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L'osso è un tessuto dinamico che subisce un continuo rimodellamento, che coinvolge osteoclasti che riassorbono l'osso e osteoblasti che formano l'osso. È importante sottolineare che questi processi sono accoppiati con altre cellule che risiedono nello spazio del midollo osseo, come le cellule ematopoietiche e gli adipociti del midollo osseo. Una disconnessione nel turnover osseo provoca fragilità scheletrica e un conseguente aumento delle fratture1. Recenti studi hanno dimostrato l'importanza dei substrati metabolici e del metabolismo energetico per regolare sia la formazione dell'osso che il riassorbimento osseo 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15, 16,17. Il targeting delle vie metaboliche è utilizzato per trattare vari tipi di cancro e potrebbe essere uno strumento provocatorio che potrebbe essere applicato per combattere varie condizioni che portano a un aumento dell'incidenza di fratture18. Per questo motivo, è importante avere una comprensione completa del metabolismo cellulare in tutte le cellule ossee. Sfortunatamente, studiare le cellule ossee nel loro ambiente nativo è difficile a causa della loro localizzazione all'interno del tessuto mineralizzato. Rispetto ai tessuti non mineralizzati, i passaggi necessari per elaborare l'osso rendono difficili gli studi molecolari e meccanicistici del loro stato metabolico. In quanto tale, questa raccolta mira a evidenziare le tecniche consolidate utilizzate per monitorare le vie metaboliche nelle cellule isolate dalla loro nicchia scheletrica.
"Osteoenergetica" descrive i processi metabolici e il potenziale bioenergetico degli osteoblasti e rimane un'area attiva di interesse scientifico e di indagine. Prima della capacità delle cellule di produrre e utilizzare ATP, tuttavia, devono essere acquisiti substrati energetici. Tre articoli all'interno di questa raccolta evidenziano i metodi utilizzati per monitorare i destini specifici del substrato all'interno delle cellule ossee. In primo luogo, Shen e Karner19 descrivono le tecniche per valutare il consumo di aminoacidi in cellule in coltura in vitro o ossa isolate ex vivo. Nel sistema in vitro, le cellule ST2 in coltura vengono incubate con L-[3,4-3 H]-glutammina per un tempo predeterminato e l'assorbimento di glutammina viene quantificato utilizzando un contatore a scintillazione. Allo stesso modo, nel sistema ex vivo, le ossa prelevate da topi neonati vengono incubate con amminoacidi radiomarcati e l'assorbimento di aminoacidi viene stimato utilizzando un contatore a scintillazione. Questi metodi consentono una valutazione rapida e sensibile dell'assorbimento degli amminoacidi nelle cellule ossee o nelle ossa isolate. È importante sottolineare che questi metodi sono facilmente modificabili per valutare diversi amminoacidi o altri substrati energetici e per testare varie questioni scientifiche.
Oltre agli aminoacidi, il glucosio e gli acidi grassi a catena lunga (LCFA) rappresentano un denso apporto di energia cellulare o ATP. In questa veste, gli LCFA entrano nei mitocondri attraverso la carnitina palmitoil transferasi (CPTI/II), dove vengono prontamente ossidati tramite β-ossidazione, e possono successivamente entrare nell'acido tricarbossilico (TCA) o nel ciclo di fosforilazione ossidativa per produrre ATP. Questa serie di reazioni chimiche alla fine porta al rilascio di carbonio sotto forma di anidride carbonica gassosa (CO2), che è difficile da quantificare. Song et al. e Kim et al. descrivono sapientemente due metodi correlati per misurare i metaboliti generati nel processo di ossidazione20,21. Entrambe le tecniche utilizzano un substrato di carbonio marcato con 14C e carta da filtro come strumento di "intrappolamento" per quantificare il 14CO2 rilasciato. Tuttavia, ogni metodo è altrettanto importante in quanto descrive recipienti di coltura e tecniche di normalizzazione dei dati unici. Inoltre, Song et al.20 descrivono come calcolare l'ossidazione del substrato, mentre Kim et al.21 includono un metodo aggiuntivo per misurare i metaboliti solubili in acido.
Questi studi di tracciamento consentono allo sperimentatore di determinare il destino metabolico di vari substrati. Come complemento, Jayapalan et al.22 utilizzano analisi del flusso metabolico per monitorare i processi metabolici, tra cui la glicolisi e la fosforilazione ossidativa attraverso la respirazione mitocondriale. Questa apparecchiatura misura fondamentalmente l'ossigeno e il pH in colture cellulari vive in tempo reale. Pertanto, coltivando le cellule stromali primarie del midollo osseo (BMSC) attraverso la differenziazione degli osteoblasti, è possibile condurre una varietà di esperimenti monitorando le vie metaboliche23. Questa tecnica può essere eseguita con quattro diverse iniezioni, il che consente ai ricercatori di adattare gli esperimenti a specifiche domande scientifiche, pur essendo in grado di seguire protocolli standardizzati, tra cui il tasso di ATP, l'utilizzo di carburante/substrato, la respirazione mitocondriale e i saggi del tasso glicolitico. Infine, poiché molti di questi esperimenti sono di natura meccanicistica, è imperativo mantenere una popolazione cellulare omogenea senza contaminazione da parte di altri tipi di cellule. I sistemi di coltura cellulare in vitro utilizzati per monitorare i processi metabolici delle cellule ossee hanno molte limitazioni intrinseche. Guo e Wu24 offrono un'eccellente panoramica delle limitazioni introdotte durante le colture BMSC standard e contribuiscono con un metodo dettagliato per arricchire le popolazioni di cellule stromali e minimizzare la contaminazione ematopoietica utilizzando l'ipossia.
In sintesi, questa raccolta dimostra le tecniche per monitorare l'utilizzo del substrato e la capacità bioenergetica in una varietà di modelli scheletrici sia in vitro che ex vivo. La maggior parte di questi metodi vengono eseguiti utilizzando sistemi di coltura cellulare e, quindi, presentano limitazioni dovute all'ambiente artificiale. Se è vero che le cellule primarie consentono un sistema più fisiologico, queste cellule sono spesso coltivate ad alto contenuto di ossigeno in terreni contenenti concentrazioni eccessive di substrati metabolici e, talvolta, anche con popolazioni cellulari contaminanti. Pertanto, è fondamentale che questi esperimenti meccanicistici siano supportati da ulteriori dati in vivo. Ciononostante, questa entusiasmante area di ricerca si è già dimostrata utile. A questo proposito, continuare a caratterizzare i processi metabolici "normali" rispetto a quelli patologici è una nicchia scientifica promettente. Inoltre, lo studio dell'osteoenergetica e del metabolismo per capire come, perché e quando le cellule ossee utilizzano vari substrati e le implicazioni che questi hanno sulla salute generale delle ossa apre un'ampia area per gli obiettivi terapeutici. A tal fine, è stato riscontrato che i bifosfonati anti-riassorbimento di prima generazione (cioè etidronato e clodronato) usati per trattare l'osteoporosi hanno un impatto sull'energia degli osteoclasti. Questi farmaci ampiamente prescritti rappresentano un perfetto esempio di come le vie metaboliche possano essere sfruttate per avere un impatto sulla salute generale delle ossa e migliorare la qualità della vita di un paziente. Oltre ai trattamenti antiriassorbitivi, esistono due terapie anaboliche approvate dalla FDA, Teriparatide e Romosozumab, che attivano rispettivamente le vie PTH e WNT. Sia il PTH che il WNT stimolano l'assorbimento e il metabolismo della glutammina negli osteoblasti 6,11,25,26. Evidenziando le implicazioni terapeutiche di ciò, l'inibizione dell'attività del metabolismo della glutammina riduce farmacologicamente o geneticamente la formazione ossea in risposta ai trattamenti WNT o anabolizzanti PTH 6,11. Pertanto, è necessario continuare la ricerca per studiare il metabolismo e la bioenergetica nelle cellule ossee. Le tecniche descritte in questa raccolta forniscono una base per affrontare varie questioni scientifiche relative all'osteoenergetica e al metabolismo nelle cellule ossee.