Il sistema Zebrafish Tol2: un approccio di transgenesi modulare e flessibile basato su gateway

Sommario

Questo lavoro descrive un protocollo per il sistema modulare di transgenesi Tol2, un metodo di clonazione basato su gateway per creare e iniettare costrutti transgenici in embrioni di zebrafish.

Abstract

I disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD) sono caratterizzati da un insieme altamente variabile di difetti strutturali e disturbi cognitivi che insorgono a causa dell'esposizione prenatale all'etanolo. A causa della complessa patologia della FASD, i modelli animali si sono dimostrati fondamentali per la nostra attuale comprensione dei difetti di sviluppo indotti dall'etanolo. I pesci zebra hanno dimostrato di essere un potente modello per esaminare i difetti di sviluppo indotti dall'etanolo a causa dell'alto grado di conservazione sia della genetica che dello sviluppo tra zebrafish e umani. Come sistema modello, i pesci zebra possiedono molti attributi che li rendono ideali per gli studi sullo sviluppo, tra cui un gran numero di embrioni fecondati esternamente che sono geneticamente trattabili e traslucidi. Ciò consente ai ricercatori di controllare con precisione i tempi e il dosaggio dell'esposizione all'etanolo in più contesti genetici. Un importante strumento genetico disponibile nel pesce zebra è la transgenesi. Tuttavia, generare costrutti transgenici e stabilire linee transgeniche può essere complesso e difficile. Per affrontare questo problema, i ricercatori del pesce zebra hanno stabilito il sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposoni. Questo sistema modulare utilizza un approccio di clonazione gateway multisito per l'assemblaggio rapido di costrutti transgenici completi basati su trasposoni Tol2. Qui, descriviamo la cassetta degli attrezzi flessibile del sistema Tol2 e un protocollo per generare costrutti transgenici pronti per la transgenesi del pesce zebra e il loro uso negli studi sull'etanolo.

Introduzione

L'esposizione prenatale all'etanolo dà origine a un continuum di deficit strutturali e disturbi cognitivi definiti disturbi dello spettro alcolico fetale (FASD)1,2,3,4. Le complesse relazioni tra molteplici fattori rendono difficile lo studio e la comprensione dell'eziologia della FASD negli esseri umani. Per risolvere questa sfida, è stata utilizzata un'ampia varietà di modelli animali. Gli strumenti biologici e sperimentali disponibili in questi modelli si sono dimostrati cruciali nello sviluppo della nostra comprensione delle basi meccanicistiche della teratogenicità dell'etanolo e i risultati di questi sistemi modello sono stati notevolmente coerenti con ciò che si trova negli studi sull'etanolo umano ^5,6. Tra questi, i pesci zebra sono emersi come un potente modello per studiare la teratogenesi dell'etanolo^7,8, in parte a causa della loro fecondazione esterna, alta fecondità^, trattabilità genetica ed embrioni traslucidi. Questi punti di forza si combinano per rendere il pesce zebra ideale per studi di imaging live in tempo reale di FASD utilizzando linee di zebrafish transgeniche.

I pesci zebra transgenici sono stati ampiamente utilizzati per studiare molteplici aspetti dello sviluppo embrionale⁹. Tuttavia, la creazione di costrutti transgenici e successive linee transgeniche può essere estremamente difficile. Un transgene standard richiede un elemento promotore attivo per guidare il transgene e un segnale o "coda" poli A, il tutto in un vettore batterico stabile per il mantenimento generale del vettore. La generazione tradizionale di un costrutto transgenico multicomponente richiede più fasi di sub-clonazione che richiedono molto tempo¹⁰. Gli approcci basati sulla PCR, come l'assemblaggio Gibson, possono aggirare alcuni dei problemi associati alla subclonazione. Tuttavia, primer unici devono essere progettati e testati per la generazione di ogni costrutto transgenico unico¹⁰. Oltre alla costruzione del transgene, anche l'integrazione genomica, la trasmissione della linea germinale e lo screening per una corretta integrazione transgenica sono stati difficili. Qui, descriviamo un protocollo per l'utilizzo del sistema di transgenesi Tol2 basato su trasposone (Tol2Kit)^10,11. Questo sistema modulare utilizza la clonazione multisito di gateway per generare rapidamente più costrutti transgenici da una libreria in continua espansione di vettori "ingresso" e "destinazione". Gli elementi trasponibili Tol2 integrati aumentano notevolmente il tasso di transgenesi, consentendo la rapida costruzione e integrazione genomica di più transgeni. Utilizzando questo sistema, mostriamo come la generazione di una linea di zebrafish transgenico endoderma può essere utilizzata per studiare i difetti strutturali tessuto-specifici alla base della FASD. In definitiva, in questo protocollo, dimostriamo che la configurazione modulare e la costruzione di costrutti transgenici aiuteranno notevolmente la ricerca FASD basata sul pesce zebra.

Protocollo

Tutti gli embrioni di zebrafish utilizzati in questa procedura sono stati allevati e allevati seguendo i protocolli IACUC stabiliti¹². Questi protocolli sono stati approvati dall'Università di Louisville.

NOTA: In questo studio sono stati utilizzati il ceppo zebrafish wild-type, AB, e la linea mutante doppia bmp4^st72;smad5^b1100 . Tutta l'acqua utilizzata in questa procedura era acqua sterile ad osmosi inversa. Le immagini confocali sono state scattate con un microscopio confocale a scansione laser. Le misurazioni dell'endoderma sono state effettuate utilizzando lo strumento di misurazione in ImageJ. Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando software statistici.

1. Realizzare le soluzioni e i media

1. Mezzi batterici: sciogliere il brodo LB o l'agar secondo le istruzioni del produttore e l'autoclave. Prima di versare il terreno in piastre di Petri da 100 mm, aggiungere ampicillina (50 μg/ml), kanamicina (50 μg/ml) o una combinazione ampicillina/cloramfenicolo (50 μg/mL e 30 μg/mL, rispettivamente).
2. Per ottenere 20 x supporti embrionali, sciogliere quanto segue in 1 L di acqua: 17,5 g di NaCl, 0,75 g di KCl, 2,9 g di CaCl 2, 0,41 g di K 2 HPO 4, 0,142 g di Na 2 HPO 4 e 4,9 g di MgSO₄·7H ₂O. Filtrare-sterilizzare la soluzione madre utilizzando un sistema di filtrazionesotto vuoto da 0,22 μm, e conservare a 4 °C.
   NOTA: ignorare il precipitato bianco che si forma; Questo non avrà alcun impatto sui media.
3. In 19 L di acqua, sciogliere 1,2 g di NaHCO₃ e aggiungere 1 L del 20x embrione media stock per generare la soluzione di supporto embrionale funzionante e mantenere questa soluzione a 28 °C.
4. Per una soluzione di rosso fenolo al 2%, sciogliere 20 mg di sale sodico rosso fenolo in 1 mL di acqua priva di RNasi e conservare a temperatura ambiente.

2. Stampi per iniezione di embrioni

1. Per preparare la piastra di iniezione dell'agarosio, sciogliere l'agarosio nel mezzo embrionale fino a una concentrazione finale del 3% riscaldando a ebollizione.
2. Versare 50 ml di agarosio in piastre di Petri da 100 mm e, mentre l'agarosio è ancora liquido, posizionare delicatamente lo stampo ad iniezione nell'agarosio per evitare la formazione di bolle sotto lo stampo.
3. Lasciate raffreddare i piatti di agarosio. Una volta che l'agarosio è solido, rimuovere lo stampo per iniezione e conservare a 4 °C fino al momento dell'uso.

3. Pipette a iniezione

1. Tirare capillari da 1,0 mm (OD) contenenti un filamento in aghi utilizzando un estrattore di pipette verticale con il solenoide impostato su 2,5 e l'elemento riscaldante impostato su 14,6.
   NOTA: Qualsiasi estrattore riscaldato funzionerà se tira i capillari in due aghi in modo pulito e uniforme, ma gli aghi per iniezione devono essere tirati entro 1 settimana dall'iniezione degli embrioni di zebrafish per ottenere risultati di iniezione coerenti.
   1. Posizionare il capillare nell'estrattore, stringere il morsetto a ciascuna estremità, quindi attivare l'elemento riscaldante.
   2. Tirare i capillari per creare due aghi per iniezione.
   3. Rimuovere i capillari dall'estrattore e conservarli in una capsula di Petri vuota con una striscia di argilla modellante che funge da portaaghi.

4. Preparazione dell'mRNA transposasi

1. Linearizzare il plasmide Tol2Kit contenente trasposasi con un'endonucleasi di restrizione NotI combinando quanto segue in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml: 10 μL di plasmide di trasposasi (150 ng/μL), 1,5 μL di tampone di reazione endonucleasi di restrizione, 0,3 μL di endonucleasi NotI.
2. Riempire la reazione fino a 20 μL con acqua priva di RNasi, quindi mescolare e digerire a 37 °C durante la notte.
3. Interrompere la digestione della trasposasi aggiungendo 1 μL di 0,5 M EDTA (pH 8,0), 2 μL di 5 M NH₄OAc e 80 μL di 100% EtOH alla reazione di digestione, quindi mescolare e raffreddare a -20 °C durante la notte.
4. Centrifugare la soluzione a 14.000x g per 20 minuti a 4 °C, quindi aspirare il surnatante e risospendere il pellet di DNA in acqua priva di RNasi.
5. Determinare la concentrazione lineare del plasmide in nanogrammi per microlitro (ng/μL) utilizzando un fluorometro facendo prima scorrere 2 μL di un bianco d'acqua privo di RNasi e quindi facendo scorrere 2 μL del plasmide linearizzato.
   NOTA: Le concentrazioni di plasmidi variano tipicamente tra 100-200 ng/μL
6. Impostare la produzione di mRNA SP6 combinando i seguenti componenti in ordine in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml: 10 μL di 2x NTP/CAP, 2 μL di tampone di reazione 10x, 0,1-1 μg di modello lineare di DNA e 2 μL di miscela enzimatica SP6.
7. Riempire la reazione fino a 20 μL con acqua priva di RNasi, quindi miscelare e incubare a 37 °C per 2 ore.
8. Dopo l'incubazione per 2 ore, aggiungere 1 μL di DNasi, mescolare bene e incubare per altri 15 minuti a 37 °C.
9. Per arrestare la reazione SP6, aggiungere 30 μL di soluzione di precipitazione LiCl al tubo di reazione, quindi mescolare e raffreddare a -20 °C durante la notte.
10. Centrifugare la soluzione a 14.000 x g per 20 minuti a 4 °C per pellettare l'mRNA, quindi aspirare il surnatante e lavare il pellet di mRNA con 1 mL di EtOH all'80% (diluito con acqua priva di RNasi).
11. Centrifugare la soluzione a 14.000 x g per 20 minuti a 4 °C per pellettare l'mRNA, quindi aspirare il surnatante. Lasciare asciugare il pellet all'aria.
12. Risospendere il pellet di mRNA in 20 μL di acqua priva di RNasi, determinare la concentrazione di mRNA in nanogrammi per microlitro (ng/μL) utilizzando un fluorometro come descritto al punto 4.5 (dovrebbe essere almeno 100 ng/μL), aliquote 100 ng di mRNA per provetta monouso e conservare a -80 °C.
    NOTA: Per assicurarsi che l'mRNA non sia degradato, 2 μL di mRNA possono essere rapidamente eseguiti su un gel di elettroforesi del DNA per confermare una singola banda a 1.950 bps.

5. Clonazione di gateway multisito per creare vettori di ingresso per la transgenesi

NOTA: Questo protocollo è modificato da Kwan et ^al.10, con la reazione LR scritta come una reazione semi-LR e con un volume totale di 5 μL. Per generare nuovi elementi di ingresso, le reazioni BP utilizzando vettori donatori 5', medi e 3' devono essere utilizzati^10,13.

1. Per eseguire la reazione, raccogliere 10 fmol ciascuno di p5E, pME e p3E e 20 fmol del vettore di destinazione (pDest).
   NOTA: La ricombinazione LR multisito utilizza quattro diversi vettori plasmidici: un vettore di ingresso 5' (p5E), un vettore di entrata intermedia (pME), un vettore di ingresso 3' (p3E) e un vettore di destinazione (pDest), per generare un costrutto transgenico unico affiancato da ripetizioni Tol2 pronte per essere iniettate in embrioni di zebrafish.
   1. Identificare la dimensione di tutti e quattro i vettori in coppie di basi dalla sorgente del plasmide (Tabella 1, Tol2Kit Wiki pagina¹⁴ o Addgene¹¹; vedere la Tabella dei materiali).
      NOTA: Per i nuovi vettori, il sequenziamento plasmidico completo tramite società di sequenziamento commerciale può fornire l'esatta dimensione del plasmide in bps.
   2. Determinare la concentrazione di tutti e quattro i vettori in nanogrammi per microlitro (ng/μL) utilizzando un fluorometro, come descritto al punto 4.5.
   3. Utilizzando il peso del DNA come 660 g / mol e la dimensione del plasmide (in bps), calcolare i nanogrammi totali (ng) di plasmide necessari per raggiungere 10 fmol (vettori di ingresso) o 20 fmol (vettore di destinazione).
      
      NOTA: Il laboratorio Mosimann presso l'Università del Colorado, Anschutz Medical Campus, ha generato un foglio di calcolo liberamente disponibile per calcolare la quantità di plasmide necessaria (in ng) e il volume (in μL) dei vettori necessari nella reazione LR¹⁵.
2. Per generare il costrutto descritto di seguito, sox17: EGFPCAAX, utilizzare i seguenti vettori: un vettore p5E contenente il promotore sox17 del pesce zebra, che è 6.918 bp di dimensione¹⁶; un vettore pME contenente l'EGFP prenilato, di dimensioni¹⁰ di 3.345 bp; un vettore p3E contenente la sequenza di segnali SV40 late poly A, di dimensione¹⁰ di 2.838 bp; e il pDest, che è 5.883 bp in taglia¹⁰.
3. Utilizzando la concentrazione del plasmide determinata nella fase 5.1.2 e la quantità in nanogrammi (ng) per ciascun vettore (fase 5.1.3), calcolare i microlitri totali (μL) di ciascun plasmide necessari per raggiungere 10 fmol (vettori di ingresso) o 20 fmol (vettore di destinazione), quindi dividerli per due per l'uso nelle reazioni semiLR da 5 μL (tutti i valori elencati di seguito sono elencati nella Tabella 2).
   
   1. Per generare 10 fmol di p5E-sox17, utilizzare 45,66 ng (ad una concentrazione di 140,3 ng/μL) e diluire con acqua sterile di un fattore 4 per ottenere 0,65 μL.
   2. Per generare 10 fmol di pME-EGFPCAAX, utilizzare 22,08 ng (ad una concentrazione di 213,5 ng/μL) e diluire con acqua sterile di un fattore 10 per ottenere 0,52 μL.
   3. Per generare 10 fmol di p3E-poli A, utilizzare 15,73 ng (ad una concentrazione di 276,1 ng/μL) e diluire con acqua sterile di un fattore 20 per ottenere 0,57 μL.
   4. Per 20 fmol del vettore di destinazione, utilizzare 77,66 ng di pDest (ad una concentrazione di 307,3 ng/μL) e diluire con acqua sterile di un fattore 5 per ottenere 1,63 μL.
4. Per impostare una reazione semi-LR da 5 μL, combinare i volumi di p5E, pME, p3E e pDest determinati nella fase 5.3 in una provetta da microcentrifuga da 0,5 ml, quindi aggiungere acqua sterile per raggiungere un volume di reazione totale di 4 μL.
5. Vortice vigorosamente la miscela enzimatica LR 2x per 1 minuto ciascuno per garantire una corretta miscelazione, quindi aggiungere 1 μL alla reazione e mescolare accuratamente.
6. Incubare a 25 °C durante la notte (16+ h).
7. Interrompere la reazione LR aggiungendo 0,5 μL di proteinasi K (2 μg/μL), incubare a 37 °C per 10 minuti e quindi raffreddare a temperatura ambiente.
8. Trasformare 3-4 μL di plasmide in cellule scongelate e chimicamente competenti aggiungendo il plasmide e lasciando riposare le cellule sul ghiaccio per 25-30 minuti.
9. Mentre le cellule siedono sul ghiaccio, riscaldare due piastre di agar ampicillina LB a temperatura ambiente.
10. Shock termico delle celle a bagnomaria a 42°C per 30 secondi precisi.
11. Dopo lo shock termico, aggiungere 250 μL di mezzo liquido ricco e privo di antibiotici alle cellule e incubare agitando a 37 °C per 1,5 ore.
12. Distribuire 300 μL di batteri su una piastra di ampicillina e incubare a 37°C durante la notte.
13. La mattina seguente, esaminare le colonie per la presenza di due fenotipi, chiaro e opaco, scegliere le colonie chiare (come descritto in Kwan et ^al.10) una alla volta, inoculare la coltura liquida e quindi agitare a 37 ° C durante la notte.
    NOTA: Le colonie chiare contengono quasi sempre la colonia LR corretta (>85% delle volte).
14. Utilizzando un kit commerciale secondo le istruzioni del produttore, eseguire una preparazione plasmidica su ciascuna coltura liquida e digerire diagnosticamente ciascun plasmide per confermare la dimensione appropriata del costrutto transgenico, il che indica che la reazione gateway LR ha funzionato correttamente.
15. Ritrasformare i costrutti transgenici corretti utilizzando il protocollo standard di trasformazione batterica come descritto nelle fasi 5.4-5.12 utilizzando 0,5-1 μL del plasmide e incubare solo a 37 °C per 1 ora.
16. Ri-striare le colonie e confermare che ognuna ha il costrutto transgenico LR come nel punto 5.14.
17. Determinare la concentrazione plasmidica come descritto al punto 4.5 (per l'iniezione dell'embrione sono necessari almeno 150 ng/μL).

6. Iniezione del transgene negli embrioni

1. Scongelare un campione di mRNA trasposasi monouso e un costrutto transgenico Tol2 sul ghiaccio e preavvertire una piastra di iniezione di agarosio a temperatura ambiente.
2. Combinare quanto segue su ghiaccio: 150 ng di plasmide, 100 ng di mRNA trasposasi e 2% rosso fenolo (0,3 μL). Quindi, aggiungere acqua priva di RNA per aumentare il volume a 3 μL.
3. Trasferire gli embrioni allo stadio di una cellula utilizzando pipette di trasferimento sulla piastra di iniezione (descritta al punto 2) riempita con EM che copre completamente l'agar, quindi premere delicatamente circa 50-75 embrioni per fessura della piastra di iniezione.
4. Aggiungere la miscela rosso mRNA/plasmide/fenolo all'estremità aperta di un ago di iniezione capillare, posizionare l'ago capillare nell'armatura del carro di iniezione e accendere il carro di iniezione.
   NOTA:Il carro di iniezione utilizza gas compresso, come l'aria, per pulsare il volume desiderato (descritto al punto 6.5) della miscela rosso mRNA/plasmide/fenolo nell'embrione quando attivato.
5. Abbassare l'ago capillare nell'EM della piastra di iniezione e rompere la punta usando una pinza per consentire solo una piccola quantità di miscela rosso mRNA / plasmide / fenolo da pompare fuori dal carro di iniezione.
6. Iniettare gli embrioni con un piccolo bolo di 3 nL della miscela rosso mRNA/plasmide/fenolo nel corpo cellulare dell'embrione.
   NOTA: Un bolo di 3 nL è un volume di miscela rosso mRNA / plasmide / fenolo in cui sette boli possono teoricamente adattarsi ugualmente attraverso la linea mediana dell'embrione.
7. Al termine dell'iniezione degli embrioni, rimuoverli dalla piastra di iniezione estraendoli delicatamente dalla fessura e trasferirli in una capsula di Petri da 100 mm con EM fresco (circa 40 ml), quindi incubarli a 28,5 °C per consentire agli embrioni di svilupparsi.

7. Screening degli embrioni per l'inserimento transgenico

1. Per l'espressione di proteine fluorescenti, scegliere lo stadio di sviluppo appropriato in cui il transgene fluorescente deve essere espresso e selezionare la presenza di fluorescenza al microscopio da dissezione fluorescente.
   NOTA: Questi embrioni saranno mosaici nella loro espressione e mostreranno un inserimento genomico del costrutto transgenico.
2. Screening dei transgeni non fluorescenti mediante screening per un marcatore transgenico fluorescente (come descritto nella fase 7.1), come GFP guidata dal promotore cardiaco-specifico per il gene cmlc2 o mCherry guidata dal promotore specifico del cristallino di αcyrstallin, che sono contenuti in distinti vettori di destinazione.
3. Lasciare che gli embrioni positivi per l'inserimento transgenico si sviluppino completamente negli stadi adulti di zebrafish.
4. Una volta che i potenziali pesci transgenici raggiungono l'età riproduttiva, selezionarli individualmente sia per la trasmissione della linea germinale che per l'espressività transgenica allevandoli al pesce zebra selvatico.
5. Gli adulti i cui embrioni si sviluppano normalmente e danno l'espressione transgenica più forte e più appropriata sono tenuti come linee di zebrafish transgeniche uniche per futuri lavori e analisi.
   NOTA: Come approccio alternativo allo screening per l'inserimento genomico di costrutti transgenici, progettare primer PCR che amplificano solo il costrutto transgenico e non il DNA wild-type.

Risultati

Per generare i costrutti transgenici, abbiamo usato il sistema di transgenesi Tol2. Tre vettori di ingresso, tra cui p5E, che contiene gli elementi promotore/potenziatore del gene, pME, che contiene il gene che deve essere espresso dagli elementi promotore/potenziatore, e p3E che, come minimo, detiene la coda polyA, sono stati utilizzati per generare il costrutto transgenico tramite clonazione LR multisite gateway. Il vettore di destinazione, pDest, fornisce le ripetizioni Tol2 per l'inserimento genomico del cos...

Discussione

I pesci zebra sono ideali per studiare l'impatto dell'esposizione all'etanolo sullo sviluppo e sugli stati patologici ^7,8. I pesci zebra producono un gran numero di embrioni traslucidi, fecondati esternamente e geneticamente trattabili, che consentono l'imaging dal vivo di diversi tessuti e tipi di cellule marcati con transgene contemporaneamente in più contesti ambientali^19,20. Questi punti di forza, com...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cassetta degli attrezzi Addgene Tol2	https://www.addgene.org/kits/cole-tol2-neuro-toolbox/
Air			Fornito direttamente dall'università
Ampicillina	Fisher Scientific	BP1760
Bilancia analitica	VWR	10204-962
Borosil 1,0 mm OD x 0,75 mm ID Capillare	FHC	30-30-0
Cloruro di calcio	VWR	97062-590
Cloramfenicolo	BioVision	2486
EDTA	Fisher Scientific	BP118-500
Microscopio da dissezione fluorescente	Olympus	SZX16
Kanamicina	Fisher Scientific	BP906
Microscopio confocale a scansione laser	Olympus	Fluoview FV1000
Lawson Lab Donor Plasmid Prep	https://www.umassmed.edu/lawson-lab/reagents/lawson-lab-protocols/
LB Agar	Fisher Scientific	BP9724
LB Brodo	Fisher Scientific	BP1426
Basso EEO/Multiuso/Biologia molecolare Grado Agarosio	Fisher Scientific	BP160-500
LR Clonasi II Plus Enzima	Fisher Scientific 12538200
Solfato di magnesio (eptaidrato)	Fisher Scientific	M63-500
Micro Pipette	Strumentazione scientifica applicata	MIMPH-M-PIP
Provetta per microcentrifuga 0,5 mL	VWR	10025-724
Provetta per microcentrifuga 1,5 mL	VWR	10025-716
Micromanipolatore	Strumentazione scientifica applicata	MM33
Puntali per micropipette 10 μ L	Fisher Scientific	13611106
Puntali per micropipette 1000 μ L	Fisher Scientific	13611127
Puntali per micropipette 200 μ L	Fisher Scientific	13611112
mMESSAGE Kit di trascrizione mMACHINE SP6	Fisher Scientific	AM1340
Mosimann Lab Tol2 Foglio di lavoro per il calcolo	https://www.protocols.io/view/multisite-gateway-calculations-excel-spreadsheet-8epv599p4g1b/v1
Spettrofotometro NanoDrop		NanoDrop ND-1000
NcoI	NEB	R0189S
NotI	NEB	R0189S
piastre di Petri 100 mm	Fisher Scientific	FB012924
Fenolo Rosso sale sodico	Sigma Aldrich	P4758-5G
Pipetman L p1000L Micropipetta	Gilson	FA10006M
Pipetman L p200L Micropipetta	Gilson	FA10005M
Pipetman L p2L Micropipetta	Gilson	FA10001M
Cloruro di potassio	Fisher Scientific	P217-500
Fosfato di potassio (bibasico)	VWR	BDH9266-500G
Iniettore di pressione	Strumentazione scientifica applicata	MPPI-3
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
Bicarbonato di sodio	VWR	BDH9280-500G
Cloruro di sodio	Fisher Scientific	S271-500
Fosfato di sodio (bibasico)	Fisher Scientific	S374-500
Stericup .22 µ sistema di filtrazione sottovuoto m	Millipore	SCGPU11RE
Tol2 Pagina Wiki	http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page
Top10 Chimicamente Competente E. coli	Fisher Scientific C404010
Estrattore di pipettatore verticale	David Kopf Instruments	720
Zebrafish microinjection mold	Adaptive Science	Tools i34