la microscopia a foglio di luce. Questo protocollo ha aumentato la produttività complessiva ed è ideale per lo studio comparativo.

Oltre alla preparazione dei campioni, i nuovi metodi di etichettatura facilitano la visualizzazione di strutture specifiche nei tessuti vivi. Terzi et al.11 hanno riportato un biosensore specifico per H2O2 geneticamente codificato, roGFP2-Orp1, per l'imaging dei livelli intracellulari di H2O2 da neuroni di pesce zebra allevati e larve intere durante lo sviluppo. Un importante vantaggio di questo biosensore H2O2 geneticamente codificato è stato il miglioramento della risoluzione temporale e spaziale del rilevamento di H2O2 . Un altro studio di Mutlu et al.12 ha descritto la microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS), un metodo di imaging chimico senza marcatura per il rilevamento rapido e quantitativo di lipidi in cellule vive con una risoluzione subcellulare. Sia l'H2O2 che i lipidi si perdono facilmente durante la fissazione del campione. Lo sviluppo di metodi di marcatura o imaging nei tessuti vivi non solo ha aggirato questa sfida, ma ha anche conservato le informazioni spaziali e temporali di queste strutture nei processi biologici.

Infine, la luce può essere utilizzata anche per l'ablazione cellulare. Boutillon et al.13 hanno mostrato un metodo per ablare volumi profondi e spazialmente ben definiti nel pesce zebra utilizzando un microscopio a due fotoni. Rispetto alle ablazioni cellulari basate su laser ultravioletti, il laser a due fotoni ha migliorato la risoluzione assiale e la penetrazione dei tessuti. Questo protocollo ha fornito una strategia di perturbazione per studiare l'interazione cellula-cellula durante lo sviluppo.

Il progresso delle tecnologie microscopiche ci ha permesso di comprendere molti processi di sviluppo in quattro dimensioni. I protocolli di questa raccolta aiuteranno un maggior numero di scienziati a superare la barriera tecnica dell'imaging dal vivo in diversi sistemi biologici. Prevediamo che in futuro verranno sviluppati altri metodi che facilitino l'imaging dal vivo.

Disclosures

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L'autore non ha nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Questo numero di JoVE Method Collection è stato finanziato da NIH 1K99DC01883001. Ringrazio il mio mentore post-dottorato Liqun Luo, i miei collaboratori Eric Betzig e Tian-Ming Fu per il forte supporto nello sviluppo del mio interesse per l'imaging time-lapse durante il mio progetto post-dottorato. Ringrazio anche la School of Brain Science and Brain Medicine dell'Università di Zhejiang per avermi reclutato e per avermi supportato a continuare lo studio dell'imaging time-lapse nel mio laboratorio.

References

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  1. Rieger, S., Wang, F., Sagasti, A. Time-lapse imaging of neural development: zebrafish lead the way into the fourth dimension. Genesis. 49 (7), 534-545 (2011).
  2. Wong, C., Chen, A. A., Behr, B., Shen, S. Time-lapse microscopy and image analysis in basic and clinical embryo development research. Reproductive Biomedicine Online. 26 (2), 120-129 (2013).
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  5. Svensson, C. M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A. 93 (3), 357-370 (2018).
  6. Christen, P., Muller, R. In vivo visualisation and quantification of bone resorption and bone formation from time-lapse imaging. Current Osteoporosis Reports. 15 (4), 311-317 (2017).
  7. Januschke, J., Loyer, N. Applications of immobilization of Drosophila tissues with fibrin clots for live imaging. Journal of Visualized Experiments. (166), e61954(2020).
  8. Li, T., Luo, L. An explant system for time-lapse imaging studies of olfactory circuit assembly in Drosophila. Journal of Visualized Experiments. (176), e62983(2021).
  9. Schramm, P., Hetsch, F., Meier, J. C., Koster, R. W. In vivo imaging of fully active brain tissue in awake Zebrafish larvae and juveniles by skull and skin removal. Journal of Visualized Experiments. (168), e62166(2021).
  10. Ratke, J., Kramer, F., Strobl, F. Simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61713(2020).
  11. Terzi, A., Alam, S. M. S., Suter, D. M. ROS live cell imaging during neuronal development. Journal of Visualized Experiments. (168), e62165(2021).
  12. Mutlu, A. S., Chen, T., Deng, D., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid storage dynamics in Caenorhabditis elegans using stimulated Raman scattering microscopy. Journal of Visualized Experiments. (171), e61870(2021).
  13. Boutillon, A., Escot, S., David, N. B. Deep and spatially controlled volume ablations using a two-photon microscope in the Zebrafish gastrula. Journal of Visualized Experiments. (173), e62815(2021).

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