Articolo metodologico

Imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare utilizzando il calcofluor nel muschio Physcomitrium patens

DOI:

10.3791/64651

⸱

10 febbraio 2023

 , 
1Department of Biology, University of Louisville

In questo articolo

Sommario

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Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per visualizzare le dinamiche della parete cellulare 3D del tessuto di muschio vivente, consentendo la visualizzazione del distacco delle pareti cellulari nei mutanti ggb e l'ispessimento dei modelli di parete cellulare nel tipo selvatico durante lo sviluppo per un lungo periodo.

Abstract

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L'imaging time-lapse con microscopia a fluorescenza consente l'osservazione dei cambiamenti dinamici di crescita e sviluppo a livello cellulare e subcellulare. In generale, per osservazioni su un lungo periodo, la tecnica richiede la trasformazione di una proteina fluorescente; Tuttavia, per la maggior parte dei sistemi, la trasformazione genetica richiede tempo o tecnicamente non è disponibile. Questo manoscritto presenta un protocollo per l'imaging time-lapse 3D della dinamica della parete cellulare per un periodo di 3 giorni utilizzando colorante calcofluor (che colora la cellulosa nella parete cellulare della pianta), sviluppato nel muschio Physcomitrium patens. Il segnale del colorante calcofluor dalla parete cellulare è stabile e può durare per 1 settimana senza evidente decadimento. Utilizzando questo metodo, è stato dimostrato che il distacco delle cellule nei mutanti ggb (in cui la subunità beta della proteina geranilgeraniltransferasi-I viene eliminata) è causato dall'espansione cellulare non regolata e da difetti di integrità della parete cellulare. Inoltre, i modelli di colorazione del calcofluor cambiano nel tempo; Le regioni meno intensamente colorate sono correlate con i futuri siti di espansione/ramificazione cellulare nel tipo selvatico. Questo metodo può essere applicato a molti altri sistemi che contengono pareti cellulari e che possono essere colorati dal calcofluor.

Introduzione

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Le pareti cellulari delle piante subiscono cambiamenti dinamici durante l'espansione e lo sviluppo cellulare 1,2,3. Il mantenimento dell'integrità della parete cellulare è fondamentale per l'adesione delle cellule vegetali durante la crescita e lo sviluppo, nonché per la risposta ai segnali ambientali. Sebbene visualizzare le dinamiche della parete cellulare delle cellule viventi per un lungo periodo di tempo sia fondamentale per capire come viene mantenuta l'adesione cellulare durante lo sviluppo e l'adattamento ai cambiamenti ambientali, i metodi attuali per osservare diret....

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Protocollo

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NOTA: vedere la Tabella dei materiali per l'elenco dei materiali e delle apparecchiature e la Tabella 1 per l'elenco delle soluzioni da utilizzare in questo protocollo.

1. Preparazione di piante per piatti con fondo di vetro

  1. Coltivare il tessuto protonemico di muschio in mezzo di agar BCDAT in una capsula di Petri di 13 cm sotto luce bianca costante (~50 μmol m-2 s-1) per 7 giorni a 25 °C nella camera di crescita.
  2. Filtrare-sterilizzare il calcofluor bianco e conservare a 4 °C fino all'uso. Il reagente è stabile per diversi mesi.
  3. Disperdere....

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Risultati

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Questo metodo consente l'osservazione della dinamica della parete cellulare durante lo sviluppo in mutanti wild type e ggb (Figura 1). I risultati hanno mostrato che le regioni con meno ispessimento della parete cellulare sono correlate con i siti di espansione / ramificazione cellulare, consentendo la previsione di siti di espansione / ramificazione nel tipo selvatico (Figura 1A). La superficie delle pareti cellulari nei mutanti ggb è stata la.......

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Discussione

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La ricostruzione 3D time-lapse, o imaging 4-D, è un potente strumento per osservare le dinamiche della morfologia cellulare durante i processi di sviluppo. In questo protocollo, mescolando il bianco calcofluor nel mezzo, la dinamica della morfologia cellulare 3D può essere osservata nel muschio P. patens. Usando questo metodo, abbiamo osservato che la superficie delle pareti cellulari nei mutanti ggb viene fatta a pezzi durante lo sviluppo3. Inoltre, il ridotto ispessimento delle.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti o finanziari.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano la dottoressa Soucy Patricia e Betty Nunn dell'Università di Louisville per l'assistenza con il microscopio confocale. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation (1456884 to M.P.R.) e da un National Science Foundation Cooperative Agreement (1849213 to M.P.R.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Filtro luce in plastica rossa di 3 mm di spessore  Mitsubishi  No.102
Piatto base in vetro diametro 27 mm Iwaki3930-035
Agar  SigmaA6924
Calcofluor bianco   Sigma18909-100ML-FCalcofluor bianco M2R, 1 g/L e blu di Evans, 0,5 g/L
Microscopio confocale.Nikon A1

NIS element software; file .nd2 in NIS-elements Viewer, scaricabile da https://www.microscope.healthcare.nikon.
com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer

Microscopio a fluorescenza Nikon TE200 Dotato di una fotocamera DS-U3;
Gomma di gellano Nacali Tesque12389-96
SANYOSanyo MLR-350H
Siringa sterilizzata 0,22 μ m filtroMilliporeSLGV033RS
Camere di crescita delle piante

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
  2. Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant d....

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Time Lapse ImagingCell Wall DynamicsCalcofluor StainingPhyscomitrium PatensFluorescence Microscopy3D ImagingCell ExpansionCell Wall IntegrityPlant Cell WallProtonemata Separation

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