Il protocollo di analisi del verde malachite è un metodo semplice ed economico per scoprire i soppressori della proteina da shock termico 90 (Hsp90) e altri composti inibitori contro gli enzimi ATP-dipendenti.
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Articolo metodologico
Saggio verde malachite per la scoperta degli inibitori della proteina 90 da shock termico
In questo articolo
Sommario
Abstract
La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un promettente bersaglio antitumorale a causa del suo effetto chaperoning su più proteine oncogeniche. L'attività di Hsp90 dipende dalla sua capacità di idrolizzare l'adenosina trifosfato (ATP) in adenosina difosfato (ADP) e fosfato libero. L'attività ATPasi di Hsp90 è legata alla sua funzione chaperoning; L'ATP si lega al dominio N-terminale dell'Hsp90 e interrompere il suo legame si è rivelata la strategia di maggior successo nel sopprimere la funzione Hsp90. L'attività dell'ATPasi può essere misurata mediante un saggio colorimetrico di verde malachite, che determina la quantità di fosfato libero formato dall'idrolisi dell'ATP. Qui viene descritta una procedura per determinare l'attività dell'ATPasi del lievito Hsp90 utilizzando il kit di analisi del fosfato verde malachite. Inoltre, vengono fornite istruzioni dettagliate per la scoperta degli inibitori Hsp90 assumendo geldanamicina come inibitore autentico. Infine, viene discussa l'applicazione di questo protocollo di analisi attraverso lo screening ad alta produttività (HTS) di molecole inibitrici contro il lievito Hsp90.
Introduzione
La proteina da shock termico 90 (Hsp90) è un chaperone molecolare che mantiene la stabilità delle proteine responsabili dello sviluppo e della progressione del cancro. Inoltre, le proteine responsabili dello sviluppo della resistenza agli agenti antineoplastici sono anche clienti di Hsp901. Hsp90 è sovraespresso ubiquitariamente in tutti i tipi di cellule tumorali (>90% delle proteine cellulari), rispetto alle cellule normali dove può costituire meno del 2% delle proteine totali. Inoltre, l'Hsp90 delle cellule tumorali risiede in un complesso con co-chaperoni, mentre in una cellula normale è presente prevalentemente in uno stato libero e non co....
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Protocollo
1. Saggio verde malachite su scala di laboratorio
- Preparazione del tampone di analisi
- Preparare il tampone di analisi, secondo la composizione e la preparazione presentate nella Tabella 1.
- Preparazione di norme sui fosfati
- Utilizzare 1 mM di fosfato standard, fornito nel kit di dosaggio del fosfato verde malachite (conservato a 4 °C).
- Pipettare 40 μL di 1 mM fosfato standard in 960 μL di acqua ultrapura per ottenere una soluzione di fosfato 40 μM (soluzione premiscelata). Aggiungere la soluzione premiscelata con acqua ultrapura, secondo le istruzioni del produttore, per formare ....
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Risultati
I risultati del saggio sono interpretati in termini di assorbanza dovuta alla concentrazione di ioni fosfato libero. L'assorbanza da parte del fosfato libero dovuta all'idrolisi dell'ATP da parte del lievito Hsp90 a 620 nm è considerata come attività dell'ATPasi al 100%, o inibizione proteica a percentuale zero. L'inibizione delle proteine porta alla cessazione dell'idrolisi dell'ATP (meno fosfato libero). che si riflette in termini di diminuzione dell'assorbanza a 620 nm.
Risultati de.......
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Discussione
Hsp90 è un obiettivo significativo per la scoperta di nuove molecole di farmaci antitumorali. Da quando la sua farmacogabilità è stata stabilita nel 199410, 18 molecole hanno raggiunto studi clinici. Attualmente, sette molecole sono in varie fasi di studi clinici, da sole o in combinazione22. Tutte queste piccole molecole sono inibitori leganti l'ATP N-terminali. Gli altri mezzi per inibire il chaperone (inibitori C-terminali, inibitori del dominio medio) non hanno procedut.......
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Dichiarazioni
Non vi sono interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal programma Korea Research Fellowship (KRF), borsista post-dottorato della National Research Foundation of Korea (NRF), finanziato dal ministero della scienza e delle TIC (NRF-2019H1D3A1A01102952). Gli autori sono grati alla sovvenzione intramurale KIST e alla sovvenzione numero 2MRB130 del Ministero degli Oceani e della Pesca per aver fornito assistenza finanziaria a questo progetto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1M Soluzione di cloruro di magnesio in acqua | Sigma-Aldrich | 63069-100ml | |
| 1M Soluzione di cloruro di potassio in acqua | Sigma-Aldrich | 60142-100ml | |
| Piastra a 96 pozzetti | SPL Life Sciences | Non applicabile | |
| Adenosina 5′-trifosfato sale disodico idrato | Sigma-Aldrich | A7699-5G | |
| Laboratorio Biomek FX stazione di lavoro di automazione | Beckman Coulter | Non applicabile | |
| Composti 3-96 | Non applicabile | Non applicabile Lievito | marcato con istidina Hsp90 è stato ottenuto dal Dr. Chrisostomos Prodromou, School of Life Sciences, University of Sussex, Regno Unito, e la proteina è stata espressa nel KIST Gangneung Institute of Natural Products. I dettagli non possono essere divulgati a causa di problemi di violazione di brevetto. |
| Dimetil solfossido | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Geldanamicina, 99% (HPLC), polvere | AK Scientific, Inc. | V2064 | |
| Invitroge Acqua distillata ultrapura senza DNasi/RNasi | ThermoFisher Scientific | 10977015 | |
| Saggio del fosfato verde malachite Kit di analisi | Sigma-Aldrich | MAK307-1KT | |
| Lettore di micropiastre multi-rilevamento Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Non applicabile | |
| Lettore multipiastra Synergy HT | Biotek Instruments, Inc. | Non applicabile | |
| Soluzione tampone Trizma cloridrato, pH7.4 | Sigma-Aldrich | 93313-1L | |
| Lievito Hsp90 | Non applicabile | Non applicabile | School of Life Sciences, University of Sussex, Regno Unito e la proteina è stata espressa nel KIST Gangneung Institute of Natural Products. Numero di accesso primario: P02829 |
Riferimenti
- Workman, P. Combinatorial attack on multistep oncogenesis by inhibiting the Hsp90 molecular chaperone. Cancer Letters. 206 (2), 149-157 (2004).
- Taipale, M., Jarosz, D. F., Lindquist, S. HSP90 at the hub of protein homeostasis: e....
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Ristampe e permessi
