Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET) è una tecnica di imaging per rilevare le interazioni proteiche nelle cellule viventi. Qui viene presentato un protocollo FRET per studiare l'associazione di enzimi modificanti gli istoni con fattori di trascrizione che li reclutano nei promotori bersaglio per la regolazione epigenetica dell'espressione genica nei tessuti vegetali.
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Articolo metodologico
Studio delle interazioni tra enzimi modificanti gli istoni e fattori di trascrizione in vivo mediante trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
La regolazione epigenetica dell'espressione genica è comunemente influenzata dagli enzimi modificanti gli istoni (HME) che generano segni istonici eterocromatici o eucromatici rispettivamente per la repressione o l'attivazione trascrizionale. Gli HME vengono reclutati nella loro cromatina target dai fattori di trascrizione (TF). Pertanto, rilevare e caratterizzare le interazioni dirette tra HME e TF è fondamentale per comprendere meglio la loro funzione e specificità. Questi studi sarebbero biologicamente più rilevanti se eseguiti in vivo all'interno di tessuti viventi. Qui, viene descritto un protocollo per visualizzare le interazioni nelle foglie delle piante tra una deubiquitinasi istonica vegetale e un fattore di trascrizione vegetale utilizzando il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET), che consente la rilevazione di complessi tra molecole proteiche che si trovano entro <10 nm l'una dall'altra. Vengono presentate due varianti della tecnica FRET: SE-FRET (emissione sensibilizzata) e AB-FRET (sbiancamento dell'accettore), in cui l'energia viene trasferita in modo non radiativo dal donatore all'accettore o emessa radiativamente dal donatore dopo il fotosbiancamento dell'accettore. Entrambi gli approcci SE-FRET e AB-FRET possono essere adattati facilmente per scoprire altre interazioni tra altre proteine nelle piante.
Introduzione
Le deubiquitinasi istoniche vegetali svolgono un ruolo importante nel controllo dell'espressione genica mediante modificazione post-traduzionale degli istoni, in particolare cancellando i loro segni di monoubiquitilazione1. Finora, OTLD1 è una delle poche deubiquitinasi istoniche vegetali caratterizzate a livello molecolare in Arabidopsis 2,3. OTLD1 rimuove i gruppi monoubiquitina dalle molecole istoniche H2B, promuovendo così la rimozione o l'aggiunta di acetilazione eucromatica e modificazioni di metilazione degli istoni H3 nel gene bersagliocromatina 4,5<....
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Protocollo
Per il presente studio sono stati utilizzati Nicotiana benthamiana, Agrobacterium tumefaciens ceppo EHA105 o GV3101.
1. Costruzione vettoriale FRET
- Selezionare i tag fluorescenti per la coppia FRET donatore/accettore.
- Utilizzare EGFP da pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N115,28 (vedere la tabella dei materiali) per generare il vettore donatore.
- Utilizzare mRFP da pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 (vedere Tabella dei materiali) per generare il vettore accettore.
- Generare i costrutti FRET d....
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Risultati
La Figura 2 illustra i risultati tipici di un esperimento SE-FRET, in cui i nuclei cellulari sono stati registrati simultaneamente in tre canali (cioè GFP del donatore, accettore mRFP e SE-FRET). Questi dati sono stati utilizzati per generare immagini di efficienza SE-FRET codificate in una scala pseudo-cromatica. Su questa scala, il passaggio dal blu al rosso corrisponde ad un aumento dell'efficienza FRET, una misura della vicinanza proteina-proteina dallo 0% al 100%. In questo esperimento .......
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Discussione
Questo protocollo FRET è semplice e facile da riprodurre; Richiede anche un investimento minimo di fornitura e utilizza attrezzature standard per molti laboratori moderni. Nello specifico, cinque caratteristiche tecniche principali contraddistinguono la versatilità di questa procedura. In primo luogo, i costrutti FRET sono generati utilizzando la ricombinazione sito-specifica, un approccio di clonazione che è facile da usare, produce risultati accurati e consente di risparmiare tempo rispetto alla tradizionale clonazione.......
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Dichiarazioni
Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il lavoro nel laboratorio di V.C. è supportato da sovvenzioni da NIH (R35GM144059 e R01GM50224), NSF (MCB1913165 e IOS1758046) e BARD (IS-5276-20) a V.C.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acetosiringone (3′,5′-Dimetossi-4′-idrossiacetofenone) | Sigma-Aldrich | #D134406-1G | |
| Bacto Agar | BD Biosciences | #214010 | |
| Bacto trypton | BD Biosciences | #211705 | |
| Estratto di lievito Bacto | BD Biosciences | #212750 | |
| Microscopio a scansione laser confocale (CLSM) | Zeiss | LSM900 | Qualsiasi CLSM con capacità simili è adatto |
| EHA105 | VWR | 104013-310 | Usiamo lo stock nella collezione di stock del laboratorio batterico Citovsky |
| Gateway BP Clonase II | Invitrogen | #11789100 | |
| Gateway LR Clonase II | Invitrogen | #11791020 | |
| GV3101 | VWR | 104013-296 | Utilizziamo il materiale nella collezione di materiali da laboratorio batterico Citovsky |
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| MES | Sigma-Aldrich | #69889-10G | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | #63068-250G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | #S5886-500G | |
| Nicotiana benthamiana semi | Erboristeria Pty | RA4 o LAB | Utilizziamo il materiale nella collezione di stock Citovsky seed lab |
| pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
| pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 | N/A | Rif. 15, 28 | |
| pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-C1 | N/A | Generato in base al costrutto pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-C1 (vedi rif. 15, 28) | |
| pPZP-RCS2A-DEST-mRFP-N1 | N/A | Generato in base al costrutto pPZP-RCS2A-DEST-EGFP-N1 | |
| Rifampicina | Sigma-Aldrich | #R7382-5G | |
| Spectinomycin | Sigma-Aldrich | #S4014-5G | |
| Siringhe senza aghi | BD | 309659 | |
| Zen software per l'imaging CLSM | Zeiss | ZEN 3.0 | Il software deve essere compatibile con il CLSM utilizzato |
Riferimenti
- March, E., Farrona, S. Plant deubiquitinases and their role in the control of gene expression through modification of histones. Frontiers in Plant Science. 8, 2274(2018).
- Isono, E., Nagel, M. K. Deubiquitylating enzymes a....
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Ristampe e permessi
