Articolo metodologico

Utilizzo di C. elegans per monitorare gli squilibri della proteostasi

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DOI:

10.3791/64643

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24 agosto 2022

 , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

In questo articolo

Abstract

La rete di proteostasi è un sistema di controllo della qualità delle proteine cellulari che garantisce la funzionalità del proteoma, promuovendo la salute cellulare e dell'organismo. Con l'età, la sua fedeltà diminuisce, portando a un aumento della vulnerabilità del proteoma allo stress e, infine, a malattie come i disturbi neurodegenerativi e il cancro. Per evidenziare la ricerca su questa rete conservata evolutivamente, il Journal of Visualized Experiments (JoVE) presenta una raccolta di metodi di ricercatori che utilizzano C. elegans per monitorare gli squilibri della proteostasi. Questo editoriale fornisce una breve panoramica di questi diversi approcci sperimentali per comprendere la rete di proteostasi a livello cellulare, tissutale e dell'organismo.

ARTICOLI DISCUSSI:

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Metodi standardizzati per misurare l'induzione della risposta allo shock termico in Caenorhabditis elegans. Giornale degli esperimenti visualizzati. (161), DOI:10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. et al. RT-PCR quantitativa ad alto rendimento in campioni singoli e sfusi di C. elegans utilizzando la tecnologia nanofluidica. Giornale degli esperimenti visualizzati. (159), DOI:10.3791/61132 (2020).

Bar-Ziv, R. et al. Misurazioni delle risposte fisiologiche allo stress in C. Elegans. Giornale degli esperimenti visualizzati. (159), DOI:10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align e Worm_CP, due pipeline open-source per il raddrizzamento e la quantificazione dei dati delle immagini di fluorescenza ottenuti da Caenorhabditis elegans. Giornale degli esperimenti visualizzati. (159), DOI:10.3791/61136 (2020).

Lazaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Quantificazione del declino proteostatico tessuto-specifico in Caenorhabditis elegans. Giornale degli esperimenti visualizzati. (175), DOI:10.3791/61100 (2021).

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Utilizzo di Caenorhabditis elegans per lo screening delle interazioni chaperone tessuto-specifiche. Giornale degli esperimenti visualizzati. (160), DOI:10.3791/61140 (2020).

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Strumenti RNAi tessuto-specifici per identificare i componenti per la segnalazione dello stress sistemico. Giornale degli esperimenti visualizzati. (159), DOI:10.3791/61357 (2020).

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. Quantificazione in vivo del turnover proteico nell'invecchiamento di C. elegans utilizzando dendra2 fotoconvertibile. Giornale degli esperimenti visualizzati. (160), DOI:10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Caratterizzazione delle strutture amiloidi nell'invecchiamento di C. elegans utilizzando l'imaging del tempo di vita della fluorescenza. Giornale degli esperimenti visualizzati. (157), DOI:10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Misurazione della tossicità del peptide RAN in C. elegans. Giornale degli esperimenti visualizzati. (158), DOI:10.3791/61024 (2020).

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Approcci quantitativi per il punteggio dell'aggregato neuronale in vivo e dell'estrusione di organelli in grandi vescicole esofere in C. elegans. Giornale degli esperimenti visualizzati. (163), DOI:10.3791/61368 (2020).

Editoriale

L'omeostasi proteica, o proteostasi, è fondamentale per la salute cellulare e dell'organismo 1,2. I processi cellulari conservati cooperano per mantenere un proteoma correttamente ripiegato influenzando la sintesi, il ripiegamento e la clearance delle proteine 3,4. Le perturbazioni della proteostasi sono state collegate a malattie neurodegenerative e tumori legati all'età 5,6. Sulla base dell'elevato livello di conservazione, organismi modello come il nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) sono stati determinanti per comprendere il ruolo della proteostasi nella salute e nella malattia umana 7,8. C. elegans possiede molte caratteristiche che lo rendono un modello sperimentale ideale, tra cui il suo breve ciclo di vita, la cuticola trasparente e la facilità di manipolazioni chimiche e genetiche9. Questa raccolta di metodi fornisce protocolli dettagliati per monitorare gli squilibri della proteostasi a livello molecolare, cellulare e dell'organismo in C. elegans.

Le cellule rispondono alle interruzioni della proteostasi attivando una varietà di risposte allo stress, tra cui la risposta allo shock termico (HSR), la risposta proteica dispiegata (UPR) e la risposta allo stress ossidativo (OxSR) per riaggiustare il proteoma cellulare10. Per migliorare la riproducibilità sul campo, Golden e colleghi descrivono pratiche standardizzate per l'induzione robusta di HSR11. La RT-qPCR è un metodo sensibile e ampiamente utilizzato per analizzare l'espressione genica quantificando l'mRNA e questo test può essere utilizzato per misurare i livelli di mRNA cellulare di vari geni inducibili da shock termico11. Per estendere questo approccio all'analisi su larga scala e ad alto rendimento, Chauve et al.12 descrivono un nuovo adattamento per la preparazione del cDNA, accoppiato a una piattaforma RT-qPCR nanofluidica robusta e altamente sensibile. Misurazioni precise dell'espressione genica possono essere eseguite su singoli vermi o campioni di massa12. I bersagli raccomandati dei geni di risposta allo stress insieme alle coppie di primer per misurare la sovraregolazione trascrizionale dei geni di risposta allo stress sono elencati nei corrispondenti protocolli12,13.

Una limitazione dell'utilizzo della RT-qPCR per valutare l'attivazione delle risposte allo stress è che può essere costosa, tecnicamente difficile e richiede l'uso di apparecchiature specializzate. Pertanto, i ceppi reporter trascrizionali pathway-specific che esprimono una proteina fluorescente sotto un promotore inducibile dallo stress (ad esempio, hsp-16.2p::gfp per il monitoraggio dell'HSR) sono spesso impiegati per valutare le risposte cellulari allo stress11. Utilizzando un semplice flusso di lavoro open source basato sulle Fiji denominato Worm-align abbinato alla pipeline CellProfiler Worm_CP, Okkenhaug e colleghidelineano 14 passaggi per quantificare rapidamente la fluorescenza dei singoli vermi. Inoltre, Bar-Ziv et al.13 descrivono un metodo ad alto rendimento che utilizza un citometro a flusso di particelle di grandi dimensioni che consente di catturare l'intensità, le dimensioni e la distribuzione spaziale (2D) della fluorescenza per migliaia di animali. Vengono fornite informazioni sui reporter trascrizionali per valutare l'attivazione delle risposte allo stress cellulare insieme alle impostazioni consigliate per la microscopia a fluorescenza e la quantificazione utilizzando un biosorter a verme13. È importante sottolineare che questi reporter possono essere abbinati a specifici saggi di sopravvivenza allo stress fisiologico che monitorano la salute di un animale seguendo uno specifico regime di stress11,13. Sebbene i reporter fluorescenti abbiano il vantaggio di rivelare differenze tessuto-specifiche, possono rilevare l'induzione solo al di sopra di una certa soglia e la stabilità di alcuni fluorofori, come la GFP, preclude il rilevamento di variazioni dinamiche nell'espressione genica. Inoltre, la maggior parte dei saggi fisiologici richiede molto tempo e quindi ha una scalabilità limitata. Nonostante queste limitazioni, questi metodi consentono una caratterizzazione completa degli effetti cellulari e fisiologici dei fattori di stress interni ed esterni.

Le perturbazioni proteotossiche croniche sono associate al collasso della rete di proteostasi (PN), il meccanismo di controllo della qualità responsabile del mantenimento di un proteoma funzionale 5,6. Il progressivo declino della proteostasi è stato implicato in molte malattie legate all'età. C. elegans è un ottimo sistema modello per esaminare la vulnerabilità di tessuti specifici ai fallimenti della proteostasi. Lazaro-Pena et al.15 descrivono un approccio per monitorare la funzionalità muscolare o neuronale della parete corporea durante l'invecchiamento del verme. Questo approccio può essere adattato per l'analisi genetica ad alto rendimento o lo screening dei farmaci15. La sfida principale è capire come funzionano le interazioni tra i vari componenti del PN in vivo. Per affrontare questa lacuna, Dror e colleghihanno sviluppato un sistema per raccogliere informazioni specifiche sulle interazioni degli chaperoni molecolari, componenti chiave del PN, in tessuti specifici durante il corso dello sviluppo e dell'invecchiamento. Accoppiando le perturbazioni tessuto-specifiche dell'equilibrio di ripiegamento con mutanti disponibili o ceppi transgenici che consentono il silenziamento tessuto-specifico dei geni bersaglio da parte dell'RNAi, è possibile esaminare la rete chaperone in un dato tessuto. Integrare questa strategia con semplici saggi comportamentali che valutano la funzionalità di specifici tessuti o tipi di cellule può scoprire interazioni biologicamente rilevanti della PN in vivo15,16. È importante riconoscere che gli squilibri della proteostasi in un tessuto o in un tipo di cellula possono avere un impatto sul sistema di controllo della qualità di altri tessuti in modo non autonomo da parte delle cellule. Miles e van-Oosten-Hawle17 descrivono un approccio per identificare i meccanismi e i componenti della PN non autonoma utilizzando approcci RNAi tessuto-specifici accoppiati con una serie di reporter di stress e sensori di proteostasi17. Questa strategia consente di esaminare la capacità di PN in diversi tessuti come risultato di meccanismi di risposta allo stress attivati in modo non autonomo da parte delle cellule.

C. elegans è comunemente usato per modellare le malattie neurodegenerative legate all'età causate da mutazioni di espansione ripetuta della poliglutammina, come la malattia di Huntington18. Un sensore di proteostasi che viene utilizzato molto è un frammento di poliglutammina (polyQ) fuso a una proteina fluorescente che forma focolai in vivo a seconda della lunghezza del polyQ e dell'etàdi 19 anni. Migliorare la riproducibilità tra studi biologici, tra individui e tra laboratori, richiede di definire ciò che viene valutato come focolai. Lazaro-Pena et al.15 descrivono una strategia per misurare con precisione la formazione di focolai di polyQ::YFP all'interno dei neuroni o dei muscoli della parete corporea durante l'invecchiamento. Per monitorare i tassi di turnover della proteina huntingtina mutante incline all'aggregazione che porta un'espansione della poliglutammina, Pigazzini e Kirstein20 descrivono una tecnica non invasiva che richiede l'uso del fluoroforo fotoconvertibile Dendra2. Utilizzando la microscopia confocale e un ceppo di C. elegans che esprime huntingtina mutante fusa con Dendra2, è possibile monitorare e quantificare la degradazione di questa proteina incline all'aggregazione in un organismo che invecchia20. Per quantificare la fibrillizzazione amiloide di proteine inclini all'aggregazione come l'huntingtina mutante, può essere impiegata la microscopia a fluorescenza (FLIM)21. FLIM consente un'analisi non invasiva del processo di aggregazione monitorando il quenching dei fluorofori in prossimità delle strutture amiloidi, riducendo così la durata della fluorescenza21. Il tempo di vita della fluorescenza è correlato negativamente con l'aggregazione della proteina amiloide fusa ed è indipendente dai livelli di espressione del fluoroforo. Questa tecnica consente a un ricercatore di seguire gli effetti dell'invecchiamento e della compromissione della PN sulla propensione all'aggregazione di qualsiasi proteina. Tuttavia, se l'intensità del fluoroforo è bassa, questo può diventare problematico poiché FLIM richiede l'acquisizione di un numero relativamente elevato di fotoni. È quindi necessaria una maggiore potenza del laser di eccitazione, che porta a un fotosbiancamento più rapido e a una curva di decadimento inaffidabile. Inoltre, la tecnica richiede apparecchiature sofisticate e costose in aggiunta ai sistemi di microscopia preesistenti. Un importante approccio standardizzato è incluso per un diverso protocollo che studia la traduzione non AUG-dipendente (RAN) associata alla ripetizione associata all'RNA che contiene espansioni ripetute. Poiché la traduzione RAN non richiede un codone iniziale per determinare il frame di lettura, il numero di possibili peptidi tossici associati alla malattia aumenta. Rudich e colleghi22 forniscono dettagli su come quantificare la tossicità del peptide RAN utilizzando il movimento e la riproduzione di C. elegans.

Gli squilibri nella proteostasi portano al ripiegamento errato delle proteine e all'accumulo di aggregati proteici che sono stati collegati a molteplici malattie neurodegenerative legate all'età 5,6. I ceppi di C. elegans che esprimono varie proteine inclini all'aggregazione fusi a reporter fluorescenti sono stati utilizzati per monitorare gli squilibri della proteostasi in diversi tipi di cellule e tessuti. L'analisi di questi modelli ha portato a una serie di nuove osservazioni; Monica Driscoll e colleghi hanno notato che i neuroni rilasciano aggregati PolyQ e altri detriti cellulari, come gli organelli danneggiati, negli "esofari", scoprendo un ramo precedentemente non riconosciuto della proteostasi neuronale23. Poiché si tratta di un fenomeno nuovo, è fondamentale fornire istruzioni chiare per il monitoraggio della produzione di esoferi per garantire la riproducibilità sul campo. Arnold et al.24 delineano le caratteristiche fisiche degli esoferi di C. elegans, le strategie per la loro rilevazione, i criteri di identificazione e i tempi ottimali per la quantificazione. Inoltre, questo protocollo evidenzia l'attenzione critica necessaria per controllare rigorosamente le condizioni di crescita per eliminare gli stress non intenzionali che possono modulare i livelli di esofero per ottenere una valutazione riproducibile della produzione di esofero.

Questa raccolta fornisce molteplici strategie metodologiche per monitorare gli squilibri della proteostasi a livello molecolare, cellulare e dell'organismo in C. elegans. I fattori di stress, come le proteine della malattia mal ripiegate, possono essere introdotti sperimentalmente in specifici tipi di tessuto, mentre la risposta cellulare e dell'organismo alla proteotossicità viene monitorata nel tempo. Questa raccolta fornisce un kit di strumenti per sondare e monitorare la proteostasi, valutare i sistemi di controllo della qualità che mantengono un proteoma ripiegato e studiare la disregolazione di questi sistemi che portano alla malattia.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo i nostri colleghi per il loro prezioso contributo a questa raccolta di metodi.

Riferimenti

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  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
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  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

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