Costruzione, caratterizzazione e applicazione rigenerativa di aggregati di cellule staminali mesenchimali umane autoassemblate

Summary

Questo studio descrive un metodo per costruire aggregati basati sull'autoassemblaggio di cellule staminali mesenchimali umane e identifica le caratteristiche morfologiche e istologiche per il trattamento rigenerativo dei difetti dell'osso cranico.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC), caratterizzate dalla loro capacità di auto-rinnovamento e dal potenziale di differenziazione multilineare, possono essere derivate da varie fonti e stanno emergendo come candidati promettenti per la medicina rigenerativa, in particolare per la rigenerazione del dente, dell'osso, della cartilagine e della pelle. L'approccio auto-assemblato dell'aggregazione delle MSC, che costruisce in particolare cluster cellulari che imitano la condensazione mesenchimale in via di sviluppo, consente la consegna di cellule staminali ad alta densità insieme a interazioni cellula-cellula conservate e matrice extracellulare (ECM) come nicchia del microambiente. È stato dimostrato che questo metodo consente un efficiente attecchimento cellulare e la sopravvivenza, promuovendo così l'applicazione ottimizzata delle MSC esogene nell'ingegneria tissutale e salvaguardando la rigenerazione clinica degli organi. Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la costruzione e la caratterizzazione di aggregati autoassemblati basati su cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale (UCMSCs), nonché un esempio di applicazione rigenerativa dell'osso cranico. L'implementazione di questa procedura aiuterà a guidare la definizione di un'efficiente strategia di trapianto di MSC per l'ingegneria tissutale e la medicina rigenerativa.

Introduction

La condensazione delle cellule staminali mesenchimali (MSC) è una fase essenziale per garantire la normale crescita e sviluppo del corpo nelle prime fasi dell'organogenesi ^1,2, in particolare nella formazione di ossa, cartilagine, denti e pelle ^1,3,4. Negli ultimi decenni, le terapie di ingegneria tissutale che utilizzano MSC postnatali in coltura combinate con scaffold biodegradabili hanno fatto importanti progressi nell'osteogenico⁵ e nella rigenerazione cart....

Protocol

NOTA: Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Quarta Università Medica Militare ed eseguite in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Per il presente studio sono state utilizzate UCMSC umane crioconservate ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'uso di cellule umane è stato approvato dal Comitato Etico della Quarta Università Medica Militare. Le UCMSC sono state prese come esempio per descrivere la procedura. Il difetto cranico è stato preso come esempio pe....

Results

Gli aggregati possono essere costruiti con successo da UCMSC in base al flusso di lavoro sperimentale (Figura 1). La qualità degli aggregati deve essere valutata prima dell'uso, attraverso l'osservazione morfologica e l'analisi istologica. La struttura lamellare formata deve essere completa e densa, con le cellule intrecciate per formare un motivo intrecciato mediante osservazione microscopica (Figura 2A). L'arricciatura dei bordi può essere rilevata du.......

Discussion

Con i progressi della biotecnologia dell'ingegneria tissutale, le strategie per costruire una struttura impiantabile con un'elevata plasticità e contenente cellule sopravvissute a lungo termine in grado di ottenere una rigenerazione ottimale sono state al centro dell'attenzione di molti scienziati. Esistono diversi metodi di impianto delle MSC, come i metodi di sola cellula, gli scaffold integrati con citochine ^6,24 o la combinaz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25% Tripsina-EDTA (1x)	Sigma	T4049	Passaggio cellulare
Macchina automatica per la disidratazione	LEICA	ASP200s	Aggregato disidratato
Centrifuga	Eppendorf	5418R	Centrifugazione
Provetta per centrifuga	Thermo Nunc	339650
Centrifugazione Piastra di coltura	Thermo	150466	Coltura di UCMSC
Etanolo	SCR	10009218	Aggregato disidratato
Siero bovino fatale	Sijiqing	11011-8611	Coltura di UCMSCs
Forcipe	JZ	JD1080	Aggregato di raccolta
Glutaraldeide	Proandy	10217-1	Fissazione dell'aggregato
Ematossilina ed eosina Kit di colorazione	beyotime	C0105S	HE
Esametiltililazano	SCR	80068416	Superficie aggregata secca
Hoechst33342	Sigma	14533	Colorazione dei nuclei cellulari
L-glutammina	Sigma	G5792	Coltura di UCMSC
Kit di vitalità/citotossicità vivo/morto...	Invitrogen	L3224	Colorazione di cellule vive/morte
Kit di colorazione di Masson	ZHC	CD069	Colorazione di Masson
Terreno essenziale minimo Alfa basico (1x)	Gibco	C12571500BT	Coltura di UCMSCs
Paraffina	Leica	39601006	Inclusione tissutale
Paraformaldeide	Saint-Bio	D16013	Fissazione dell'aggregato
PBS (1x)	Meilunbio	MA0015	Risospendere e purificare UCMSCs
Penicillina/Streptomicina	Procell Life Science	PB180120	Coltura di UCMSCs
Pentobarbital sodico	Sigma	P3761	Anestesia animale
Polisporina	Pfizer		Prevenire la secchezza oculare
Microscopio elettronico a scansione	Hitachi	s-4800	SEM osservazione
Forbice	JZ	Y00030	Incisione chirurgica animale
Piastra a sei pozzetti	Thermo	140675	Coltura di UCMSCs
Stitch	Jinhuan	F603	Chiudere le ferite
Sutura	Xy	4-0	Chiudere le ferite
Apparecchiature termostatiche	Grant	v-0001-0005	Bagno d'acqua
UCMSCs	Bai'ao & nbsp;	UKK220201	Commercialmente UCMSCs
Vitamina C	Diyibio	DY40138-25g	Aggregato che induce
xilene	SCR	10023418	Aggregato disidratato