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Articolo metodologico

Screening dello sperma per il rapido isolamento delle modifiche germinali nel pesce zebra

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DOI:

10.3791/64686

⸱

10 febbraio 2023

 ,  , 
1Department of Molecular Biosciences, The University of Texas at Austin, 2Department of Nutritional Sciences, The University of Texas at Austin

In questo articolo

Sommario

Le tecnologie CRISPR-Cas hanno rivoluzionato il campo dell'editing del genoma. Tuttavia, trovare e isolare la modifica della linea germinale desiderata rimane un importante collo di bottiglia. Pertanto, questo protocollo descrive un metodo robusto per lo screening rapido dello sperma di zebrafish iniettato con F0 CRISPR per le modifiche della linea germinale utilizzando PCR standard, digestione di restrizione e tecniche di elettroforesi su gel.

Abstract

L'avvento delle tecnologie mirate di nucleasi CRISPR-Cas ha rivoluzionato la capacità di eseguire un accurato editing del genoma in sistemi modello sia consolidati che emergenti. I sistemi di editing del genoma CRISPR-Cas utilizzano un RNA guida sintetico (sgRNA) per indirizzare un'endonucleasi associata a CRISPR (Cas) a specifici loci del DNA genomico, dove l'endonucleasi Cas genera una rottura a doppio filamento. La riparazione delle rotture del doppio filamento mediante meccanismi intrinseci soggetti a errori porta a inserimenti e / o delezioni, interrompendo il locus. In alternativa, l'inclusione di donatori di DNA a doppio filamento o oligonucleotidi di DNA a singolo filamento in questo processo può suscitare l'inclusione di precise modifiche del genoma che vanno dai polimorfismi a singolo nucleotide a piccoli tag immunologici o persino grandi costrutti proteici fluorescenti. Tuttavia, un importante collo di bottiglia in questa procedura può essere trovare e isolare la modifica desiderata nella linea germinale. Questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l'isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici in Danio rerio (zebrafish); Tuttavia, questi principi possono essere adattabili in qualsiasi modello in cui è possibile la raccolta di spermatozoi in vivo .

Introduzione

Il sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas è un potente strumento per eseguire mutagenesi loci-specifica e editing preciso del genoma nel sistema modello Danio rerio (zebrafish) 1,2,3,4. La Cas-ribonucleoproteina (RNP) è composta da due componenti principali: un'endonucleasi Cas (comunemente Cas9 o Cas12a) e un RNA guida sintetico locus-specifico (sgRNA)5. Insieme, il Cas-RNP genera una rottura a doppio filamento (DSB) nel locus desiderato che può essere riparata da uno dei due meccanismi di riparazione intrinseca. Il meccanismo di riparazione della giunzione finale non omologa (NHEJ) è soggetto a errori e spesso si traduce in una varietà di inserzioni o delezioni (indel) attorno al DSB. Questi indels possono essere deleteri se introducono una mutazione frameshift o un arresto prematuro nella sequenza proteica risultante. In alternativa, il meccanismo di riparazione diretta dall'omologia (HDR) utilizza un modello di donatore con regioni di omologia che circondano il sito DSB per riparare il danno. I ricercatori possono sfruttare il sistema HDR per generare modifiche genomiche precise. In particolare, possono co-iniettare un costrutto di donatore di DNA a doppio filamento che contiene le modifiche desiderate e le regioni di omologia che fiancheggiano il sito DSB nel genoma. La maggiore economia di scala per questi componenti CRISPR prodotti commercialmente ha notevolmente ridotto le barriere allo screening di più loci e alla creazione di sforzi su larga scala per l'editing preciso del genoma. Tuttavia, nei modelli animali che si riproducono sessualmente, un importante collo di bottiglia è l'identificazione e l'isolamento di animali mutanti stabili alla linea germinale.

Il sistema modello zebrafish presenta diverse qualità chiave che ne migliorano l'uso negli studi genetici inversi. Sono facili da allevare in gran numero con attrezzature di base per l'alloggiamento acquatico e le femmine mostrano un'elevata fecondità tutto l'anno6. Inoltre, la loro deposizione esterna delle uova e la fertilizzazione li rendono suscettibili alla microiniezione di componenti CRISPR / Cas. Il Cas-RNP viene comunemente iniettato in embrioni di zebrafish a una cellula per generare DSB / riparazione che è, in teoria, ereditato da tutte le cellule figlie. Tuttavia, i genomi diploidi richiedono due eventi DSB/riparazione per mutagenizzare entrambi i cromosomi omologhi. Inoltre, sebbene Cas-RNP venga iniettato allo stadio di una cellula, il DSB / riparazione potrebbe non verificarsi fino a punti successivi nello sviluppo. Insieme, questi fattori contribuiscono alla natura a mosaico del pesce iniettato con F0. Una pratica comune è quella di incrociare i pesci iniettati con F0 e controllare la progenie F1 per indel/modifiche specifiche. Tuttavia, poiché non tutti i pesci iniettati con F0 possiedono mutazioni germinali, questa pratica si traduce in molti incroci improduttivi che non generano la modifica desiderata. Lo screening della linea germinale F0 piuttosto che del tessuto somatico F1 aumenta la probabilità di isolare la modifica germinale desiderata e riduce il numero di animali necessari in questo processo.

Lo sperma può essere facilmente raccolto dal pesce zebra iniettato con F0 senza bisogno di eutanasia. Questa caratteristica consente la crioconservazione e la riderivazione di scorte di spermatozoi congelati7 ma può anche essere sfruttata per vagliare, identificare e isolare rapidamente i portatori della linea germinale delle mutazioni genomiche desiderate 8,9. Brocal et al. (2016) hanno precedentemente descritto un metodo basato sul sequenziamento per lo screening delle modifiche della linea germinale nel pesce zebra maschio iniettato con F010. Sebbene utile per identificare gli alleli mutati presenti nella linea germinale, questo approccio può diventare costoso in termini di produttività elevata e potrebbe non essere accessibile a tutti i laboratori. Al contrario, il protocollo attuale offre una strategia basata sull'elettroforesi accessibile ed economica per identificare le modifiche della linea germinale. In particolare, questo protocollo delinea un metodo robusto per lo screening e l'isolamento delle mutazioni germinali in loci specifici utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio ad alta risoluzione. Inoltre, questo protocollo descrive una strategia simile per identificare l'integrazione riuscita di un costrutto donatore contenente modifiche specifiche. Come sempre, se si desiderano modifiche specifiche, le strategie basate sul sequenziamento possono essere eseguite in tandem con il protocollo descritto di seguito. Sebbene questo protocollo sia specifico per il sistema modello del pesce zebra, questi principi dovrebbero essere adattabili a qualsiasi modello in cui la raccolta di spermatozoi è una procedura di routine. Insieme, queste strategie consentiranno l'identificazione di maschi iniettati in F0 con indels/edits germinali che possono essere risolti su un gel dopo reazione a catena della polimerasi standard (PCR) e/o digestione di restrizione.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto in linea con le linee guida della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health. Il protocollo è stato approvato dall'Università del Texas presso il Comitato per la cura e l'uso degli animali di Austin (AUP-2021-00254).

1. Progettazione dello sgRNA per la mutagenesi di CRISPR

  1. Ottenere la sequenza di esoni contenente i loci mirati.
  2. Progettare un RNA guida sintetico (sgRNA) con un sito di motivo adiacente protospaziatore (PAM) specifico per l'endonucleasi Cas.
    1. Se si co-inietta un costrutto donatore, progettare l'sgRNA in modo da avere un sito di taglio previsto il più vicino possibile alle modifiche desiderate.
      NOTA: APE è un software gratuito con uno strumento per trovare siti sgRNA Cas911. In alternativa, è possibile utilizzare strumenti come CHOPCHOP, che offre un'interfaccia online per la progettazione di sgRNA che considera i diversi siti PAM di Cas9 e altre endonucleasi Cas12.
  3. Progetta primer avanti e indietro per amplificare la regione che circonda il sito di taglio CRISPR / Cas progettato. Il prodotto PCR dovrebbe essere lungo circa 200-400 paia di basi (bp) per essere in grado di risolvere piccoli indels su un gel più avanti nel protocollo.
    NOTA: CHOPCHOP11 progetta automaticamente primer per ogni sgRNA che emette.
  4. Facoltativo: progettare un costrutto di donatore di DNA con le modifiche desiderate.
    1. Ottenere la sequenza genomica dell'esone contenente i loci della mutazione desiderata.
      NOTA: le sequenze introniche possono variare tra gli individui, quindi è meglio evitare l'inclusione di sequenze introniche nel costrutto del donatore in quanto ciò potrebbe interferire con il percorso di riparazione dipendente dall'omologia.
    2. Se si desidera un cambiamento specifico dell'amminoacido, modificare di conseguenza il codone specifico.
      NOTA: quando si apportano queste modifiche, prestare attenzione alla frequenza del codone. Se possibile, scegli un codone con un uso elevato.
    3. Per prevenire la digestione CRISPR / Cas del costrutto donatore, effettuare ulteriori mutazioni sinonimi che (i) interrompono il PAM e / o (ii) interrompono la sequenza di sgRNA, con una maggiore preferenza per apportare modifiche non sinonimi più vicine al sito PAM.
    4. Utilizzare un cercatore di siti di restrizione (APE11 ha anche questa caratteristica) per trovare siti di restrizione unici (quelli che si verificano solo una volta) nel prodotto PCR previsto della sequenza wild-type.
      1. Ripetere questo processo per il prodotto PCR previsto che riflette la corretta integrazione del costrutto del donatore.
      2. Confrontare l'elenco dei siti di restrizione tra le sequenze wild-type e quelle integrate nel donatore per trovare un sito di restrizione presente solo nella sequenza modificata.
      3. Se non viene trovato alcun sito di restrizione univoco, continuare ad apportare modifiche sinonimi all'interno del costrutto del donatore fino a quando questo non viene raggiunto.
        NOTA: Se possibile, continuare a fare mutazioni sinonimi che interromperebbero il legame dell'sgRNA al costrutto del donatore.
    5. Tagliare la sequenza del donatore a una dimensione gestibile (50-100 bp) con almeno 20 bp di omologia che circonda il sito di taglio CRISPR / Cas previsto e le modifiche, se possibile.
  5. Ottenere gli oligonucleotidi sgRNA e/o donatori di DNA progettati, nonché tutti i primer necessari per la genotipizzazione.
    NOTA: Per impedire la digestione degli oligonucleotidi del donatore di DNA da parte delle nucleasi, si raccomanda di modificare i primi tre legami fosfato sulle estremità 5' e 3' degli oligonucleotidi del DNA con fosforotioato.
  6. Iniettare 1 nL della miscela iniettabile in embrioni monocellulari. Tipicamente, una miscela di iniezione standard contiene quanto segue:
    1 μL di sgRNA locus-specifico da 25 μM
    1 μL di endonucleasi Cas9 25 μM
    Opzionale: 1 μL di costrutto di donatore di DNA da 3 μM
    1. Portare il volume totale a 5 μL con KCl privo di RNasi 0,1 M.
  7. Consentire agli individui iniettati F0 di svilupparsi in adulti sessualmente maturi. Il protocollo rimanente si concentra sullo screening dei maschi iniettati con F0 per le modifiche della linea germinale.

2. Allestimento delle vasche di allevamento

  1. Primi maschi F0 per l'accoppiamento allestendo vasche di riproduzione con divisori tra i maschi e le femmine F0.
    1. Per ridurre al minimo il numero di vasche di riproduzione necessarie, allestire tre maschi di fronte a due femmine in ogni vasca.
      1. Impostare il maggior numero di maschi F0 che possono essere efficacemente sottoposti a screening e ospitati come individui dopo la raccolta dello sperma. Il genotipo delle femmine non è importante poiché i loro gameti non saranno raccolti durante questa procedura.
    2. Istituire una vasca di riproduzione di maschi selvatici di fronte alle femmine. Lo sperma wild-type servirà come controllo per l'interpretazione dei risultati più avanti nella procedura.
  2. Incubare le vasche di riproduzione preparate durante la notte.

3. Preparazione dei materiali per la procedura di raccolta dello sperma

  1. Preparare una soluzione anestetizzante sufficiente (0,016% tricaina-HCl in acqua di pesce) per riempire una piccola ciotola di vetro.
  2. Erogare 40 μL di 50 mM NaOH in provette PCR da 0,2 mL. Preparare una provetta per ogni campione di sperma che verrà raccolto. Conservare in ghiaccio.
  3. Preparare le singole vasche da 0,8 L per ogni pesce che verrà campionato durante la procedura. Queste vasche ospiteranno i pesci campionati fino al completamento della genotipizzazione.
    NOTA: Questo è il fattore principale che limita il numero di pesci che possono essere efficacemente sottoposti a screening in questo protocollo. Garantire uno spazio adeguato per ospitare gli individui campionati fino al completamento della genotipizzazione.
  4. Inumidire una spugna da 1 pollice x 1 pollice (tagliata con un divot poco profondo di forma ovale per tenere un maschio di zebrafish lato ventrale verso l'alto durante la procedura) in acqua di pesce e spremere il liquido in eccesso.
    1. Posizionare la spugna nel campo visivo di uno stereomicroscopio a basso ingrandimento (Figura 1A).
    2. Posizionare l'illuminazione obliqua dall'alto per una visione ottimale.

4. Anestetizzare il pesce maschio e raccogliere lo sperma

  1. Preparare un tubo capillare pulito.
    1. Agitare delicatamente il contenitore del tubo per rilasciare un singolo tubo capillare.
    2. Posizionare il tubo capillare nel bulbo fornito e metterlo da parte.
  2. Trasferire un pesce maschio nella soluzione anestetizzante preparata (0,016% tricaina-HCl in acqua di pesce).
    1. Mescolare delicatamente la soluzione con un mestolo forato per accelerare il processo di anestesia.
    2. Una volta che il movimento dell'opercolo (branchia) rallenta (circa 1-2 minuti), procedere con la raccolta degli spermatozoi.
  3. Usa il mestolo forato per trasferire il pesce su una pila pulita di carta assorbente.
    1. Utilizzare il mestolo forato per arrotolare delicatamente il pesce per rimuovere l'acqua in eccesso.
    2. Tamponare delicatamente il pesce con carta velina pulita e piegata per rimuovere l'acqua residua.
  4. Utilizzare il mestolo forato per trasferire il pesce nella spugna preparata (Figura 1B).
    1. Posizionare il pesce con il lato ventrale verso l'alto con la testa più vicina alla mano dominante della persona che esegue la procedura.
    2. Asciugare delicatamente l'area intorno alle pinne anali con carta velina pulita e piegata.
  5. Raccogli lo sperma.
    1. Utilizzando l'estremità del tubo capillare, spostare delicatamente le pinne pelviche lateralmente lontano dalla linea mediana per esporre la cloaca (Figura 1C).
    2. Posizionare l'estremità del tubo capillare vicino alla cloaca.
    3. Usando la pinza, stringere delicatamente i lati del pesce iniziando appena sotto le branchie e terminando alla cloaca (Figura 1C').
    4. Raccogliere lo sperma nel tubo capillare per azione capillare. Circa 1 μL è sufficiente per questa procedura (Figura 1D).
      NOTA: Alcuni laboratori riferiscono di utilizzare punte di pipette p10 invece di tubi capillari per la raccolta dello sperma.
    5. Se lo sperma non viene rilasciato con una leggera pressione, riportare il pesce nell'acqua del sistema.
      1. Monitor per il recupero dall'anestesia.
      2. Non spremere duramente il pesce per espellere lo sperma, poiché ciò può ferire il pesce.
      3. Riposare il pesce per 2 settimane prima di tentare di raccogliere nuovamente lo sperma.
    6. Dopo la raccolta, posizionare il pesce in una vasca di isolamento pulita con acqua di sistema per l'alloggiamento individuale.
      1. Monitorare il pesce per il recupero dall'anestesia.
      2. Riposare il pesce per 2 settimane prima di tentare di raccogliere nuovamente lo sperma.
    7. Posizionare il tubo capillare con lo sperma raccolto nel tubo PCR preparato (con 40 μL di 50 mM NaOH).
    8. Spremere il bulbo di gomma per espellere il campione raccolto.
    9. Smaltire il tubo capillare usato in un contenitore di rifiuti di vetro approvato.
    10. Incubare i campioni sul ghiaccio fino a quando tutti i maschi sono stati spremuti.
  6. Ripetere i passaggi 4.1-4.5 per ogni singolo maschio.
  7. Etichettare i serbatoi di isolamento e i campioni di sperma in modo tale che i risultati finali della genotipizzazione degli spermatozoi possano essere ricondotti all'individuo corrispondente con mutazioni putative.
  8. Monitora tutti gli individui e assicurati che siano in posizione verticale ed esplorino i loro serbatoi prima di rimettere i serbatoi sul sistema.
  9. Metti le femmine utilizzate per l'innesco nelle rispettive vasche sul sistema.
  10. Se un pesce non si riprende dall'anestesia dopo 10 minuti, seguire la procedura di eutanasia approvata dall'istituzione associata al laboratorio.
    1. Esempio: raffreddare rapidamente l'individuo in un bagno di ghiaccio con acqua di pesce a 2-4 °C.
    2. Smaltire il pesce eutanasia in un apposito contenitore per i rifiuti delle carcasse animali secondo la procedura approvata dall'istituzione associata al laboratorio.

5. Estrazione del DNA dai campioni di sperma

  1. Girare brevemente tutti i campioni di sperma in una minicentrifuga e posizionare i tubi PCR in un termociclatore.
  2. Chiudere il coperchio del termociclatore.
  3. Eseguire le seguenti impostazioni nel termociclatore:
    1. Riscaldare i campioni per 40 minuti a 95 °C.
    2. Raffreddare i campioni a 25 °C.
  4. Rimuovere i campioni dal termociclatore.
  5. Con una punta di pipetta pulita per ciascun campione, neutralizzare il pH aggiungendo 10 μL di 1 M Tris-HCl (tamponato a pH 8).
  6. Mescolare bene pipettando su e giù.
  7. Girare brevemente i campioni in una minicentrifuga.
  8. I campioni di DNA genomico possono essere conservati per diversi giorni a 4 °C o posti a -20 °C per un massimo di 6 mesi.

6. Amplificazione PCR (e/o digestione di restrizione) del locus desiderato

  1. Amplifica il locus desiderato utilizzando un protocollo PCR standard.
    1. Preriscaldare il termociclatore alla temperatura di denaturazione iniziale nella reazione PCR sottostante.
    2. Preparare una miscela di reazione da 25 μL per ogni campione di sperma in provette per PCR:
      12,5 μL di 2x Taq Polymerase Master Mix
      1,5 μL di primer forward da 10 μM
      1,5 μL di primer inverso da 10 μM
      4,5 μL di acqua esente da nucleasi
      5 μL di campione di DNA spermatico neutralizzato
    3. Mescolare bene pipettando su e giù.
    4. Girare brevemente i campioni in una minicentrifuga.
    5. Posizionare i campioni nel termociclatore preriscaldato con le seguenti impostazioni:
      Denaturazione iniziale: 95 °C per 3 min
      35 cicli di denaturazione (95 °C per 30 s), ricottura (55 °C per 30 s) ed estensione (72 °C per 30 s)
      Estensione finale: 72 °C per 5 min
      NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la temperatura e/o il tempo di estensione in base alla Taq polimerasi specifica e alla lunghezza prevista del prodotto di amplificazione PCR.
    6. Rimuovere i campioni di PCR dal termociclatore.
  2. Facoltativo: eseguire il digest di restrizione specifico del donatore su un piccolo volume del prodotto PCR, lasciando almeno 5-10 μL di prodotto PCR non digerito per l'elettroforesi su gel.
    1. Preparare una reazione da 30 μL in provette da 0,2 mL PCR:
      10 μL di prodotto PCR non purificato
      15 μL di acqua senza nucleasi
      3 μL di tampone enzimatico di restrizione 10x
      2 μL di enzima di restrizione (BstNI è usato nei risultati rappresentativi per l'analisi dell'allele knock-in dnah10 )
      NOTA: Molti enzimi di restrizione sono ancora attivi in un tipico tampone di reazione PCR; Tuttavia, l'aggiunta di Restriction Digest Buffer può contribuire a migliorare i risultati. Fare riferimento alle istruzioni specifiche del produttore per la risoluzione dei problemi in caso di problemi.
    2. Mescolare bene pipettando su e giù.
    3. Girare brevemente i campioni in una minicentrifuga.
    4. Posizionare i campioni in un termociclatore con le seguenti impostazioni:
      1. Tagliare l'amplicone PCR a 60 °C per 1 ora.
        NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la temperatura di taglio e il tempo di incubazione per l'enzima di restrizione specifico utilizzato.
      2. Inattivare l'enzima di restrizione con la temperatura e il tempo di incubazione richiesti, se indicato dal produttore.
        NOTA: L'enzima BstNI non richiede inattivazione termica.

7. Esecuzione dell'elettroforesi su gel per separare ampliconi PCR di varie dimensioni

  1. Preparare 500 mL di tampone corrente 0,5x TBE: aggiungere 50 mL di concentrato tampone 10x TBE a 450 mL di acqua deionizzata.
  2. Preparare 100 ml di gel di agarosio al 4% in tampone corrente TBE 0,5x: aggiungere 4 g di agarosio con 10 μL di colorante gel 10.000x a 100 ml di tampone corrente 0,5x TBE. Microonde fino a quando la polvere di agarosio è completamente sciolta.
    1. Versare la soluzione di gel in un telaio di fusione in gel di dimensioni appropriate e inserire il pettine su un lato del gel.
      NOTA: Una dimensione del gel più grande (consigliata: 15 cm x 15 cm) è vantaggiosa per questa procedura, in quanto fornisce agli ampliconi più spazio per risolvere sul gel.
      1. Se un prodotto digestivo di restrizione deve essere analizzato, è meglio eseguirlo sullo stesso gel del prodotto PCR in modo che i risultati possano essere confrontati. Regolare le dimensioni del pettine secondo necessità per adattare tutti i campioni sul gel.
    2. Lasciare il gel a temperatura ambiente fino a solidificarsi. Rimuovere con cura il pettine. Rimuovere con attenzione il gel dal telaio di fusione.
  3. Impostare il rig di elettroforesi su gel.
    1. Posizionare il gel nel rig di elettroforesi in modo che i pozzetti siano più vicini all'elettrodo negativo. Versare un buffer di funzionamento TBE 0,5x nel carro di elettroforesi fino a quando i pozzetti non sono completamente sommersi.
  4. Caricare il gel.
    1. Caricare 5 μL di scala del DNA nel primo pozzetto (scegliere una scala di DNA che contenga frammenti di DNA di dimensioni simili all'amplicone PCR).
    2. Utilizzando una nuova punta per pipetta per ciascun campione (incluso il campione di controllo wild-type), caricare 5-10 μL del prodotto PCR nei pozzetti rimanenti.
    3. Facoltativo: se è necessario analizzare un prodotto digestivo di restrizione, caricare anche questi campioni sul gel.
      NOTA: è meglio caricare quantità uguali di DNA tra la PCR e il prodotto digestivo di restrizione. Ad esempio, nella miscela di reazione digestiva a restrizione da 30 μL, sono stati aggiunti 10 μL di prodotto PCR. Pertanto, la concentrazione di DNA dei 15 μL del prodotto digesto era paragonabile ai 5 μL del prodotto PCR non purificato.
  5. Esegui il gel.
    1. Collegare gli elettrodi al rig di elettroforesi su gel e applicare 150 V per almeno 1 ora per garantire un'adeguata separazione degli ampliconi.
    2. Immagina il gel per visualizzare le bande di DNA.
      NOTA: I loci fortemente mutagenizzati mirati a CRISPR verranno eseguiti come dimensioni di banda multiple che rappresentano una combinazione di alleli di inserzione/delezione con gli ampliconi wild-type.
      1. Se le bande di gel non si sciolgono dopo 1 ora, applicare 150 V sul gel per intervalli di 15 minuti fino a quando le bande sono sufficientemente separate sul gel.
      2. Facoltativo: se lo screening per l'inserimento di una modifica precisa come un SNP, un tag epitopo o un tag fluorescente, eseguire lo screening del DNA spermatico con metodi PCR specifici per la modifica desiderata. Ad esempio, quando si identifica un sito di restrizione specifico del donatore, una banda aggiuntiva sarà presente nel prodotto digestivo di restrizione rispetto al prodotto PCR del campione di sperma.

8. Isolamento degli alleli stabili della linea germinale

  1. Dopo 2 settimane di riposo dalla procedura di spremitura dello sperma, superare gli individui F0 il cui DNA genomico dello sperma conteneva le modifiche desiderate.
    NOTA: La generazione di spermatozoi da singoli cloni di spermatogoni può essere ciclica nel pesce zebra; Pertanto, l'allele desiderato potrebbe non produrre spermatozoi al momento dell'incrocio. Per questo motivo, potrebbe essere necessario eseguire più di una volta ulteriori attraversamenti per isolare l'allele implicato dallo screening iniziale.
  2. Una volta che i pesci incrociati F1 sono sessualmente maturi, procedere con metodi di genotipizzazione standard (ad esempio, DNA pinna-clip) utilizzando lo stesso protocollo di PCR e elettroforesi su gel eseguito durante lo screening del DNA genomico degli spermatozoi.
    1. Sanger sequenzia i prodotti PCR per identificare gli individui F1 con la stessa modifica desiderata.
    2. Facoltativo: se la modifica desiderata introduce o interrompe un sito con restrizioni, eseguire lo screening con un protocollo digest di restrizione appropriato.
  3. Eterozigoti F1 incrociati con la stessa modifica desiderata.
  4. Screening della progenie F2 per il fenotipo atteso e/o le modifiche genomiche.

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Risultati

Gli approcci sperimentali descritti in questo protocollo consentono la più rapida identificazione di modifiche del genoma o presunti alleli deleteri concentrandosi sull'analisi di migliaia di genomi derivati dalla raccolta di spermatozoi maschili iniettati in F0. La Figura 2 illustra come interpretare i risultati ottenuti utilizzando questo protocollo.

Per generare mutazioni nel locus p2ry12, sono stati iniettati embrioni di zebrafish a una cellula con endonucleas...

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Discussione

Questo protocollo descrive un metodo per caratterizzare rapidamente le modifiche putative del genoma o le mutazioni mirate utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas mediante analisi focalizzata sui genomi degli spermatozoi maschili F0. Questo protocollo dovrebbe essere suscettibile di altri modelli animali in cui lo sperma è prontamente disponibile per il campionamento senza eutanasia. Questo metodo aumenterà il throughput dello screening per le modifiche desiderate ed è particolarmente utile per identificare rari eventi knoc...

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Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare Anna Hindes della Washington University School of Medicine per i suoi sforzi iniziali nell'ottenere DNA genomico spermatico di buona qualità utilizzando il metodo hot shot. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institutes of Health under Award (R01AR072009 to R.S.G.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Polvere di agarosio Fisher BioReagentsBP1356-100
Vasche di allevamentoCarolina Biological 
Enzima di restrizione BstNINEBR0168S
Cas9 EndonucleasiIDT1081060
Scala del DNA, 100 bp Thermo Scientific 
costrutto donatore dnah10  Sigma-AldrichDNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, dry.
Legame fosforotioato sul donatore ai primi tre legami fosfato su entrambe le estremità 5' e 3' (5'-CCTCTCTCCCTTTCAGAAGCTTC
TGCTCATCCGCTGCTCTGCCCTGCCT
GGACCGAGTGTACCGTGCCGTGTGTGTGTGTCTC
AGTGATTACGTCACGC-3')
dnah10 primer in avanti Sigma-AldrichDNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CATGGAACTCTTTCCTAATGAGT
TTGGC-3')
dnah10 primer inverso Sigma-AldrichDNA Oligo in tubo; 0,025 nM, purificazione standard per desalinizzazione, secco ('5-AGTAGAGATCACACATCAACAGA
ATACAGC-3') 
dnah10 sgRNA sintetico Synthego SgRNA sintetico, sequenza target: 5'-GCTCATCCGCTGCTTCAGGC-3'Alimentatore
per elettroforesiThermo Scientific 105ECA-115
Pinza filtranteMilliporeXX6200006P
Pesce (sistema) acquaGenericon/a
Sistema di elettroforesi su gel (incluso telaio di colata, pettine e camera di elettroforesi) Thermo Scientific Scatola luminosa per imaging in gel B2
nbsp;Azure BiosystemsAZI200-01
Colorante in gel, 10000XInvitrogenS33102
Ciotola in vetro, 250 mLGenericon/a
Serbatoi di isolamento, 0,8 L AquaneeringZT080
Tubo capillare Microcap con bulbo, 20 & micro; L Drummond1-000-0020/CA
MinicentrifugaBio-Rad12011919EDU
Micropipette, varie con puntali appropriatiGenerico n/a
Microonde Generico n/a
Acqua priva di nucleasiPromegaP119-C
Asciugamani di cartaGenericon/a
Provette per PCR, 0,2 mLBioexpressT-3196-1
Cucchiaio di plastica, con fori/fessure Soluzione generican/a
KCl, 0,2 M RNAsi FreeSigma-AldrichP9333
p2ry12 primer in avantiSigma-AldrichDNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CCCAAATGTAATCCTGACCAGT
-3')
p2ry12 primer inversoSigma-AldrichDNA Oligo in provetta; 0,025 nM, purificazione standard di desalinizzazione, secco (5'-CCAGGAACACATTAACCTGGAT
-3') 
p2ry12 sgRNA sintetico Synthego SgRNA sintetico, sequenza bersaglio: 5'-GGCCGCACGAGGTCTCCGCG-3'Enzima
di restrizione 10X TamponeNEBB6003SVIAL
soluzione di NaOH, 50 mM Thermo Scientific S318; 424330010
Spugna, taglio da 1 pollice x 1 pollice con piccolo divot ovaleGenericon/a
StereomicroscopioZeissStemi 508
Taq polimerasi master mix, 2XPromegaM7122
TBE Buffer Concentrato, 10XVWRE442
TermociclatoreBio-Rad1861096
Carta velinaFisher Scientific06-666
Soluzione di tricaina-metanosolfonato (Sincina, MS-222), 0,016% in acqua di pesce (pH 7,0± 0,2) Syndel200-266
Tris Base, 1M (tamponato con HCl a ph 8.0) PromegaH5131
161937FERSM0241&

Riferimenti

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