Quantificazione dei complessi mieloperossidasi-DNA e elastasi-DNA neutrofili da trappole extracellulari di neutrofili utilizzando un ELISA a sandwich modificato

Sommario

Presentiamo un protocollo per una tecnica di saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificata per misurare quantitativamente due componenti dei residui di trappole extracellulari dei neutrofili, i complessi di DNA coniugato a DNA coniugato con mieloperossidasi e DNA coniugato con elastasi neutrofila, derivati da neutrofili attivati.

Abstract

Alcuni stimoli, come i microrganismi, inducono i neutrofili a rilasciare trappole extracellulari per neutrofili (NET), che sono fondamentalmente strutture simili a ragnatele composte da DNA con proteine granulari, come la mieloperossidasi (MPO) e l'elastasi neutrofila (NE), e proteine citoplasmatiche e citoscheletriche. Sebbene l'interesse per i NET sia aumentato di recente, non è disponibile alcun metodo di analisi sensibile e affidabile per la misurazione dei NET in ambito clinico. Questo articolo descrive un saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich modificato per misurare quantitativamente due componenti dei NET circolanti, i complessi MPO-DNA e NE-DNA, che sono componenti specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come prodotti di degradazione dei NET. Il test utilizza anticorpi monoclonali specifici per MPO o NE come anticorpi di cattura e un anticorpo di rilevamento specifico per il DNA. MPO o NE si lega a un sito dell'anticorpo di cattura durante l'incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Questo test mostra una buona linearità e un'elevata precisione tra saggi e intrados. Lo abbiamo usato in 16 pazienti con COVID-19 con sindrome da distress respiratorio acuto e abbiamo scoperto che le concentrazioni plasmatiche di MPO-DNA e NE-DNA erano significativamente più alte rispetto al plasma ottenuto da controlli sani. Questo test di rilevamento è un metodo affidabile, altamente sensibile e utile per studiare le caratteristiche dei NET nel plasma umano e nei surnatanti di coltura.

Introduzione

Questo articolo delinea un metodo per quantificare la formazione di trappole extracellulari neutrofile (NET) nei fluidi biologici utilizzando il saggio di immunoassorbimento enzimatico a sandwich (ELISA) per rilevare complessi di mieloperossidasi (MPO) ed elastasi neutrofila (NE) con DNA ^1,2. I NET sono composti da una spina dorsale di DNA decorata con proteasi antimicrobiche originate da granuli di neutrofili ^3,4. Sia i complessi MPO-DNA che NE-DNA sono componenti importanti e specifici dei NET e vengono rilasciati nello spazio extracellulare come pro....

Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con la Dichiarazione di Helsinki ed è stato approvato dai comitati di revisione istituzionali dell'Università di Medicina di Aichi (2017-H341, 2019-H137). Il consenso informato scritto è stato ottenuto da ciascun partecipante.

1. Preparazione dei reagenti

NOTA: Per eseguire il test ELISA a sandwich, i reagenti vengono preparati come descritto di seguito.

1. Tampone di rivestimento:
   1. Per produrre un tampone carbonato-bicarbonato da 0,1 mol/L, pesare 10,6 g di carbonato di sodio anidro (peso molecolare, 106 g/mol) e 8,4 g di bicarbonato di s....

Risultati

Questo metodo ha utilizzato un ELISA a sandwich con anticorpi monoclonali anti-MPO, anti-NE e anti-DNA per misurare il DNA associato a MPO e NE (Figura 1). In questo metodo, i pozzetti di una piastra per microtitolazione sono stati rivestiti con un anticorpo monoclonale specifico per MPO o NE specifico per catturare MPO associato al DNA e NE associato al DNA, nonché MPO e NE non associati al DNA. Per calcolare il coefficiente di variabilità (CV) intra-test, sono state eseguite misurazioni du.......

Discussione

Abbiamo descritto un metodo ELISA a sandwich in cui MPO o NE si legano a un sito dell'anticorpo di cattura durante l'incubazione iniziale di campioni contenenti complessi MPO-DNA o NE-DNA. Dopo il lavaggio, il "sandwich" viene completato incubando i campioni con un anticorpo monoclonale anti-DNA associato alla perossidasi. Dopo la rimozione dell'anticorpo secondario non legato, il coniugato della perossidasi legata viene rilevato mediante l'aggiunta di un substrato cromogenico di perossidasi ABTS, che produce un prodotto.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polymorphs in 1 fase	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	l'isolamento dei PMN dal sangue umano.
Piastra per microtitolazione a 96 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	467466
soluzione tampone ABTS	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contiene perborato di sodio, acido citrico e idrogeno fosfato disodico.
Compresse ABTS	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Ogni compressa contiene 5 mg di substrato ABTS e 60 mg di sostanze veicolari.
Copertura adesiva in plastica, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anticorpo anti-MPO	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I Negozio	a 2-8 °C. stabile per 1 anno. La specie ospite è il coniglio.
Anticorpo anti-NE, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Conservare a 2-8 °C. stabile per 1 anno. La specie ospite è il topo.
Albumina sierica bovina	Scienze biomediche	BR-220700081	Albumina da frazione bovina V. Conservare a 2– 8 °C. stabile per 2 anni.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Negozio a -20 gradi C
IgG, coniglio, controllo isotipo	GENETEX, Inc.	GTX35035	Conservare come soluzione concentrata a 2– 8 °C.
IgG1, controllo isotipico del topo, clone Ci4	Merck	MABC002	Conservare come soluzione concentrata a 2– 8 °C.
Provetta per prelievo di sangue con eparina di litio	Becton Dickinson e azienda
Miscelatore di micropiastre	Come una società	NS-P
Lettore di micropiastre	Dispositivi molecolari	SpectraMax 190	Qualsiasi lettore di piastre per micropiastre in grado di leggere lunghezze d'onda da 405 490 nm possono essere utilizzati.
Applicazione per lettore di micropiastre	Dispositivi molecolari	SoftMax pro
Anticorpo anti-DNA coniugato con perossidasi, Rilevamento della morte cellulare ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottiglia 2. Negozio su 2– 8 °C. stabile per 1 anno.
Phorbol 12-miristate 13-acetato	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Attivazione di PMN dal sangue umano.
Soluzione tamponata con fosfato	Takara Bio	T9181	Conservare a temperatura ambiente. Stalla per 6 mesi.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodio azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Conservare a temperatura ambiente.
t-Ottilfenossipolietossietanolo, Polietilenglicole terz-ottilfeniletere	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Conservare a temperatura ambiente.