Method Article

Analisi di campioni di rizoma di Cyperi grezzi e lavorati mediante cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem in ratti con dismenorrea primaria

DOI:

10.3791/64691

⸱

December 23rd, 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, viene presentata un'analisi comparativa di campioni grezzi e lavorati di rizoma di Cyperi (CR) utilizzando la spettrometria di massa tandem ad altissima prestazione per cromatografia liquida ad alta risoluzione (UPLC-MS / MS) nei ratti con dismenorrea primaria. Le variazioni dei livelli ematici dei metaboliti e dei costituenti del campione sono state esaminate tra ratti trattati con CR e CR trattati con aceto (CRV).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cyperi rhizoma (CR) è ampiamente usato in ginecologia ed è una medicina generale per il trattamento delle malattie delle donne in Cina. Poiché l'effetto analgesico della CR è potenziato dopo la lavorazione con aceto, la CR elaborata con aceto (CRV) viene generalmente utilizzata clinicamente. Tuttavia, il meccanismo con cui l'effetto analgesico è potenziato dalla lavorazione dell'aceto non è chiaro. In questo studio, la tecnica di spettrometria di massa tandem per cromatografia liquida ad altissima pressione (UPLC-MS/MS) è stata utilizzata per esaminare i cambiamenti nei livelli ematici dei costituenti esogeni e dei metaboliti tra ratti trattati con CR e ratti trattati con CRV con dismenorrea. I risultati hanno rivelato livelli diversi di 15 costituenti e due metaboliti nel sangue di questi ratti. Tra questi, i livelli di (-)-mirtenolo e acido [(1R,2S,3R,4R)-3-idrossi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]ep-2-il]acetico nel gruppo CRV erano considerevolmente più alti rispetto al gruppo CR. Il CRV ha ridotto il livello di prostanoidi della serie 2 e dei leucotrieni della serie 4 con attività proinfiammatorie, di aggregazione piastrinica e di vasocostrizione e ha fornito effetti analgesici modulando il metabolismo dell'acido arachidonico e dell'acido linoleico e la biosintesi degli acidi grassi insaturi. Questo studio ha rivelato che la lavorazione dell'aceto migliora l'effetto analgesico della CR e contribuisce alla nostra comprensione del meccanismo d'azione del CRV.

Introduction

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La dismenorrea primaria (PD) è la condizione più diffusa in ginecologia clinica. È caratterizzata da mal di schiena, gonfiore, dolore addominale o disagio prima o durante le mestruazioni senza patologia pelvica nel sistema riproduttivo1. Un rapporto sulla sua prevalenza ha mostrato che l'85,7% degli studenti soffre di PD2. I contraccettivi orali a basso dosaggio sono la terapia standard, ma i loro effetti collaterali avversi, come la trombosi venosa profonda, hanno attirato una crescente attenzione3. La prevalenza della trombosi venosa profonda tra gli utilizzatori di contraccettivi orali è di >1 per 1.000 donne e il rischio è più alto durante i primi 6-12 mesi e negli utenti di età superiore ai 40 anni4.

A lungo utilizzato nella medicina tradizionale cinese (MTC), Cyperi rhizoma (CR) deriva dal rizoma essiccato del Cyperus rotundus L. della famiglia delle Cyperaceae. La CR regola i disturbi mestruali e allevia la depressione e il dolore5. La CR è ampiamente usata in ginecologia ed è considerata una medicina generale per il trattamento delle malattie femminili6. La CR trattata con aceto (CRV) è tipicamente utilizzata clinicamente. Rispetto alla CR, la CRV mostra una maggiore regolazione delle mestruazioni e del sollievo dal dolore. Studi moderni hanno dimostrato che la CR inibisce la cicloossigenasi-2 (COX-2) e la successiva sintesi delle prostaglandine (PG), ottenendo così un effetto antinfiammatorio. Nel frattempo, CR mostra un effetto analgesico senza effetti collaterali7, rendendo CR una buona scelta per i pazienti con dismenorrea. Tuttavia, il meccanismo alla base della regolazione delle mestruazioni e della fornitura di sollievo dal dolore da parte della CRV non è chiaro. La ricerca sulla CR si è concentrata principalmente sui cambiamenti nei suoi componenti chimici attivi e nelle attività farmacologiche, come i suoi effetti antinfiammatori, antidepressivi e analgesici 8,9,10,11,12.

Sebbene gli ingredienti della MTC siano complessi, vengono assorbiti nel sangue e devono raggiungere una concentrazione ematica specifica per essere efficaci13. L'ambito dello screening dei principi attivi della MTC può essere ristretto utilizzando la strategia di determinazione dei costituenti nel sangue. La cecità può essere evitata nello studio dei componenti chimici in vitro e l'unilateralità può essere evitata nello studio dei singoli costituenti14. Confrontando le composizioni di CR e CRV nel sangue, i cambiamenti nei principi attivi della CR elaborata possono essere rilevati in modo efficace e rapido. L'efficacia del farmaco è il processo attraverso il quale un farmaco influenza il corpo. I cambiamenti nei componenti del farmaco dovuti alla risposta metabolica del corpo, che possono essere correlati al meccanismo d'azione del farmaco, possono essere determinati con la metabonomia. La metabonomica mira a misurare le risposte metaboliche complessive e dinamiche, il che è coerente con la determinazione dell'efficacia complessiva della medicina tradizionale cinese15. Inoltre, i metaboliti sono il prodotto finale dell'espressione genica, che è più strettamente correlata ai fenotipi16. Pertanto, la metabonomica può essere adatta per esplorare le differenze nelle vie metaboliche tra CR e CRV nel trattamento della malattia di Parkinson. La metabolomica non mirata basata sulla cromatografia liquida tandem ad alta risoluzione (LC-MS/MS) è caratterizzata da elevata produttività, alta sensibilità e alta risoluzione e può essere utilizzata per misurare molti diversi piccoli componenti molecolari17,18 . Questo metodo può determinare simultaneamente i metaboliti endogeni e i costituenti esogeni assorbiti nel sangue. La metabonomica è stata ampiamente utilizzata negli studi su MTC19, tossicologia dei farmaci 20, gestione della salute 21, sport22, cibo 23 e altri campi.

In questo studio, le differenze nei costituenti esogeni assorbiti nel sangue e nei metaboliti endogeni sono state misurate tra ratti modello di dismenorrea trattati con CRV e dismenorrea trattati con CRV utilizzando metabolomica non mirata basata su LC-MS / MS per rivelare i meccanismi degli effetti analgesici del CRV.

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Protocol

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Tutti gli esperimenti relativi agli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato etico degli esperimenti dell'Istituto di MTC di Chongqing. In questo esperimento sono stati utilizzati ventiquattro ratti femmina di Sprague Dawley (SD) che avevano 8-10 settimane e pesavano 200 g ± 20 g.

1. Preparazione dell'estrazione

  1. Calcolo
    1. Pianificare la somministrazione dell'estratto di CR o CRV a un gruppo di trattamento di sei ratti Sprague-Dawley (10 g/[kg∙giorno]) per 3 giorni. Utilizzare una concentrazione di estratto CR o CRV di 1 g / ml (1 ml dell'estratto è ottenuto da 1 g di erbe).
      NOTA: Il dosaggio di CR è 6-10 g. In questo studio, la dose massima di 10 g è stata utilizzata come dosaggio. Poiché il peso medio di una persona adulta è di 60 kg, la dose per adulti è di 0,1667 g/kg. Secondo l'algoritmo di conversione del peso24, poiché il coefficiente di conversione della dose tra uomo e ratto è 6,3, il dosaggio per i ratti è di 1,05 g / kg. Il dosaggio del farmaco è stato aumentato di 10 volte a 10,5 g / kg per i ratti. Il dosaggio è stato fissato a 10 g / kg per comodità di calcolo e l'esperimento effettivo. Ad esempio, secondo il calcolo, se è necessario un totale di 36 g di CR o CRV, la fitoterapia cinese dovrebbe essere preparata almeno due volte. Pertanto, sono stati necessari 200 g di CR: 100 g di CR sono stati utilizzati come CR e 100 g di CR sono stati trasformati in CRV.
    2. Calcolare il volume di CR o CRV da applicare per ratto utilizzando l'equazione (1):
      V = 10 g/(kg∙giorno) × 200 g/(1 g/ml) = 2 mL (1)
  2. Elaborazione del CRV
    1. Mescolare accuratamente 100 g di CR e 20 g di aceto (>5,5 g di acido acetico/100 ml) e incubare per 12 ore.
      NOTA: Per garantire che l'interno del CR fosse inumidito dall'aceto dopo 12 ore, il CR e l'aceto sono stati mescolati, mescolati bene e poi mescolati di nuovo fino a quando la parte interna era umida.
    2. Soffriggere il composto in una padella di ferro per 10 minuti a 110-120 °C. Quindi, estrarre il composto e lasciarlo raffreddare a temperatura ambiente.
      NOTA: Per evitare che il CR si scotti, è necessario mescolare continuamente durante il riscaldamento. Se il CRV trattato è troppo umido, può essere essiccato a 60 °C. Quando la superficie del CR è seppia, la frittura può essere interrotta.
  3. Estrazione
    1. Estratto di CR
      1. Aggiungere 10 volte (la quantità di CR) acqua pura al CR e immergere per 2 ore. Assicurarsi che i materiali medicinali siano al di sotto del livello del liquido durante l'immersione.
        NOTA: Il CR deve essere tagliato a metà solo prima dell'estrazione. Lo scopo dell'ammollo è quello di estrarre i costituenti attivi in modo più efficace. Il processo di ammollo è essenziale.
      2. Portare a ebollizione la miscela di acqua e medicine a fuoco alto e tenerla bollente a fuoco basso per 20 minuti. Filtrare con un panno filtrante (100 maglie) e raccogliere il filtrato.
        NOTA: Durante il decotto, è stato utilizzato un calore elevato prima dell'ebollizione e un calore basso è stato utilizzato per mantenere l'ebollizione.
      3. Ripetere una volta il punto 1.3.1.2 e unire i filtrati.
      4. Concentrare l'estratto con un evaporatore rotante a 1 g/mL (in base al medicinale originale, la temperatura di concentrazione deve essere inferiore a 60 °C).
        NOTA: I componenti attivi in CR sono volatili, quindi la temperatura di concentrazione non deve essere superiore a 60 °C.
    2. Estratto di CRV
      1. Eseguire gli stessi passaggi (1.3.1.1-1.3.1.3) del metodo di estrazione CR.
    3. Estratto di CR per test
      1. Pipettare 500 μL di estratto CR e 500 μL di metanolo in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e vortice per 30 s da miscelare.
        NOTA: Una miscela di metanolo e acqua estrae meglio i componenti attivi. L'estratto non deve essere filtrato direttamente per il test.
      2. Centrifugare ogni campione per 15 minuti a 1,6502 × g a 4 °C. Filtrare il surnatante, quindi trasferirlo nel flaconcino del campione per il test.
        NOTA: Dopo la centrifugazione ad alta velocità della miscela di metanolo ed estratto, il surnatante può essere trasferito direttamente al flacone del campione per la determinazione senza filtrazione. A causa del calore generato dal processo di centrifugazione, è preferibile utilizzare una centrifuga criogenica.
    4. Estratto di CRV per test
      1. Eseguire i passaggi 1.3.3.1-1.3.3.2 per preparare l'estratto CRV per il test.

2. Animali

  1. Calcolo
    1. Prendere 50 mg di estradiolo benzoato e aggiungerlo a 50 ml di olio d'oliva per preparare una soluzione da 1 mg / ml. Prendere 50 mg di ossitocina e aggiungerli a 50 ml di soluzione salina normale per preparare una soluzione da 1 mg/ml.
      NOTA: La dose dell'iniezione intraperitoneale di estradiolo benzoato e ossitocina è di 10 mg/(kg∙die). L'estradiolo benzoato viene sciolto nell'olio d'oliva e l'ossitocina viene sciolta nella normale soluzione salina. L'estradiolo benzoato non è facile da sciogliere nell'olio d'oliva e può essere trattato con ultrasuoni per accelerare la dissoluzione. Sia le soluzioni di estradiolo benzoato che di ossitocina devono essere preparate quotidianamente.
    2. Calcolare il volume di soluzione di estradiolo benzoato da applicare per ratto (cioè V = 10 mg/[kg∙giorno] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Calcolare il volume della soluzione di ossitocina da applicare per ratto (cioè V = 10 mg/[kg∙giorno] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Raggruppamento e somministrazione degli animali
    NOTA: Dieci giorni sono stati assegnati per la somministrazione25,26. Durante il trattamento, i ratti avevano accesso illimitato al chow e all'acqua standard. Entro 30 minuti dalla somministrazione di ossitocina, è stata monitorata l'attività di contorcersi di ciascun ratto. Il modello di ratto PD è stato sviluppato con successo, come evidenziato dalle risposte di torsione dei ratti modello, che includevano la contrazione uterina, la rotazione di un arto, l'estensione degli arti posteriori, un tronco cavo e la contrazione addominale26.
    1. Assegnare 24 femmine di ratto Sprague-Dawley (ratti SD, 8-10 settimane di età, del peso di 200 g ± 20 g) in quattro gruppi a controllo casuale, modello, CR e CRV e nutrirli per 7 giorni.
    2. Somministrazione animale
      1. Iniettare per via intraperitoneale ratti nei gruppi modello, CR e CRV con 2 ml di soluzione di estradiolo benzoato ogni giorno. Iniettare per via intraperitoneale i ratti nel gruppo di controllo con 2 ml di soluzione salina normale.
      2. Dal giorno 8, completare il passaggio 2.2.2.1. Quindi, somministrare per via intragastrica 2 ml di estratto di CRV ai ratti nel gruppo CRV, 2 ml di estratto di CR ai ratti nel gruppo CR e 2 ml di soluzione salina normale ai ratti nei gruppi di controllo e modello.
      3. Il giorno 10, completare il passaggio 2.2.2.2. Quindi, iniettare per via intraperitoneale i ratti nei gruppi modello, CR e CRV con 2 ml di soluzione di ossitocina e i ratti nel gruppo di controllo con 2 ml di soluzione salina normale.
    3. Registrare i tempi di contorcersi dei ratti entro 30 minuti dall'iniezione di ossitocina.
  3. Raccolta di campioni
    1. Raccogliere campioni di sangue dell'aorta addominale, asportare l'utero rapidamente e completamente e separare accuratamente il tessuto connettivo e il grasso aderente alla parete uterina.
      NOTA: Il sangue è stato raccolto il più vicino possibile entro 1 ora dopo l'ultima dose.
    2. Utilizzare tubi di microcentrifuga per preservare e trasferire il tessuto uterino in azoto liquido. Conservare i campioni di tessuto a -80 °C.
    3. Centrifugare i campioni di sangue per 10 minuti a 4.125 × g. Rimuovere il surnatante contenente siero e centrifugare a 16.502 × g per 10 minuti a 4 °C. Centrifugare il siero e tenerlo nel tubo a -80 °C per la conservazione.
      NOTA: I campioni di sangue devono essere lasciati a temperatura ambiente per 1 ora per il ritrattamento.
  4. Elaborazione dei campioni
    1. Campioni di siero
      1. Mettere 400 μL di metanolo e 200 μL di siero in una provetta da microcentrifuga e vortice per 30 s per mescolare. Centrifugare ogni campione per 15 minuti a 16.502 × g a 4 °C. Riempire i flaconi campione con il surnatante dopo la raccolta e la filtrazione. Mescolare tutti i surnatanti di ciascun campione con lo stesso volume per preparare i campioni di controllo qualità per i test.
    2. Campioni di tessuto uterino
      1. Prendi 100 mg di tessuto uterino dal segmento omolaterale e macinalo con un volume nove volte superiore di soluzione salina normale. Centrifugare l'omogenato per 10 minuti a 4.125 × g e raccogliere il surnatante. Porre il surnatante in frigorifero a 4 °C per la prova o a -80 °C se non deve essere sottoposto a prova lo stesso giorno.
      2. Posizionare le normali sfere saline, di tessuto e di acciaio in una provetta da microcentrifuga da 2 ml, mettere la provetta della microcentrifuga in azoto liquido per 3-5 s, quindi mettere il tessuto in una smerigliatrice per tessuti per la macinazione.
  5. Test a campione
    1. Utilizzare un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) per misurare il contenuto di PGF2α e PGE2 nei tessuti uterini dei campioni di ratto.
      NOTA: Il kit PGE 2 ELISA del ratto è stato utilizzato per misurare il contenuto di PGE 2 e il kit PGF 2α ELISA del ratto è stato utilizzato per misurare il livello di PGF2α. I passaggi dettagliati possono essere trovati nelle istruzioni del produttore. I dettagli del kit sono riportati nella tabella dei materiali.
    2. Valutare il campione di siero, l'estratto di CR e l'estratto di CRV utilizzando UPLC-MS / MS.
      1. Per UPLC, utilizzare una colonna C18 (2,6 μm, 2,1 mm x 100 mm) e un metodo a gradiente binario con fase mobile A contenente acido formico allo 0,1% e fase mobile B contenente acetonitrile. Impostare il gradiente di eluizione come segue: da 0 min a 1 min, 15% B; da 1 min a 8,5 min, dal 15% all'85% B; da 8,5 min a 11,5 min, 85% B; da 11,5 min a 11,6 min, dal 99% all'1% B; e da 11,6 min a 15 min, 15% B. Impostare la portata su 0,35 mL/min e il volume di iniezione su 2 μL.
      2. Per MS, impostare la temperatura su 600 °C, la portata del gas a tenda (CUR) su 0,17 MPa e la guaina e la portata del gas ausiliario su 0,38 MPa. Impostare la tensione di spruzzatura ionica del modo ione positivo e del modo ione negativo su 5,5 kV e -4,5 kV, rispettivamente, la tensione del potenziale di declustering (DP) su 80 V o -80 V, l'energia di collisione (CE) su 40 eV o -25 eV e la sovrapposizione dell'energia di collisione (CES) su 35 eV ± 15 eV.
      3. Eseguire il test seguendo il protocollo del produttore utilizzando UPLC-MS/MS. Eseguire MS per un intervallo di massa di 50-1.000 m/z.
      4. Ottenere i risultati UPLC-MS/MS utilizzando il programma workstation corrispondente in combinazione con l'acquisizione dipendente dalle informazioni della modalità di rilevamento, il filtro per difetti di massa multipli e la deduzione dinamica in background. Utilizzare i campioni di controllo qualità del siero aggregato per testare la ripetibilità e la stabilità delle apparecchiature UPLC-MS/MS per verificare l'approccio convenzionale. Prima dei campioni di ricerca, iniettare i campioni di controllo qualità per quattro cicli successivi e quindi iniettarli dopo ogni cinque campioni di siero.

3. Trattamento dei dati

  1. Preparazione dei dati
    1. Utilizzare il software di conversione per convertire i dati grezzi nel formato mzXML. Normalizzare i dati di corrente ionica totale (TIC) di ciascun campione.
      NOTA: un'applicazione interna basata su R (www.lims2.com) basata su XCMS è stata utilizzata per analizzare le informazioni per l'integrazione, l'allineamento, l'estrazione e il rilevamento dei picchi27.
    2. Eseguire l'annotazione dei metaboliti utilizzando un database MS2 proprietario (www.lims2.com). Impostare la soglia di annotazione su 0,328.
      NOTA: I metaboliti endogeni sono stati identificati in ciascun gruppo.
  2. Analisi delle componenti principali e analisi ortogonale parziale del discriminante del minimo quadrato
    1. Utilizzare il software di analisi per eseguire l'analisi dei componenti principali (PCA) e la modellazione. Importare i dati standardizzati dei metaboliti nel software di analisi. Utilizzare quindi l'adattamento automatico per compilare il modello di analisi. Infine, utilizzare il punteggio per ottenere il grafico a dispersione del punteggio della PCA.
      NOTA: Il raggruppamento di ciascun gruppo è stato ottenuto con il grafico a dispersione del punteggio della PCA. PCA è una modalità di analisi non supervisionata che raggruppa principalmente i campioni attraverso la riduzione dimensionale senza intervento.
    2. Utilizzare il software di analisi per eseguire l'analisi ortogonale parziale del discriminante del minimo quadrato (OPLS-DA).
      1. Importare i dati standardizzati sui metaboliti nei gruppi CR e CRV nel software di analisi.
      2. Importare i dati dal gruppo CR nel gruppo CR creato e importare i dati dal gruppo CRV nel gruppo CRV creato.
        NOTA: OPLS-DA è una modalità di analisi supervisionata ed è necessario raggruppare i campioni.
      3. Quindi, utilizzare l'adattamento automatico per creare il modello di analisi e utilizzare il punteggio per ottenere il grafico a dispersione del punteggio di OPLS-DA. Infine, utilizzare VIP per ottenere la significatività variabile nel valore di proiezione (VIP) nell'OPLS-DA.
        NOTA: La significatività variabile nei valori di proiezione (VIP) dei metaboliti nei gruppi CR e CRV è stata ottenuta attraverso l'OPLS-DA.
  3. Identificazione dei potenziali metaboliti differenziali
    1. Escludere i metaboliti con valori VIP superiori a 1 al punto 3.2.2.3.
    2. Utilizzare un software statistico per calcolare il valore P dei metaboliti che sono stati selezionati nel passaggio 3.3.1 dal test t di Student.
      NOTA: Differenze significative nei potenziali metaboliti differenziali nei gruppi CR e CRV sono state determinate da un test t di Student. I potenziali metaboliti differenziali erano quelli con un valore p del test t di Student < 0,05 e una significatività variabile nella proiezione (VIP) maggiore di 1. La rappresentazione è stata realizzata utilizzando un appezzamento vulcanico.
  4. Identificazione dei metaboliti differenziali
    1. Escludere i potenziali metaboliti differenziali nella fase 3.3. Utilizzare i risultati del punto 3.1.2 per identificare questi metaboliti differenziali.
      NOTA: È stato identificato un piccolo numero di potenziali metaboliti differenziali che sono diventati i metaboliti differenziali candidati.
    2. Escludere i metaboliti differenziali da abbinare nella banca dati KEGG. Mostra i cambiamenti nei metaboliti differenziali nei gruppi CR e CRV disegnando una mappa di calore.
      NOTA: Un piccolo numero di metaboliti differenziali candidati sono stati abbinati e sono diventati i metaboliti differenziali.
  5. Esame delle potenziali vie metaboliche
    1. Carica i diversi metaboliti nel database Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Utilizzare l'analisi dei percorsi per ottenere le potenziali vie metaboliche.
      NOTA: Le potenziali vie metaboliche sono state ottenute nei gruppi CR e CRV. Il valore P e il valore di impatto sono stati due indicatori molto importanti nella selezione dei percorsi critici. Il valore P era più importante del valore di impatto. La significatività era definita da un valore P < 0,05; Valori di impatto più elevati sono stati associati a migliori correlazioni.
    3. Analizzare le potenziali vie metaboliche caricando i diversi metaboliti nel database KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      NOTA: Deve essere considerata anche la relazione tra la funzione della via metabolica e la malattia di Parkinson. Sono state ottenute le vie metaboliche critiche.
  6. Identificazione dei costituenti assorbiti nel sangue
    1. Identificare i costituenti chimici negli estratti CR e CRV utilizzando il database MS2 interno (www.lims2.com), il database del metaboloma umano (HMDB) e i database Massbank e Chemspider.
    2. Determinare i costituenti assorbiti nel sangue nei gruppi CR e CRV e confrontare i costituenti tra i gruppi CR e CRV.
      NOTA: I costituenti assorbiti nel sangue devono essere rilevati nei gruppi CR o CRV ma non possono essere rilevati nel gruppo di controllo.
  7. Analisi statistica
    1. Analizzare i dati utilizzando l'analisi univariata (UVA) e metodi statistici multivariati, tra cui l'analisi della varianza (ANOVA) e il test t di Student.
      NOTA: Le informazioni sperimentali sono state presentate utilizzando un software statistico come media ± deviazione standard (±SD). P < 0,01 era considerato una differenza altamente significativa e P < 0,05 rappresentava una differenza significativa28.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analisi dell'esperimento modello di dismenorrea
Non c'è stata alcuna risposta di contorsione entro 30 minuti nel gruppo di controllo perché questi ratti non sono stati iniettati per via intraperitoneale con ossitocina ed estradiolo benzoato per causare dolore. I ratti nei gruppi modello, CR e CRV hanno mostrato sostanziali reazioni di contorcersi dopo l'iniezione di ossitocina. Questi risultati dimostrano l'efficacia della combinazione di estradiolo benzoato e ossitocina per indurre dismenorrea. Le di...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A causa della grande varietà e della diversa natura dei TCM, queste erbe a volte non funzionano nella pratica clinica, e questo può essere dovuto alla lavorazione e al decotto inappropriati dei TCM. I meccanismi della MTC stanno diventando più evidenti con l'uso della scienza e della tecnologia contemporanee29,30. Questo studio mostra che sia la CR che la CRV hanno effetti terapeutici nei ratti modello PD e che l'effetto terapeutico del CRV è più sostanziale. Il ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Commissione municipale per la salute e la pianificazione familiare di Chongqing Progetto di scienza e tecnologia della medicina cinese (numero di progetto: ZY201802297), Progetto generale della Fondazione di scienze naturali di Chongqing (Numero progetto: cstc2019jcyj-msxmX065), Piano di team building per l'innovazione del sistema di innovazione del sistema di innovazione della zona montuosa moderna di Chongqing 2022 [10] e Progetto di costruzione della disciplina chiave della Commissione sanitaria municipale di Chongqing di Chinese Materia Elaborazione Medica.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Acetonitrile Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20Beckman  Coulter, Inc.
Estradiolo benzoatoShanghai Macklin Biochemical Co., LtdC10042616
acido formicoFisher Scientific, Pittsburg, PA, USA177799
LC 30A systemShimadzu, Kyoto, Giappone228-45162-46
Olio d'olivaShanghai Yuanye Biotechnology Co., LtdH25A11P111909
Ossitocina sinteticaFornitore verificato - Zhejiang peptide biology Co., Ltd 
Rat PGF2α Kit ELISA Shanghai lmai Bioengineering Co., Ltd202101
Rat PGFE2 Kit ELISAShanghai lmai Bioengineering Co., LtdEDL202006217
SPF Sprague-Dawley rattiHunan SJA Laboratory Animal Co., LtdNumero di certificato SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
Sistema Triple TOF 4600SCIEX, Framingham, MA, USABK20641402
acquaFisher Scientific, Pittsburg, PA, USA152720
MRZ15K0472019092001

References

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