Studiare l'assuefazione in Stentor coeruleus

Sommario

Introduciamo un metodo per quantificare l'assuefazione di Stentor utilizzando un apparato collegato alla scheda di microcontrollore in grado di fornire impulsi meccanici a una forza e una frequenza specificate. Includiamo anche metodi per assemblare l'apparato e impostare l'esperimento in modo da ridurre al minimo le perturbazioni esterne.

Abstract

L'apprendimento è solitamente associato a un sistema nervoso complesso, ma vi è una crescente evidenza che la vita a tutti i livelli, fino alle singole cellule, può mostrare comportamenti intelligenti. Sia nei sistemi naturali che in quelli artificiali, l'apprendimento è l'aggiornamento adattivo dei parametri del sistema basato su nuove informazioni e l'intelligenza è una misura del processo computazionale che facilita l'apprendimento. Stentor coeruleus è un organismo unicellulare che vive in uno stagno che mostra assuefazione, una forma di apprendimento in cui una risposta comportamentale diminuisce a seguito di uno stimolo ripetuto. Lo stentor si contrae in risposta alla stimolazione meccanica, che è un'apparente risposta di fuga dai predatori acquatici. Tuttavia, ripetute perturbazioni a bassa forza inducono assuefazione, dimostrata da una progressiva riduzione della probabilità di contrazione. Qui, introduciamo un metodo per quantificare l'assuefazione di Stentor utilizzando un apparato collegato alla scheda di microcontrollore in grado di fornire impulsi meccanici a una forza e frequenza specificate, compresi i metodi per costruire l'apparato e impostare l'esperimento in modo da ridurre al minimo le perturbazioni esterne. In contrasto con gli approcci precedentemente descritti per stimolare meccanicamente Stentor, questo dispositivo consente di variare la forza di stimolazione sotto il controllo del computer durante il corso di un singolo esperimento, aumentando così notevolmente la varietà di sequenze di input che possono essere applicate. Comprendere l'assuefazione a livello di una singola cellula aiuterà a caratterizzare paradigmi di apprendimento indipendenti da circuiti complessi.

Introduzione

L'apprendimento è solitamente associato a un sistema nervoso complesso, ma vi è una crescente evidenza che la vita a tutti i livelli, fino alle singole cellule, può mostrare comportamenti intelligenti. Sia nei sistemi naturali che in quelli artificiali, l'apprendimento è l'aggiornamento adattivo dei parametri del sistema basato su nuove informazioni¹, e l'intelligenza è una misura del processo computazionale che facilita l'apprendimento².

Stentor coeruleus è un organismo unicellulare che vive in uno stagno che mostra assuefazione, una forma di apprendimento in cui una risposta comportamentale diminuisce a seguito di uno stimolo ripetuto³. Lo stentor si contrae in risposta alla stimolazione meccanica³, che è un'apparente risposta di fuga dai predatori acquatici. Tuttavia, ripetute perturbazioni a bassa forza inducono assuefazione, dimostrata da una progressiva riduzione della probabilità di contrazione³. Lo Stentor abituato si contrae ancora dopo aver ricevuto la stimolazione meccanica ad alta forza⁴ o la stimolazione fotica⁵. Queste osservazioni, che si allineano con i criteri classici di Thompson e Spencer per l'assuefazione negli animali⁶, suggeriscono fortemente che il decremento della risposta contrattile originale è dovuto all'apprendimento piuttosto che alla fatica o all'esaurimento dell'ATP. Come cellula a vita libera, Stentor può essere studiato senza troppe interferenze da parte delle cellule circostanti, come sarebbe il caso in un tessuto multicellulare. Diverse caratteristiche aggiuntive rendono Stentor un sistema trattabile per lo studio dell'apprendimento: le sue grandi dimensioni (1 mm), la sua risposta di assuefazione quantificabile³, la facilità di iniezione e micromanipolazione⁷, il^{genoma 8} completamente sequenziato e la disponibilità di strumenti di interferenza dell'RNA (RNAi)⁹. L'utilizzo di questo organismo modello per esplorare l'apprendimento cellulare senza cervello o sistema nervoso richiede una procedura riproducibile per stimolare le cellule Stentor e misurare la risposta.

Qui, introduciamo un metodo per quantificare l'assuefazione di Stentor utilizzando un apparato collegato alla scheda di microcontrollore in grado di fornire impulsi meccanici a una forza e frequenza specificate, compresi i metodi per costruire l'apparato e impostare l'esperimento in modo da ridurre al minimo le perturbazioni esterne (Figura 1). Comprendere l'assuefazione a livello di una singola cellula aiuterà a caratterizzare paradigmi di apprendimento indipendenti da circuiti complessi.

Figura 1: Impostazione dell'esperimento di assuefazione. La piastra di Petri contenente Stentor è posizionata sopra il righello metallico flessibile del dispositivo di abituazione. L'armatura del dispositivo di assuefazione colpisce quindi il righello metallico a una forza e frequenza specificate, producendo un'onda di stimolo attraverso il campo delle cellule. La fotocamera del microscopio USB registra le risposte dello stentor alla stimolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Riepilogo del flusso di lavoro dell'esperimento di assuefazione. La figura mostra i passaggi fondamentali coinvolti nello studio di Stentor utilizzando il dispositivo di assuefazione. La figura è stata creata con BioRender.com. Adattato da "Process Flowchart", di BioRender.com (2022). Estratto da https://app.biorender.com/biorender-templates. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Protocollo

NOTA: un riepilogo del flusso di lavoro dell'esperimento di assuefazione è illustrato nella Figura 2.

1. Montaggio del dispositivo di assuefazione

1. Agganciare il driver del motore al motore (vedere la Figura 3).
   1. Collegare i due fili etichettati A dalla scheda driver ai fili blu e rosso sul motore. Collegare i due fili etichettati B dalla scheda driver ai fili verde e nero sul motore.
      NOTA: guardando in basso sulla scheda driver dall'alto con i fili del motore in alto, i quattro fili di ingresso devono essere collegati ai cavi del motore in questo ordine: blu, rosso, nero e verde.
2. Costruire il circuito breadboard mostrato in Figura 4, con particolare attenzione a collegare i LED nella polarità corretta.
3. Collegare il Vcc (+5 V) dalla scheda del conducente alla guida superiore della breadboard bianca e il Gnd dalla scheda driver alla guida inferiore della breadboard.
4. Collegare la massa della breadboard al pin di massa della scheda del microcontroller. Collegare rispettivamente i cavi LED verde, LED rosso, interruttore e pulsante ai pin digitali 8, 9, 10 e 11 della scheda microcontroller.
5. Collegare i pin digitali della scheda microcontrollore 2 e 3 ai fili della scheda driver Step e Dir.
6. Collegare i pin digitali 4, 5, 6 e 7 della scheda microcontroller ai cavi della scheda driver.
   1. Collegare il Pin 4 a MS1, collegare il Pin 5 a MS2, collegare il Pin 6 a MS3 e collegare il Pin 7 ad Abilita.
7. Alimentare la scheda driver con un alimentatore a 12 V. Collegare l'alimentazione a 12 V alla spina dell'adattatore nero/verde collegata da due fili rossi alla scheda del driver del motore.
   NOTA: non collegare l'alimentazione a 12 V alla spina della scheda del microcontrollore.
8. Scaricare il programma di controllo (https://github.com/WallaceMarshallUCSF/StentorHabituation/blob/main/stentor_habituator_stepper_v7.ino) sulla scheda del microcontrollore.
9. Utilizzare un cavo USB per collegare la scheda del microcontroller a un computer, che fungerà anche da fonte di alimentazione per la scheda del microcontroller.
10. Verificare che i controlli utente funzionino.
    1. Verificare che l'interruttore a scorrimento attivi e spenga la modalità automatica. In modalità automatica, il sistema eseguirà un passo a intervalli regolari specificati dall'utente (vedi sotto).
    2. Verificare che il LED verde si accenda quando la modalità automatica è attiva.
    3. Verificare che il LED rosso lampeggi 1 s prima che il motore applichi un impulso. Il LED rosso è una spia luminosa che indica quando il sistema sta per emettere un impulso meccanico.
    4. Testare il pulsante rosso, che attiva un micropasso di 1/16 ogni volta che il pulsante viene premuto, indipendentemente dal fatto che il sistema sia in modalità automatica.

Figura 3: Componenti del dispositivo di abituazione. Tutta l'elettronica etichettata è necessaria per assemblare la macchina. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Schema dell'elettronica. Questo è il circuito sulla breadboard. I fili che si collegano alla scheda del microcontrollore sono numerati come descritto nel protocollo. D1 e D2 sono rispettivamente i LED rosso e verde e sono collegati a terra tramite resistori da 330 Ω. I due interruttori sono tirati su con resistori da 10 KΩ. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

2. Impostazione dell'esperimento di assuefazione

1. Ottenere Stentor.
2. Rivestire una piastra da 35 mm con una soluzione di poli-ornitina allo 0,01%.
   1. Aggiungere 3 ml della soluzione di poli-ornitina allo 0,01% nella piastra e lasciare per una notte.
   2. Lavare la piastra due volte con acqua ultrapura e una volta con acqua di sorgente pastorizzata (PSW) (Tabella dei materiali).
3. Aggiungere 3,5 ml di PSW alla piastra da 35 mm.
4. Lavare lo stentor in una piastra a 6 pozzetti (tabella dei materiali).
   1. Aggiungere 3 ml di PSW al primo pozzetto e 5 mL di PSW al secondo e terzo pozzetto. Utilizzare una pipetta P1.000 per aggiungere 2 ml di Stentor da un piatto di coltura al primo pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
   2. Identificare il singolo Stentor con un microscopio stereo (Table of Materials) e quindi utilizzare una pipetta P20 per trasferire 100 Stentor dal primo pozzetto al secondo pozzetto.
   3. Identificare il singolo Stentor con un microscopio stereo e quindi utilizzare una pipetta P20 per trasferire 100 Stentor dal secondo pozzetto al terzo pozzetto.
5. Utilizzare una pipetta P200 per trasferire 100 Stentor in un volume totale di 500 μL dal terzo pozzetto della piastra a 6 pozzetti alla piastra da 35 mm in modo tale che il volume finale nella piastra da 35 mm sia di 4 ml.
6. Fissare un pezzo (7 cm x 7 cm) di carta bianca sul righello metallico sul dispositivo di abituazione. Assicurarsi che il bordo sinistro della carta si trovi a 2 cm dall'estremità del righello più vicina all'armatura.
7. Utilizzare del nastro biadesivo per far aderire il fondo della piastra da 35 mm al centro del 2 in x 2 in carta sopra il righello sul dispositivo di abitudine.
8. Lasciare la piastra da 35 mm sul dispositivo di assuefazione per almeno 2 ore (questo può essere esteso a tutta la notte) con il coperchio chiuso. Durante questo periodo di acclimatazione, mantenere la piastra in condizioni di luce ambientale che corrispondano alle condizioni di luce sperimentali (cioè, non sottoporre le celle a fluttuazioni di luce / buio). Inoltre, assicurarsi che la piastra non subisca perturbazioni meccaniche dovute a spintoni accidentali.
9. Centrare la fotocamera del microscopio USB (Table of Materials) direttamente sopra la piastra da 35 mm di Stentor. Se necessario, posizionare un puntello come una scatola di punta per pipette sotto la fotocamera del microscopio USB (Universal Serial Bus) per regolare l'altezza. In alternativa, è possibile utilizzare un supporto ad anello per regolare l'altezza.
10. Installare l'applicazione Webcam recorder su un laptop (Table of Materials) e utilizzarla per visualizzare le cellule tramite l'ingresso del microscopio.
    1. Apri l'app Registratore webcam e seleziona il microscopio USB dal menu a discesa. Regolare la messa a fuoco sulla fotocamera del microscopio USB in modo che le celle siano chiaramente visibili.
    2. Regolare la posizione della fotocamera del microscopio USB per massimizzare il numero di celle nel campo visivo.
11. Aprire il monitor seriale della scheda microcontroller: selezionare No Line Ending e impostarlo su 9.600 baud.
12. Utilizzare il comando l sul programma della scheda del microcontrollore per abbassare l'armatura fino a quando non tocca a malapena il righello. Utilizzare il comando r per sollevare il braccio, se necessario, per regolare la posizione esatta.
    NOTA: se l'armatura si trova a una distanza significativa dal righello, digitare il comando d per disattivare la corrente della bobina del motore in modo che il braccio possa essere spostato manualmente verso il righello. Dopo aver spostato manualmente il braccio, utilizzare il comando e per abilitare la corrente della bobina del motore e mantenere il braccio bloccato in posizione. Se correttamente abbassato prima dell'inizio di un esperimento, la punta inferiore dell'armatura dovrebbe essere a 1 cm di distanza dal bordo sinistro del righello. L'armatura fornirà l'impulso meccanico colpendo il righello.
13. Utilizzare il comando i per inizializzare la modalità automatica sul dispositivo di abituazione.
14. Immettere la dimensione del passaggio nella riga di comando. Il livello 5 è il gradino più piccolo e il livello 1 è il gradino più grande. Il livello 4 è la dimensione del passo utilizzata per gli esperimenti di assuefazione di base.
    NOTA: uno stimolo di livello 5 provoca uno spostamento verso il basso del righello di ~ 0,5 mm; Il livello 4 provoca uno spostamento verso il basso di ~ 1 mm; Il livello 3 provoca uno spostamento verso il basso di ~ 2 mm; Il livello 2 provoca uno spostamento verso il basso di ~3-4 mm; e il livello 1 provoca uno spostamento verso il basso di ~ 8 mm. Uno stimolo di livello 5 si traduce in una forza di picco verso il basso dell'armatura contro il righello di ~ 0,122 N; Il livello 4 provoca una forza di picco verso il basso di ~ 0,288 N; e il livello 3 si traduce in una forza di picco verso il basso di ~ 0,557 N. Le forze verso il basso generate dal livello 1 e dal livello 2 sono più difficili da quantificare empiricamente con un dinamometro a causa delle significative oscillazioni del righello che si verificano dopo che l'armatura entra in contatto.
15. Inserisci il tempo tra gli impulsi in minuti. L'intervallo utilizzato per gli esperimenti di assuefazione al basale è di 1 min.
16. Inizia a registrare un video utilizzando l'app Webcam recorder premendo il pulsante rosso di registrazione. Quindi, premere l'interruttore sull'apparecchio di assuefazione per iniziare l'esperimento con la prima erogazione automatica di impulsi meccanici.

3. Analisi del video dell'esperimento

1. Immediatamente prima che il primo impulso meccanico appaia sul video, metti in pausa e conta il numero di Stentor che sono entrambi ancorati al fondo della piastra da 35 mm ed estesi in una forma allungata simile a una tromba (Figura 5A, Video 1).
2. Subito dopo il primo impulso, contare il numero di Stentor che sono entrambi ancorati al fondo della piastra e contratti in una forma a sfera (Figura 5B, Video 1).
   NOTA: Le cellule contratte sono facilmente distinguibili dalle cellule allungate perché Stentor riduce la loro lunghezza corporea di oltre il 50% entro 10 ms durante un evento di contrazione³.
3. Dividere il secondo conteggio per il primo conteggio per determinare la frazione di Stentor che si è contratta in risposta allo stimolo meccanico.
4. Ripetere i passaggi 3.1-3.3 per tutti gli impulsi meccanici nel video dell'esperimento.

Figura 5: Contratto dello stentore dopo aver ricevuto uno stimolo meccanico . (A) Gli stentor sono nel loro stato allungato e ancorati al fondo della piastra di Petri. (B) Lo stentor si è contratto dopo aver ricevuto una stimolazione meccanica di livello 4 dal dispositivo di assuefazione. Le immagini sono state scattate con un microscopio USB. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video 1: Video del contratto di Stentor. Lo stentor riceve uno stimolo meccanico di livello 4 dal dispositivo di assuefazione ogni minuto. Queste cellule non si sono ancora abituate, quindi si contraggono dopo aver ricevuto l'impulso. Le cellule sono nella piastra di Petri posta sopra il dispositivo di assuefazione. Clicca qui per scaricare questo video.

Risultati

Il metodo sopra descritto, utilizzando l'impulso meccanico di livello 4 ad una frequenza di 1 tap/min, dovrebbe comportare una progressiva riduzione della probabilità di contrazione dello stentor entro 1 ora. Questo è indicativo di assuefazione (vedi Figura 6, Video 2).

Figura 6: Assuefazione al basale. La probabilità di contrazione di Stentor diminuisce progressivamente nel corso di 1 ora dopo aver ricevuto impulsi meccanici di livello 4 ad una frequenza di 1 tap/min (n = 22-27). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Video 2. Video di Stentor abituato. Le cellule ricevono uno stimolo meccanico di livello 4 dopo 1 ora di ricezione di impulsi meccanici della stessa forza ad una frequenza di 1 tocco / min. La maggior parte delle cellule si sono abituate agli stimoli durante l'ora e, quindi, non si contraggono. Clicca qui per scaricare questo video.

L'alterazione della forza e/o della frequenza dell'erogazione dell'impulso meccanico può modificare la dinamica di assuefazione dello Stentor . Ad esempio, l'utilizzo dell'impulso di livello 2 ad una frequenza di 1 tocco/min preclude l'assuefazione nel corso di 1 ora (vedere la figura 7). Un impulso di livello 5 dovrebbe provocare contrazioni in pochi o zero Stentor.

Figura 7: Mancanza di assuefazione entro 1 ora per forze più forti. La probabilità di contrazione di Stentor non diminuisce sensibilmente nel corso di 1 ora dopo aver ricevuto impulsi meccanici di livello 2 ad una frequenza di 1 tap/min (n = 7-33). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

I passaggi più critici del protocollo riguardano la garanzia che lo Stentor rimanga in condizioni ottimali per il verificarsi di contrazioni. La risposta di contrazione nel saggio di assuefazione richiede che gli stentori siano ancorati a una superficie usando la loro appigliatura appiccicosa poiché raramente si contraggono quando nuotano liberamente. Tuttavia, la superficie inferiore della piastra di Petri da 35 mm utilizzata per gli esperimenti di assuefazione non è tipicamente favorevole all'ancoraggio a meno che non sia rivestita con poli-ornitina. Inoltre, lo Stentor non può essere esposto ad alcuna perturbazione meccanica per un minimo di 2 ore prima dell'inizio dell'esperimento di assuefazione perché lo Stentor dimenticando la scala temporale è di 2-6 h³. Se Stentor riceve una stimolazione meccanica entro 2 ore dall'ora di inizio dell'esperimento, esiste la possibilità che questa stimolazione precedente induca un leggero livello di assuefazione prima dell'esperimento, riducendo così la probabilità di contrazione dopo che il dispositivo di assuefazione eroga il primo impulso meccanico. Infine, durante la fase di analisi, è importante contare solo il numero di Stentor che si contraggono dopo un impulso - piuttosto che eventuali contrazioni spontanee accidentali che si verificano prima della consegna dell'impulso - per ottenere una lettura accurata della frazione di cellule che si sono contratte in risposta alla stimolazione meccanica.

Il protocollo può essere facilmente modificato per studiare diversi tipi di dinamica di assuefazione modificando la forza e la frequenza degli impulsi meccanici erogati dal dispositivo di assuefazione. Ciò offre anche l'opportunità di esplorare altri tipi di apprendimento, come la sensibilizzazione, che potrebbero verificarsi in Stentor. Il codice di programma della scheda del microcontrollore può anche essere regolato per fornire diversi modelli di rubinetti meccanici allo Stentor.

Un potenziale problema da risolvere con questo protocollo è la bassa frequenza di ancoraggio di Stentor , che potrebbe limitare il numero di Stentor che possono essere osservati nell'esperimento di assuefazione. La frequenza di ancoraggio è talvolta ridotta nelle colture di Stentor che non sono state recentemente alimentate o sono contaminate. Per affrontare questo problema, si dovrebbe lavare un nuovo lotto di Stentor per iniziare una nuova coltura e nutrirli regolarmente secondo il protocollo descritto in Lin et ^al.10.

Questo protocollo è limitato in quanto è possibile testare solo una singola piastra di Stentor alla volta, con conseguenti misurazioni a produttività relativamente bassa. Inoltre, il software attuale non consente l'automazione dell'analisi delle immagini a cella singola. La maggior parte dei dati acquisiti sono, quindi, a livello di popolazione. I modelli futuri del dispositivo di assuefazione e gli strumenti di analisi delle immagini possono facilitare esperimenti a singola cellula ad alto rendimento.

L'assuefazione in Stentor è stata precedentemente studiata utilizzando i metodi descritti da Wood³, ma questo nuovo protocollo consente di automatizzare gli esperimenti. L'automazione non solo consente al ricercatore di fornire impulsi meccanici riproducibili di una forza e frequenza specificate, ma facilita anche esperimenti di assuefazione a lungo termine poiché il dispositivo può essere lasciato in funzione senza supervisione per giorni. Inoltre, l'uso di un motore passo-passo piuttosto che del solenoide impiegato negli esperimenti di Wood³ riduce il rischio di smagnetizzazione nel tempo e consente anche di variare la forza dello stimolo nel corso di un singolo esperimento.

Lo studio dell'assuefazione cellulare può rivelare intuizioni cliniche per condizioni come il disturbo da deficit di attenzione / iperattività (ADHD) e la sindrome di Tourette in cui l'assuefazione è compromessa¹¹. I meccanismi di assuefazione dello stentor possono anche svelare nuovi paradigmi di apprendimento non sinaptici indipendenti da complessi circuiti cellulari. Infine, approfondimenti sull'apprendimento a singola cellula potrebbero ispirare metodi per riprogrammare le cellule all'interno dei tessuti multicellulari - un'altra potenziale strada per combattere le malattie.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,01% di poliornitina	Millipore Sigma	P4957	Utilizzato per rivestire la piastra
Petri da 35 mm	Benz Microscope Optics Center Inc.	L331	Contiene Stentor durante gli esperimenti
Piastra a 6 pozzetti	StemCell Technologies	38016	Utilizzato per lavare Stentor
Breadboard in alluminio, 4" x 24" x 1/2" (x1)	Thorlabs	MB424	Utilizzato per costruire il dispositivo di assuefazione
Scheda driver per motore passo-passo Big easy driver (x1)	Sparkfun	ROB-12859	Utilizzato per costruire il dispositivo
di assuefazioneBinario da costruzione, 1" x 5" (x2)	Newport	Newport CR-1	Utilizzato per costruire un dispositivo di assuefazione
Laptop	Apple Store	https://www.apple.com/macbook-air-m1/	Collega il laptop al microscopio USB per visualizzare gli esperimenti
Grande staffa ad angolo retto (x1)	Thorlabs	AP90RL	Utilizzato per costruire il dispositivo di assuefazione
Scheda microcontrollore	Arduino	A000066	Utilizzato per controllare il dispositivo di assuefazione
Nema 17 Motore passo-passo bipolare 59Ncm 2A  84 once.in  48 mm a 4 conduttori	Stepperonline.com	5-17HS19-2004S1	Utilizzato per costruire il dispositivo di assuefazione
Acqua di sorgente pastorizzata	Carolina	132458	Media per esperimenti Stentor
Staffa ad angolo retto (x3)	Thorlabs	AP90	Utilizzato per costruire il dispositivo di assuefazione
Stereomicroscopio Stemi 2000	Zeiss	Utilizzato per visualizzare lo Stentor durante le fasi di
Stentor coeruleus	Carolina	131598	Queste sono le cellule utilizzate per gli esperimenti di assuefazione
Microscopio USB	Celestron	44308	Utilizzato per visualizzare e registrare esperimenti
Registratore webcam	Apple Store	https://apps.apple.com/us/app/webcam-recorder/id1508067444?mt=12	Installa questa applicazione per registrare video di esperimenti