Method Article

Costruzione, caratterizzazione e applicazione rigenerativa di aggregati di cellule staminali mesenchimali umane autoassemblate

DOI:

10.3791/64697

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March 24th, 2023

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1State Key Laboratory of Military Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases & Shaanxi International Joint Research Center for Oral Diseases, Center for Tissue Engineering, The Fourth Military Medical University, 2Department of Preventive Dentistry, School of Stomatology, The Fourth Military Medical University, 3College of Life Science, Northwest University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio descrive un metodo per costruire aggregati basati sull'autoassemblaggio di cellule staminali mesenchimali umane e identifica le caratteristiche morfologiche e istologiche per il trattamento rigenerativo dei difetti dell'osso cranico.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule staminali mesenchimali (MSC), caratterizzate dalla loro capacità di auto-rinnovamento e dal potenziale di differenziazione multilineare, possono essere derivate da varie fonti e stanno emergendo come candidati promettenti per la medicina rigenerativa, in particolare per la rigenerazione del dente, dell'osso, della cartilagine e della pelle. L'approccio auto-assemblato dell'aggregazione delle MSC, che costruisce in particolare cluster cellulari che imitano la condensazione mesenchimale in via di sviluppo, consente la consegna di cellule staminali ad alta densità insieme a interazioni cellula-cellula conservate e matrice extracellulare (ECM) come nicchia del microambiente. È stato dimostrato che questo metodo consente un efficiente attecchimento cellulare e la sopravvivenza, promuovendo così l'applicazione ottimizzata delle MSC esogene nell'ingegneria tissutale e salvaguardando la rigenerazione clinica degli organi. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la costruzione e la caratterizzazione di aggregati autoassemblati basati su cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale (UCMSCs), nonché un esempio di applicazione rigenerativa dell'osso cranico. L'implementazione di questa procedura aiuterà a guidare la definizione di un'efficiente strategia di trapianto di MSC per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa.

Introduction

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La condensazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC) è una fase essenziale per garantire la normale crescita e sviluppo del corpo nelle prime fasi dell'organogenesi 1,2, in particolare nella formazione di ossa, cartilagine, denti e pelle 1,3,4. Negli ultimi decenni, le terapie di ingegneria tissutale che utilizzano MSC postnatali in coltura combinate con scaffold biodegradabili hanno fatto importanti progressi nell'osteogenico5 e nella rigenerazione cartilaginea6. Tuttavia, l'uso di scaffold può presentare alcuni svantaggi, come il rigetto immunitario, nonché una bassa affinità cellulare e plasticità7. A questo proposito, abbiamo studiato la fattibilità dell'applicazione di un metodo di coltura cellulare sferoidale per fornire aggregati autoassemblati privi di scaffold che imitano il fenomeno della condensazione in via di sviluppo, che contengono solo MSC e la matrice extracellulare depositata (ECM)8. La formazione di aggregati aumenta la plasticità applicativa per adattarsi alla forma del difetto ed evita l'impianto e la digestione dello scaffold da parte degli enzimi proteolitici per raccogliere le MSC per il trapianto9.

Gli aggregati MSC sono stati ampiamente utilizzati per la rigenerazione dell'osso, della polpa dentale, del parodonto e della pelle10, tra gli altri tessuti e organi. Molti tipi diversi di MSC possono essere selezionati come candidati per le cellule seme, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, le MSC del midollo osseo (BMMSC), le MSC del cordone ombelicale (UCMSCs), le cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) e le MSC dentali (ad esempio, cellule staminali mesenchimali della polpa dentale [DPSC], cellule staminali mesenchimali dai denti decidui [SHED]11 e cellule staminali mesenchimali parodontali [PDLSC])12. Nell'ultimo decennio sono state sviluppate molte tecnologie per cluster cellulari tridimensionali, tra cui l'aggregazione assistita e autoassemblata. Tuttavia, gli approcci di aggregazione assistita sono spesso deboli nella produzione di ECM e nella formazione di aggregati omogenei e stretti, e quindi non sono adatti a imitare le condizioni fisiologiche 13,14,15. Inoltre, alcuni metodi di aggregazione assistita richiedono interazioni cellula-materiale per formare strutture stabili 16,17,18,19, mentre questo metodo di aggregazione auto-assemblato è generalmente disponibile per un'ampia gamma di MSC. In particolare, nei nostri recenti studi clinici, gli aggregati di MSC sono stati utilizzati con successo per rigenerare il complesso polpa-dentina e il parodonto dopo l'impianto in denti incisivi umani danneggiati, che hanno raggiunto la rigenerazione tissutale de novo con struttura e funzione fisiologica20,21.

Questo articolo fornisce una procedura approfondita per la costruzione e la caratterizzazione di aggregati di MSC, nonché per il trapianto in vivo . Questo approccio attirerà l'attenzione dei ricercatori quando mirano a riparare difetti nei tessuti, come i denti, le ossa, la cartilagine e la pelle, sulla base di applicazioni di cellule staminali. Questo metodo è semplice, conveniente e completamente composto da cellule e ECM senza scaffold aggiuntivi, che possono essere coltivati a lungo per ottenere aggregati densi e stabili22. Nel frattempo, gli aggregati coltivati in questo modo sono ricchi di ECM, che imita la nicchia di sviluppo di queste cellule ad alta densità e quindi promuove la rigenerazione tissutale23. Il processo di costruzione può essere suddiviso in due fasi: preparazione e coltura cellulare e formazione e raccolta autoassemblate di aggregati cellulari. La caratterizzazione degli aggregati comprende l'identificazione morfologica tramite un microscopio ottico invertito e un microscopio elettronico a scansione (SEM) e l'analisi istologica tramite ematossilina ed eosina (HE) e colorazione di Masson. Gli aggregati formati sono stati dimostrati per l'impianto rigenerativo per riparare il difetto dell'osso cranico. L'implementazione di questa procedura aiuterà a guidare la definizione di un'efficiente strategia di trapianto di MSC per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa.

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Protocol

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NOTA: Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Quarta Università Medica Militare ed eseguite in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Per il presente studio sono state utilizzate UCMSC umane crioconservate ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'uso di cellule umane è stato approvato dal Comitato Etico della Quarta Università Medica Militare. Le UCMSC sono state prese come esempio per descrivere la procedura. Il difetto cranico è stato preso come esempio per mostrare la necessità di riparazione per descrivere la procedura di impianto. Tutti gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte.

1. Costruzione di aggregati UCMSC

  1. Preparazione e cultura delle UCMSC
    1. Aggiungere 10 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata in una nuova provetta centrifuga da 15 mL in una cappa di biosicurezza sterile.
    2. Rimuovere il tubo di congelamento contenente UCMSC congelato dall'azoto liquido e metterlo rapidamente in un bagnomaria a 37 °C. Agitare delicatamente il tubo per facilitare lo scongelamento rapido e completo delle cellule.
      ATTENZIONE: L'intera procedura deve essere completata entro 1 minuto, poiché il dimetilsolfossido (DMSO) nella soluzione di congelamento può causare citotossicità.
    3. Sospendere leggermente le cellule nella provetta di congelamento e trasferire tutto il contenuto nella provetta da centrifuga contenente 10 mL di PBS (passaggio 1.1.1). Centrifugare il campione a 100 × g per 5 minuti. Eliminare il surnatante e lavare le cellule con 10 mL di PBS.
    4. Centrifugare il campione a 100 × g per 5 min. Scartare il surnatante e risospendere delicatamente le cellule con un mezzo alfa-minimo essenziale completo (α-MEM) contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS), l'1% di penicillina-streptomicina e 584 mg/L di glutammina.
    5. Seminare le cellule risospese in piastre di coltura di 10 cm (spesso da una a due piastre per una provetta, a seconda della quantità totale di cellule dopo la centrifugazione, a una densità di 5 × 106 cellule per piastra). Aggiungere il terreno α-MEM completo nelle piastre fino a un volume totale di 10 ml.
    6. Agitare delicatamente i piatti per distribuire le cellule. Incubare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2 in una camera umidificata. Dopo l'incubazione notturna, scartare il terreno surnatante e aggiungere 5 ml di PBS 1-2x per rimuovere le cellule non aderenti. Aggiungere 10 ml di terreno α-MEM fresco e completo. Cambiare i supporti di coltura ogni 2 giorni.
    7. Per il passaggio cellulare, quando le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, scartare il surnatante e lavare le cellule con 5 mL di PBS per rimuovere completamente il terreno. Incubare le cellule in 2 mL di acido etilendiamminetraacetico (EDTA) 0,25% tripsina-1 mM a 37 °C per 2 min.
    8. Quando le cellule diventano rotonde con giunzioni intercellulari rotte al microscopio, separare le cellule dai piatti senza interrompere troppo la struttura cellulare. Neutralizzare la tripsina aggiungendo 4 mL di terreno α-MEM completo.
    9. Raccogliere le cellule dalle piastre ripetutamente e delicatamente pipettandole in una provetta da centrifuga fresca da 15 ml. Centrifugare il campione a 100 × g per 5 minuti. Scartare il surnatante, risospendere le cellule con un mezzo α-MEM completo e seminarle in piastre di coltura fresche o piastre a pozzetti. Cambiare i supporti di coltura ogni 2 giorni.
      NOTA: A seconda delle dimensioni dell'area del difetto, un difetto di 25 mm3 richiede l'uso di un pozzetto di cellule a piastra a 6 pozzetti coltivate per formare aggregati.
  2. Formazione e raccolta degli inerti
    1. Preparare i terreni che inducono aggregati cellulari aggiungendo 50 μg/mL di vitamina C in α-MEM con il 10% di FBS, l'1% di penicillina-streptomicina e 584 mg/L di glutammina.
      ATTENZIONE: L'esposizione diretta alla luce dovrebbe essere evitata quando si utilizza la vitamina C, poiché la vitamina C si ossida se esposta alla luce e diventa inefficace.
    2. Quando le celle nel passaggio 1.1.12 raggiungono il 95% di confluenza (Figura supplementare S1), cambiare il mezzo in mezzo che induce aggregati cellulari; Sostituire il terreno di coltura che induce aggregati cellulari freschi ogni 2 giorni.
    3. Dopo 7-10 giorni di induzione (la durata del tempo di induzione dipende dai tipi di cellule staminali ed è spesso di ~7 giorni per il bordo delle UCMSC), cercare aggregati sagomati al microscopio, con bordi spessi separati dal fondo del piatto.
    4. Eliminare i terreni di coltura e lavare delicatamente le cellule 2 volte con PBS. Spingere delicatamente gli aggregati dal bordo verso il centro utilizzando piccole pinze sterili, piegando gli aggregati.
    5. In alcune occasioni, le UCMSC possono arricciarsi spontaneamente verso il centro per formare una condensa solida. Questa struttura è equivalente all'aggregato ottenuto nel passaggio 1.2.4.

2. Identificazione morfologica degli aggregati

  1. Osservazione generale e microscopica
    1. Osservare che gli aggregati sono densi e integrati e non si danneggiano facilmente da forze meccaniche, come la trazione durante il distacco e il trapianto.
    2. Al microscopio, cerca una struttura simile a una membrana di un certo spessore con motivo intrecciato.
  2. Colorazione di cellule vive/morte
    1. Seminare le cellule in una piastra a 6 pozzetti a una densità di 1 × 106 celle per pozzetto.
    2. Preparare 2 μM di calceina AM e 4 μM di EthD-1 soluzione di lavoro utilizzando PBS.
    3. Aggiungere lo 0,3% di tritone alle cellule per 5 minuti, lavare con PBS tre volte per indurre le cellule alla morte, come controllo per la colorazione.
    4. Lavare due volte le cellule, gli aggregati e le cellule che inducono la morte con PBS.
    5. Aggiungere 100 μl di PBS e 100 μl di soluzione colorante preparata al punto 2.2.2 in ciascun pozzetto.
    6. Incubare il campione per 30 minuti a RT. Lavare il campione con PBS due volte.
    7. Aggiungere 200 μL di 10 μg/mL di Hoechst a ciascun pozzetto e incubare il campione per 5 minuti a RT. Wah il campione con PBS due volte.
    8. Osservare al microscopio a fluorescenza.
  3. Osservazione SEM
    1. Seminare e indurre in cella gli aggregati ottenuti al punto 1.2.4 o 1.2.5. Lavare le celle con PBS dopo che gli aggregati si sono formati nel passaggio 1.2.4. o 1.2.5.
    2. Fissare le cellule con glutaraldeide per almeno 4 ore.
    3. Lavare i campioni con PBS, quindi disidratarli attraverso una concentrazione in gradiente di etanolo dal 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, al 100%, ciascuno per 5 minuti. Trattare 2 volte con etanolo anidro.
    4. Immergere gli aggregati in 3 mL di esametiltililazano per 30 minuti. Aspirare tutto il fluido e asciugare accuratamente i campioni in modo naturale.
      ATTENZIONE: L'intero processo deve essere eseguito in una cappa aspirante perché l'esametiltililazano è volatile e altamente tossico.
    5. Incollare i campioni essiccati sul tavolo dei campioni con nastro biadesivo al carbonio e rivestire la superficie con metallo. Conservare il campione a temperatura ambiente (RT) per diversi giorni.
    6. Osservare sotto un SEM.
      1. Sostituire il campione all'interno della macchina. Regolare la tensione della macchina a 5 k e la lunghezza focale a ~12 mm. Regolare la barra di messa a fuoco finché non viene visualizzata un'immagine nitida.
      2. Cattura le immagini a basso ingrandimento. Regolare l'ingrandimento e rimettere a fuoco per ottenere un'immagine con un ingrandimento maggiore.
        ATTENZIONE: La superficie degli aggregati non può essere toccata prima dell'osservazione per evitare la distruzione della morfologia superficiale.

3. Analisi istologica degli aggregati

  1. Fissazione e sezionamento di campioni
    1. Fissare gli aggregati ottenuti al punto 1.2.4 o 1.2.5 con paraformaldeide al 4% a 4 °C per almeno 24 h. Dopo la fissazione, lavare con PBS e posizionare il campione in cassette di inclusione per una notte per risciacquare con acqua corrente.
    2. Disidratare i campioni utilizzando macchine automatiche per la disidratazione attraverso etanolo a gradiente, xilene e paraffina, seguendo le istruzioni del produttore. L'intero processo è il seguente: etanolo all'85% per 2 ore alla RT, etanolo al 95% per 2 ore alla RT, etanolo al 95% per 2 ore alla RT, etanolo al 100% per 2 ore alla RT, etanolo al 100% per 1,5 ore alla RT, xilene per 45 minuti alla RT, xilene per 45 minuti alla RT, paraffina per 30 minuti alla RT, paraffina per 1,5 ore a RT e infine paraffina per 2 ore a 60 °C.
    3. Incorporare i campioni con paraffina. Preparare sezioni di circa 5 μm di spessore, farle aderire ai vetrini cationici e asciugare i vetrini per 2 ore a 45 °C.
    4. Decerare in sequenza attraverso xilene per 15 minuti, due volte e etanolo al 100%, 90%, 80% e 70% (ciascuno per 5 minuti).
    5. Sciacquare lentamente i vetrini 3 volte con acqua corrente per 5 minuti.
  2. colorazione HE
    1. Macchiare con ematossilina per 3-5 minuti, risciacquare con acqua e rimuovere accuratamente il liquido in eccesso intorno al tessuto.
    2. Frazionare con etanolo contenente acido cloridrico all'1% per 3-5 s e risciacquare con acqua corrente, durante il quale il colore diventa un po' più chiaro e blu. Rimuovere l'acqua in eccesso intorno al tessuto.
    3. Macchiare con eosina per 1 minuto, risciacquare con acqua corrente e rimuovere il liquido in eccesso intorno al tessuto.
    4. Disidratare con etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% per 10 s ciascuno, xilene per 15 minuti, due volte, e asciugare naturalmente nella cappa aspirante prima di sigillare il foglio.
    5. Aggiungere gocce di resina neutra e sigillare i vetrini con vetrini. Osservare al microscopio ottico.
  3. Colorazione tricromica di Masson
    1. Macchiare con l'ematossilina di ferro Weigert per 5 minuti, risciacquare con acqua e asciugare.
    2. Frazionare con etanolo contenente acido cloridrico all'1% per 3-5 s e risciacquare con acqua corrente, durante il quale il colore diventa un po' più chiaro e blu. Asciugare la superficie.
    3. Macchiare con la soluzione di magenta acido rosso Lixin per 5-10 minuti e risciacquare rapidamente con acqua distillata.
    4. Trattare con una soluzione acquosa di acido fosfomolibdico per 3-5 minuti.
    5. Colorare direttamente con la soluzione di blu di anilina per 5 minuti senza lavare con acqua.
    6. Trattare con acido acetico glaciale all'1% per 1 minuto.
    7. Disidratare con etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% per 10 s ciascuno, xilene per 15 minuti, due volte, e asciugare naturalmente nella cappa aspirante prima di sigillare il foglio.
    8. Aggiungere gocce di resina neutra e sigillare i vetrini con vetrini. Osservare al microscopio ottico.

4. Impianto

  1. Anestetizzare il topo nudo con un'iniezione intraperitoneale di 50 mg/kg di pentobarbital sodico.
    NOTA: Verificare che i topi siano adeguatamente anestetizzati in base all'assenza di riflesso corneale e reazione degli arti quando il cuscinetto del piede viene pizzicato. Applicare un unguento per gli occhi per prevenire la secchezza.
  2. Praticare un'incisione trasversale (~3-4 cm) nella pelle dietro le orecchie del topo nudo con piccole forbici sterili dopo la disinfezione con iodoforo.
  3. Tirare la pelle in avanti per esporre il cranio. Disegna leggermente i bordi dell'area del difetto pianificato con una lama 11# e rimuovi il frammento osseo. L'area del difetto è un'area circolare di circa 4 mm di diametro. Usa la soluzione salina per lavare la ferita e fornire un'emostasi adeguata.
  4. Immergere gli aggregati ottenuti al punto 1.2.5 o 1.2.6 con una garza sterile per assorbire l'umidità superficiale prima dell'impianto. Posizionare gli aggregati nell'area e pressurizzare leggermente per riempire il difetto.
  5. Sostituire la pelle dopo aver tirato per assicurarsi che l'impianto sia fissato. Chiudere l'incisione con 1/2, 4 × 10 punti angolati e suture 4-0.
  6. Dopo l'intervento, posizionare gli animali sulla coperta riscaldante fino a quando non sono attivi e poi rimetterli nella gabbia.
    NOTA: Gli animali non devono essere lasciati incustoditi fino a quando non riacquistano sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale. Gli animali che sono stati sottoposti a intervento chirurgico non vengono restituiti alla compagnia di altri animali fino a quando non si sono completamente ripresi.

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Results

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Gli aggregati possono essere costruiti con successo da UCMSC in base al flusso di lavoro sperimentale (Figura 1). La qualità degli aggregati deve essere valutata prima dell'uso, attraverso l'osservazione morfologica e l'analisi istologica. La struttura lamellare formata deve essere completa e densa, con le cellule intrecciate per formare un motivo intrecciato mediante osservazione microscopica (Figura 2A). L'arricciatura dei bordi può essere rilevata du...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Con i progressi della biotecnologia dell'ingegneria tissutale, le strategie per costruire una struttura impiantabile con un'elevata plasticità e contenente cellule sopravvissute a lungo termine in grado di ottenere una rigenerazione ottimale sono state al centro dell'attenzione di molti scienziati. Esistono diversi metodi di impianto delle MSC, come i metodi di sola cellula, gli scaffold integrati con citochine 6,24 o la combinaz...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81930025, 82100969 e 82071075) e del National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104400 e 2021YFA1100600). Siamo grati per l'assistenza del Centro Nazionale Dimostrativo Didattico Sperimentale per la Medicina di Base (AMFU).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% Tripsina-EDTA (1x)SigmaT4049Passaggio cellulare
Macchina automatica per la disidratazioneLEICAASP200sAggregato disidratato
CentrifugaEppendorf5418RCentrifugazione
Provetta per centrifugaThermo Nunc339650
Centrifugazione Piastra di colturaThermo150466Coltura di UCMSC
EtanoloSCR10009218Aggregato disidratato
Siero bovino fataleSijiqing11011-8611Coltura di UCMSCs
ForcipeJZJD1080Aggregato di raccolta
GlutaraldeideProandy10217-1Fissazione dell'aggregato
Ematossilina ed eosina Kit di colorazionebeyotimeC0105SHE
EsametiltililazanoSCR80068416Superficie aggregata secca
Hoechst33342Sigma14533Colorazione dei nuclei cellulari
L-glutamminaSigmaG5792Coltura di UCMSC
Kit di vitalità/citotossicità vivo/morto...InvitrogenL3224Colorazione di cellule vive/morte
Kit di colorazione di MassonZHCCD069Colorazione di Masson
Terreno essenziale minimo Alfa basico (1x)GibcoC12571500BTColtura di UCMSCs
ParaffinaLeica39601006Inclusione tissutale
ParaformaldeideSaint-BioD16013Fissazione dell'aggregato
PBS (1x)MeilunbioMA0015Risospendere e purificare UCMSCs
Penicillina/StreptomicinaProcell Life SciencePB180120Coltura di UCMSCs
Pentobarbital sodicoSigmaP3761Anestesia animale
PolisporinaPfizerPrevenire la secchezza oculare
Microscopio elettronico a scansioneHitachis-4800SEM osservazione
ForbiceJZY00030Incisione chirurgica animale
Piastra a sei pozzettiThermo140675Coltura di UCMSCs
StitchJinhuanF603Chiudere le ferite
SuturaXy4-0Chiudere le ferite
Apparecchiature termostaticheGrantv-0001-0005Bagno d'acqua
UCMSCsBai'ao & nbsp;UKK220201Commercialmente UCMSCs
Vitamina CDiyibioDY40138-25gAggregato che induce
xileneSCR10023418Aggregato disidratato

References

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