Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.
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Articolo metodologico
Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'avvento delle tecnologie mirate di nucleasi CRISPR-Cas ha rivoluzionato la capacità di eseguire un accurato editing del genoma in sistemi modello sia consolidati che emergenti. I sistemi di editing del genoma CRISPR-Cas utilizzano un RNA guida sintetico (sgRNA) per indirizzare un'endonucleasi associata a CRISPR (Cas) a specifici loci del DNA genomico, dove l'endonucleasi Cas genera una rottura a doppio filamento. La riparazione delle rotture del doppio filamento mediante meccanismi intrinseci soggetti a errori porta a inserimenti e / o delezioni, interrompendo il locus. In alternativa, l'inclusione di donatori di DNA a doppio filamento o oligonucleotidi di DNA a singolo filamento in questo processo può suscitare l'inclusione di precise modifiche del genoma che vanno dai polimorfismi a singolo nucleotide a piccoli tag immunologici o persino grandi costrutti proteici fluorescenti. Tuttavia, un importante collo di bottiglia in questa procedura può essere trovare e isolare la modifica desiderata nella linea germinale. Questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l'isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici in Danio rerio (zebrafish); Tuttavia, questi principi possono essere adattabili in qualsiasi modello in cui è possibile la raccolta di spermatozoi in vivo .
Introduzione
Il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas è un potente strumento per eseguire mutagenesi loci-specifica e editing preciso del genoma nel sistema modello Danio rerio (zebrafish) 1,2,3,4. La Cas-ribonucleoproteina (RNP) è composta da due componenti principali: un'endonucleasi Cas (comunemente Cas9 o Cas12a) e un RNA guida sintetico locus-specifico (sgRNA)5. Insieme, il Cas-RNP genera una rottura a doppio filamento (DSB) nel locus desiderato che può essere riparata da uno ....
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Protocollo
Questo studio è stato condotto in linea con le linee guida della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dall'Università del Texas presso il Comitato per la cura e l'uso degli animali di Austin (AUP-2021-00254).
1. Progettazione dello sgRNA per la mutagenesi di CRISPR
- Ottenere la sequenza di esoni contenente i loci mirati.
- Progettare un RNA guida sintetico (sgRNA) con un sito di motivo adiacente protospaziatore (PAM) specifico per l'endonucleasi Cas.
- Se si co-inietta un costrutto donatore, progettare l'sgRNA in modo ....
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Risultati
Gli approcci sperimentali descritti in questo protocollo consentono la più rapida identificazione di modifiche del genoma o presunti alleli deleteri concentrandosi sull'analisi di migliaia di genomi derivati dalla raccolta di spermatozoi maschili iniettati in F0. La Figura 2 illustra come interpretare i risultati ottenuti utilizzando questo protocollo.
Per generare mutazioni nel locus p2ry12, sono stati iniettati embrioni di zebrafish a una cellula con endonucleas.......
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Discussione
Questo protocollo descrive un metodo per caratterizzare rapidamente le modifiche putative del genoma o le mutazioni mirate utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas mediante analisi focalizzata sui genomi degli spermatozoi maschili F0. Questo protocollo dovrebbe essere suscettibile di altri modelli animali in cui lo sperma è prontamente disponibile per il campionamento senza eutanasia. Questo metodo aumenterà il throughput dello screening per le modifiche desiderate ed è particolarmente utile per identificare rari eventi knoc.......
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Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare Anna Hindes della Washington University School of Medicine per i suoi sforzi iniziali nell'ottenere DNA genomico spermatico di buona qualità utilizzando il metodo hot shot. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health under Award (R01AR072009 to R.S.G.).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Polvere di agarosio | Fisher BioReagents | BP1356-100 | |
| Vasche di allevamento | Carolina Biological | ||
| Enzima di restrizione BstNI | NEB | R0168S | |
| Cas9 Endonucleasi | IDT | 1081060 | |
| Scala del DNA, 100 bp | Thermo Scientific | ||
| costrutto donatore dnah10 | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, dry. Legame fosforotioato sul donatore ai primi tre legami fosfato su entrambe le estremità 5' e 3' (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC TGCTCATCCGCTGCTCTGCCCTGCCT GGACCGAGTGTACCGTGCCGTGTGTGTGTGTCTC AGTGATTACGTCACGC-3') | |
| dnah10 primer in avanti | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT TTGGC-3') | |
| dnah10 primer inverso | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in tubo; 0,025 nM, purificazione standard per desalinizzazione, secco ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA ATACAGC-3') | |
| dnah10 sgRNA sintetico | Synthego | SgRNA sintetico, sequenza target: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Alimentatore | |
| per elettroforesi | Thermo Scientific | 105ECA-115 | |
| Pinza filtrante | Millipore | XX6200006P | |
| Pesce (sistema) acqua | Generico | n/a | |
| Sistema di elettroforesi su gel (incluso telaio di colata, pettine e camera di elettroforesi) | Thermo Scientific | Scatola luminosa per imaging in gel B2 | |
| nbsp; | Azure Biosystems | AZI200-01 | |
| Colorante in gel, 10000X | Invitrogen | S33102 | |
| Ciotola in vetro, 250 mL | Generico | n/a | |
| Serbatoi di isolamento, 0,8 L | Aquaneering | ZT080 | |
| Tubo capillare Microcap con bulbo, 20 & micro; L | Drummond | 1-000-0020/CA | |
| Minicentrifuga | Bio-Rad | 12011919EDU | |
| Micropipette, varie con puntali appropriati | Generico | n/a | |
| Microonde | Generico | n/a | |
| Acqua priva di nucleasi | Promega | P119-C | |
| Asciugamani di carta | Generico | n/a | |
| Provette per PCR, 0,2 mL | Bioexpress | T-3196-1 | |
| Cucchiaio di plastica, con fori/fessure | Soluzione generica | n/a | |
| KCl, 0,2 M RNAsi Free | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| p2ry12 primer in avanti | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT -3') | |
| p2ry12 primer inverso | Sigma-Aldrich | DNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT -3') | |
| p2ry12 sgRNA sintetico | Synthego | SgRNA sintetico, sequenza bersaglio: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Enzima | |
| di restrizione 10X Tampone | NEB | B6003SVIAL | |
| soluzione di NaOH, 50 mM | Thermo Scientific | S318; 424330010 | |
| Spugna, taglio da 1 pollice x 1 pollice con piccolo divot ovale | Generico | n/a | |
| Stereomicroscopio | Zeiss | Stemi 508 | |
| Taq polimerasi master mix, 2X | Promega | M7122 | |
| TBE Buffer Concentrato, 10X | VWR | E442 | |
| Termociclatore | Bio-Rad | 1861096 | |
| Carta velina | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Soluzione di tricaina-metanosolfonato (Sincina, MS-222), 0,016% in acqua di pesce (pH 7,0± 0,2) | Syndel | 200-266 | |
| Tris Base, 1M (tamponato con HCl a ph 8.0) | Promega | H5131 |
Riferimenti
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient ....
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Ristampe e permessi
