Articolo metodologico

Analisi e imaging degli osteociti

DOI:

10.3791/64699

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29 novembre 2024

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1School of Science and Engineering, University of Missouri-Kansas City, 2Department of Oral and Craniofacial Sciences, School of Dentistry, University of Missouri-Kansas City

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio delinea il metodo per visualizzare e sviluppare modelli tridimensionali (3D) di osteociti all'interno della rete lacunare-canalicolare (LCN) per l'analisi della fluidodinamica computazionale (CFD). I modelli generati utilizzando questo metodo aiutano a comprendere la meccanosensazione degli osteociti in ossa sane o malate.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli osteociti sono le cellule ossee che si ritiene rispondano alle sollecitazioni meccaniche e allo stress da taglio del flusso di fluidi (FFSS) attivando vari percorsi biologici in un processo noto come meccanotrasduzione. I modelli confocali derivati da immagini di reti di osteociti sono uno strumento prezioso per condurre analisi di fluidodinamica computazionale (CFD) per valutare le sollecitazioni di taglio sulla membrana degli osteociti, che non possono essere determinate mediante misurazione diretta. La modellazione computazionale utilizzando queste immagini ad alta risoluzione dell'architettura microstrutturale dell'osso è stata utilizzata per simulare numericamente il carico meccanico esercitato sull'osso e comprendere la stimolazione indotta dal carico degli osteociti.

Questo studio elabora i metodi per sviluppare modelli 3D di singoli osteociti utilizzando immagini al microscopio confocale della rete Lacunar-Canalicolare (LCN) per eseguire analisi CFD utilizzando vari software di modellazione computazionale. Prima della microscopia confocale, le ossa del topo vengono sezionate e colorate con il colorante isotiocianato di fluoresceina (FITC) per marcare l'LCN. A una risoluzione di 100x, le immagini Z-stack vengono raccolte utilizzando un microscopio confocale e importate nel software MIMICS (software di elaborazione 3D basato su immagini) per costruire un modello di superficie dei processi LCN e osteociti-dendritici.

Queste superfici vengono quindi sottratte utilizzando un'operazione booleana nel software 3-Matic (software di ottimizzazione dei dati 3D) per modellare lo spazio fluidico lacunare attorno al corpo cellulare degli osteociti e lo spazio canalicolare attorno ai dendriti contenenti liquido lacunocanalicolare. La geometria volumetrica 3D del fluido viene importata nel software ANSYS (software di simulazione) per l'analisi CFD. ANSYS CFX (software CFD) viene utilizzato per applicare il carico fisiologico sull'osso sotto forma di pressione del fluido e per determinare le sollecitazioni di taglio della parete sugli osteociti e i processi dendritici. La morfologia dell'LCN influenza i valori di sforzo di taglio rilevati dalla membrana cellulare degli osteociti e dai processi cellulari. Pertanto, i dettagli su come vengono sviluppati i modelli confocali basati su immagini possono essere preziosi per comprendere la meccanosensazione degli osteociti e possono gettare le basi per studi futuri in questo settore.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Si ipotizza che gli osteociti regolino la massa ossea in risposta all'esercizio fisico1. La deformazione della membrana degli osteociti e i loro processi dendritici dovuti al carico meccanico, li sottopone a FFSS, che viene rilevata dagli osteociti e innesca la segnalazione intracellulare 2,3,4. La microstruttura ossea subisce deterioramenti o alterazioni della sua morfologia lacunare-canalicolare a causa dell'invecchiamento o di malattie ossee come l'osteoporosi e il diabete e in condizioni come la carenza di perlecan che causa una compromissione della meccano-responsività degli osteociti 5,6. Questi cambiamenti nell'architettura ossea fanno sì che gli osteociti sperimentino diversi livelli di FFSS e ceppi 7,8. È importante sottolineare che la FFSS sperimentata dagli osteociti in risposta al carico meccanico è difficile da quantificare in vivo perché è incorporata nella matrice ossea calcificata.

La modellazione confocale basata su immagini è una tecnica potente per superare i limiti dello studio di osteociti inaccessibili nel loro ambiente naturale replicando modelli computerizzati della LCN 9,10. L'elaborazione e la modellazione della rete interconnessa di LCN in 3D è stata una sfida. Esistono diverse tecniche di imaging, come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la microscopia elettronica a scansione (SEM), il sezionamento seriale della faccia a blocchi e la microscopia elettronica a scansione a scansione a fascio ionico focalizzato seriale (FIB/SEM)2,11,12. È stata sviluppata una tecnica preziosa per visualizzare l'osso 13,14,15 e generare modelli 3D di osteociti tramite microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Il CLSM è stato scelto qui per la modellazione computazionale piuttosto che per altre tecniche di imaging grazie alla sua capacità di visualizzare tutto il volume di lacuna e la maggior parte dei canalicoli in 3D16,17. La geometria LCN può essere generata utilizzando CLSM per l'analisi degli elementi finiti (FEA) degli osteociti per prevedere i ceppi ossei. Tuttavia, l'analisi dei fluidi per prevedere la FFSS sperimentata dagli osteociti è più complicata in quanto richiede la modellazione della membrana cellulare dell'osteocita e dei suoi dendriti all'interno dell'LCN per consentire la modellazione dello stretto spazio lacunare-canalicolare, in cui il liquido interstiziale si muove intorno a18.

In questo protocollo, il colorante isotiocianato di fluoresceina (FITC) viene applicato a sezioni ossee spesse non decalcificate prima della microscopia confocale per marcare l'LCN all'interno dell'osso e le membrane osteociti-dendritiche vengono modellate sulla base dei dati di imaging dell'LCN. Lo spazio lacunare-canalicolare viene simulato utilizzando la modellazione computazionale e il carico fisiologico dovuto all'attività fisica viene modellato utilizzando un approccio CFD. Gli osteociti sono sottoposti a un gradiente di pressione del fluido nel software CFD per analizzare il profilo del fluido all'interno dell'LCN e misurare la FFSS sulle membrane osteocitarie e dendritiche. Inoltre, un approccio FEA può misurare le deformazioni o le sollecitazioni degli osteociti applicando un carico meccanico compressivo.

È stata inoltre sviluppata una tecnica di modifica della geometria per modificare le microstrutture derivate da immagini di osso giovane e sano al fine di simulare l'alterazione della morfologia lacunare-canalicolare negli animali anziani o con malattie ossee. Le alterazioni della microstruttura ossea includevano la riduzione del numero di canalicoli con l'invecchiamento, la riduzione dell'area dello spazio lacunare-canalicolare per modellare ciò che accade nella carenza di perlecan e aumentarla per modellare gli effetti dell'invecchiamento, e la riduzione dell'area della parete canalicolare e dendritica per modellare l'osso diabetico 5,6. La tecnica di modifica della geometria ci permette di confrontare la FFSS sperimentata dagli osteociti nelle ossa con diverse microstrutture, come i giovani rispetto agli anziani o le ossa negli animali sani rispetto a quelli malati.

Nel complesso, la modellazione confocale basata su immagini è uno strumento prezioso per simulare la morfologia degli osteociti nell'osso sano e nei cambiamenti associati all'invecchiamento/alla malattia nella morfologia degli osteociti. Inoltre, i parametri morfologici degli osteociti, come l'area superficiale e il volume dello spazio lacunare-canalicolare, possono essere misurati e confrontati in varie ossa per prevedere le risposte cellulari alla sollecitazione meccanica.

Protocollo

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Gli esperimenti sugli animali sono stati condotti con l'approvazione del Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso l'Università del Missouri, Kansas City (UMKC), e sono stati conformi alle linee guida federali pertinenti.

1. Processo di preparazione ossea

  1. Raccogliere i femmina di topi C57BL6 di 4 mesi e 22 mesi e fissarli in paraformaldeide fredda al 4% in PBS per 24 ore a 4 °C con un leggero dondolio, quindi sciacquarli in PBS e conservarli in etanolo al 70% prima di incorporarli.
    NOTA: Il volume fissativo dovrebbe essere circa 20 volte il volume del tessuto
  2. Incorporare rapidamente le ossa in un acrilico a polimerizzazione rapida (Tabella dei materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: È importante utilizzare una resina a polimerizzazione rapida per questa fase (~10 min). Lo scopo è quello di sostenere il tessuto osseo durante il sezionamento utilizzando la sega diamantata, ma senza che la resina penetri nell'LCN, il che impedirebbe alla macchia FITC di penetrare.
  3. Tagliare fette trasversali spesse 300 μm di spessore da un sito standardizzato sopra il terzo trocantere utilizzando una sega diamantata e conservarle a 4 °C in etanolo al 70% prima della colorazione FITC.
  4. Lucidare le sezioni utilizzando carta vetrata a grana 600, 800 e poi 1200 fino a uno spessore finale di ~90-100 μm.
    NOTA: Il raggiungimento del corretto spessore è stato garantito utilizzando un calibro digitale.
  5. Sciacquare le sezioni in etanolo al 70%, 95% e 100% per 5 minuti ciascuna.
  6. Colorarli in FITC all'1% in etanolo al 100% per 4 ore a temperatura ambiente (RT) al buio agitando moderatamente.
  7. Lavare le sezioni in etanolo al 100% per 30 minuti agitando delicatamente al buio. Quindi, asciugali all'aria per una notte al buio.
  8. Per il montaggio, posizionare la sezione in una goccia di supporto di montaggio su un vetrino da microscopio. Utilizzare una pinza per posizionare la sezione il più piatta possibile contro il vetrino, evitando di generare bolle d'aria e utilizzando la resina circostante per manipolare il campione. Montare un vetrino coprioggetti sul campione.

2. Microscopia confocale

  1. Utilizzare un microscopio confocale per l'imaging di fette ossee colorate con FITC.
  2. Utilizza un obiettivo a olio 100x 1,44NA con uno zoom digitale di 1,7 e una dimensione del passo di 0,126 μm per raccogliere stack Z dettagliati di 400 piani Z a 1024 x 1024 pixel, risoluzione pixel di 0,089 μm.
  3. Utilizzare un laser a 488 nm per l'eccitazione, con una finestra di raccolta delle emissioni di 496-596 nm. Raccogli le pile di immagini utilizzando le impostazioni di compensazione per correggere la perdita di segnale con l'aumentare della profondità dell'immagine.
  4. Aumenta l'accuratezza e la risoluzione delle immagini utilizzando tecniche di raccolta delle immagini come il sovracampionamento e l'aumento della media delle linee. Inoltre, raccogli le immagini con un ingrandimento di risoluzione 5x, 20x e 100x delle sezioni trasversali delle sezioni del femore, come mostrato nella Figura 1.
    NOTA: L'immagine a bassa risoluzione (5x) nella Figura 1 mostra l'intera area della sezione trasversale del femore, con tre regioni selezionate per campi di imaging 100x.
  5. Utilizza gli Z-stack 100x per la modellazione computerizzata degli osteociti.

3. Modellazione al computer

  1. Importa le immagini 100x raccolte, in formato TIFF, nel software ImageJ per creare una sequenza di immagini dell'LCN in direzione Z.
  2. Importa gli Z-stack nel software di elaborazione 3D basato su immagini per costruire una maschera dell'LCN dopo aver definito l'orientamento dell'immagine.
  3. Soglia l'immagine originale dei topi giovani e anziani tra 30.012-45.677 unità di Hounsfield e 15.000-46.701 unità di Hounsfield, rispettivamente, per assomigliare molto alla LCN. Regolate la Soglia nel menu della sezione per modificare i limiti di intensità dei pixel da includere in una maschera.
  4. Ritaglia una lacuna con i relativi canalicoli come regione di interesse (ROI) dalla pila utilizzando l'operazione Maschera di ritaglio . Definire la ROI in modo che circondi la lacuna al centro del cubo e che tutti i relativi canalicoli collegati si estendano ai lati del cubo. Racchiudi la lacuna in un cubo immaginario più grande con lunghezze laterali di 21 μm, 14 μm e 19 μm.
  5. Poiché il modello è costituito da più parti, eseguire un'operazione di ingrandimento della regione per selezionare le regioni di pixel collegate, rimuovere il rumore e despeckle per generare un LCN uniforme.
  6. Converti la maschera lacunare-canalicolare in un oggetto utilizzando l'operazione Parte calcolata nel software di elaborazione 3D basato su immagini.
  7. Costruire le membrane osteocitarie e dendritiche riducendo il volume LCN utilizzando l'operazione di levigatura. Eseguire questa operazione più volte per ottenere uno spessore dello spazio lacunare e canalicolare di 0,75 μm e 0,08 μm, rispettivamente 9,18.
  8. Esportazione degli oggetti (formato STL) come ultimo passaggio nel software di elaborazione 3D basato su immagini.
  9. Importa due strati dell'LCN e delle membrane osteociti-dendritiche nel software di ottimizzazione dei dati 3D per generare una mesh di volume.
  10. Utilizza lo strumento Fix Wizard nel software per identificare i problemi di mesh in ogni parte. Controllare la qualità della mesh nella sezione diagnostica della procedura guidata di correzione dopo ogni operazione.
  11. Rimuovere le parti normali invertite, i triangoli che si intersecano e i contorni errati utilizzando l'operazione di correzione automatica nella procedura guidata di correzione.
  12. Sostituire i triangoli sovrapposti manualmente definendone di nuovi o automaticamente tramite l'operazione Riempi foro normale .
  13. Migliora la qualità della mesh utilizzando operazioni che includono il filtraggio di triangoli acuti, bordi piccoli e piccoli gusci.
  14. Dopo aver migliorato la qualità della mesh, combinare due superfici dell'LCN e delle membrane osteociti-dendritiche in un'unica superficie (spazio fluidico lacunare-canalicolare) che appartiene a entrambe le parti utilizzando un assemblaggio non collettore.
  15. Creare un modello volumetrico dello spazio lacunare-canalicolare utilizzando l'operazione Remesh e quindi esportarlo come file STL. Regola la scala dell'oggetto in modo che sia in micrometri nella sezione di esportazione.

4. Tecnica di modifica della geometria nel software di elaborazione 3D basato su immagini e nel software di ottimizzazione dei dati 3D

NOTA: La tecnica di modifica della geometria viene utilizzata per modellare i cambiamenti nella morfologia degli osteociti, come la densità e il diametro canalicolare e lo spessore lacunare-canalicolare dovuti all'invecchiamento o alle malattie ossee.

  1. Scegli il giovane osteocita come modello base e modificalo per costruire altri modelli di osteociti distinti applicando alterazioni morfologiche.
  2. Genera un modello di osteociti con densità canalicolari diverse dal modello di base modificando la soglia dell'immagine nel software di elaborazione 3D basato su immagini.
    1. Selezionare una soglia più bassa per ridurre l'intensità luminosa dell'immagine e ottenere una lacuna con meno canalicoli. Il vantaggio della tecnica del thresholding è che la forma e la dimensione della lacuna rimangono le stesse e viene studiata solo l'influenza della densità canalicolare. La Figura 2 mostra il modello invecchiato simulato generato dal giovane osteocita utilizzando la tecnica di modifica della geometria.
  3. Sviluppa modelli di osteociti con diversi spessori dello spazio lacunare-canalicolare o diametri dendritici/canalicolari nel software di elaborazione 3D basato su immagini e nel software di ottimizzazione dei dati 3D. Costruisci modelli di osteociti più grandi o più piccoli rispettivamente con operazioni di avvolgimento o levigatura . La Figura 3 mostra sei modelli di osteociti con geometria alterata sviluppati dal giovane osteocita.

5. Analisi CFD

NOTA: Dopo aver generato i modelli volumetrici di osteociti, nel modulo CFX del software di simulazione vengono eseguiti diversi passaggi, tra cui la geometria, la mesh e l'impostazione.

  1. Creare un flusso di fluido nel software di simulazione per preparare i modelli per l'analisi CFD.
  2. Importa le geometrie confocali basate su immagini sviluppate nella sezione geometrica di CFX, nota come ANSYS SpaceClaim (strumento di modellazione 3D). Impostare le dimensioni dell'unità su nanometri nell'impostazione.
  3. La geometria appare come due aspetti della LCN e dei processi osteociti-dendritici. Fare clic su Sfaccettatura nel menu in alto e rimuovere gli errori geometrici come intersezioni, spigoli vivi o sovraconnessi e vertici, aperture o fori per ogni sfaccettatura.
  4. Fare clic su Sottrai nel menu Sfaccettatura per ridurre la faccetta più piccola e i processi osteociti-dendritici dalla faccetta più grande, l'LCN, per ottenere un unico corpo di spazio lacunare-canalicolare. Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sfaccettatura generata e convertirla da sfaccettature a un dominio solido senza unire le facce. La Figura 4 illustra l'area della sezione trasversale del modello di osteocita giovane, che rappresenta lo spazio lacunare-canalicolare.
  5. Fare clic sulla mesh e selezionare gli elementi tetraedrici lineari utilizzando una dimensione dell'elemento di 0,06 μm. Perfeziona la mesh con uno studio di convergenza della mesh per avere abbastanza elementi nel minuscolo sistema dendritico per garantire che i risultati siano indipendenti dalla dimensione della mesh.
  6. Seleziona la superficie e scegli i canalicoli sul lato superiore del cubo immaginario come ingressi del fluido. Selezionare i canalicoli sulle altre cinque facce come uscite del fluido utilizzando la casella di selezione.
  7. Esporta la mesh (formato di file fluente) man mano che si carica più velocemente nella configurazione nel passaggio successivo.
  8. Creare un altro flusso di fluido nel software di simulazione e importare la mesh fluente nella sezione di configurazione di CFX. Definire due condizioni al contorno di ingressi e uscite per le facce preselezionate come ingressi/uscite utilizzando l'opzione Inserisci contorno .
  9. Per imitare le condizioni fisiologiche, esercitare una pressione di ingresso del fluido di 300 Pa e 0 Pa sugli ingressi e sulle uscite, rispettivamente19,20. Trattare le superfici rimanenti come pareti con una condizione di non scivolamento in quel fluido che ha velocità zero all'interfaccia delle pareti. Il fluido scorre dagli ingressi intorno ai dendriti e al corpo cellulare degli osteociti ed esce dagli altri canalicoli assegnati come sbocchi.
  10. Trattare il liquido laminare interstiziale come acqua9, scelta dalla libreria dei materiali. Impostate le sezioni Trasferimento di calore, Combustione e Radiazione termica su Nessuno, poiché nel problema non è definito alcun trasferimento di calore. Selezionare la modalità Turbolenza come caratteristica del fluido nell'LCN, che è un fluido laminare9.
  11. Eseguire il software utilizzando Doppia precisione e Avvio diretto come tipo di invio. Monitorare la massa e la quantità di moto fino a quando i residui non scendono e diventano costanti. Dopo la convergenza della soluzione, misurare i dati FFSS utilizzando la sezione CFD-post del software CFD.

6. Post-elaborazione CFD

  1. Per rappresentare la FFSS sperimentata dagli osteociti e dai loro dendriti, inserire un nuovo contorno nella sezione dei risultati del software CFD. Crea un contorno FFSS scegliendo il taglio della parete sulle membrane osteociti-dendritiche come variabile al dominio.
    NOTA: Per mostrare meglio un FFSS elevato sulle membrane dendritiche, l'intervallo di FFSS è impostato su Specificato dall'utente per modificare i valori min/max di FFSS.
  2. Inserire un contorno delle linee di flusso di velocità all'interno del dominio lacunare-canalicolare a partire dalle bocchette. Impostate il campionamento su equidistanza e selezionate il numero di punti come 2500. Una sezione di animazione nel software CFD mostra accuratamente in 3D come le particelle di fluido fluiscono all'interno degli spazi lacunari-canalicolari utilizzando il grafico di velocità di flusso.
  3. Utilizza lo strumento Function Calculator nel software CFD per analizzare l'entità della FFSS o la velocità in base a parametri geometrici, specialmente dove ci sono vari modelli di osteociti (ad esempio, giovani o anziani). Misurare il volume e l'area superficiale dello spazio lacunare-canalicolare come parametri geometrici insieme ai valori FFSS massimi, minimi o medi.

Risultati

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Questo protocollo descrive come sviluppare modelli di osteociti di derivazione confocale per studiare la quantità di stress di taglio del flusso di fluido a cui un osteocita e i suoi processi dendritici sono sottoposti a causa del carico meccanico. Un topo C57BL6 invecchiato e uno giovane sono stati selezionati per costruire modelli di osteociti confocali basati su immagini giovani e invecchiati. Altri sei modelli di osteociti simulati sono stati generati dallo stesso modello di osteociti giovani utilizzando la tecnica di modifica della geometria per studiare l'alterazione della morfologia LCN dovuta all'invecchiamento o alla malattia ossea. I parametri modificati dalla geometria includevano lo spessore lacunare-canalicolare, la densità canalicolare e il diametro. I modelli di osteociti modificati sono stati sviluppati cambiando un parametro alla volta mantenendo gli stessi gli altri parametri. Pertanto, l'effetto di ciascuno dei parametri morfologici sulla FFSS viene esaminato isolatamente. I risultati hanno rivelato che la quantità di FFSS sperimentata da un osteocita era diversa in questi modelli di osteociti, mostrando la dipendenza della FFSS dalla morfologia LCN. I valori FFSS sono stati previsti su varie parti del modello di osteociti, come il corpo cellulare dell'osteocita o le membrane dendritiche. I dendriti in tutti i modelli hanno sperimentato valori FFSS maggiori rispetto alla membrana del corpo cellulare degli osteociti.

La Figura 5 mostra i contorni FFSS per i modelli di osteociti giovani e anziani generati direttamente da stack di immagini FITC confocali e altri sei modelli di osteociti sviluppati dal Modello 1 utilizzando la tecnica di modifica della geometria. La FFSS media sugli osteociti e sulle membrane dendritiche nel modello di osteociti giovani (Modello 1) era di 0,42 Pa, che è più significativa della FFSS media di 0,13 Pa nel modello di osteociti invecchiati (Modello 2). I dati ottenuti mostrano un aumento della FFSS media negli osteociti con spazio lacuno-canalicolare più ampio (Modello 7 e Modello 8) e una diminuzione della FFSS negli osteociti con densità canalicolare inferiore (Modello 3 e Modello 4), mentre la FFSS non è cambiata significativamente al variare del diametro dei dendriti nel Modello 5 e nel Modello 6. Il modello 2 e il modello 4 avevano i valori FFSS più bassi, rispettivamente di 0,19 Pa e 0,13 Pa. L'entità della FFSS nel Modello 8 è maggiore rispetto agli altri modelli di osteociti. Non solo la maggior parte dei dendriti è di colore rosso nel modello 8, ma anche il corpo cellulare degli osteociti sperimenta una FFSS più elevata rispetto ad altri modelli.

La FFSS sperimentata dagli osteociti è stata anche presentata sulla base del volume e dell'area superficiale dello spazio lacunare-canalicolare, che sono stati ottenuti mediante post-processing in ANSYS CFX per scoprire la correlazione tra FFSS e la struttura alterata della LCN. È stato anche possibile misurare l'area superficiale di ciascun modello esposta a FFSS superiore a 0,8 Pa, che si ritiene sia il livello di FFSS che causa la formazione ossea 21,22. La modellazione degli osteociti ha mostrato una correlazione tra la FFSS media e il volume o l'area superficiale dello spazio lacunare-canalicolare per tutti i modelli di osteociti, come mostrato nella Tabella 1. L'osteocita invecchiato (Modello 2) e l'osteocita simulato di mezza età (Modello 4) con la più bassa densità canalicolare avevano la superficie lacunare-canalicolare più bassa di 1372,7 μm2 e 1122,6 μm2. Il modello 2 e il modello 4 avevano anche il volume più basso dello spazio lacunare-canalicolare, rispettivamente di 229,4 μm3 e 203,5 μm3, che può essere correlato alle loro basse quantità di FFSS. Il modello 6, con il diametro del dendrite più grande, aveva la più grande superficie lacunare-canalicolare. Il modello 8 aveva il più grande volume di spazio lacunare-canalicolare e i più grandi valori di FFSS.

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Figura 1: Immagini confocali su un singolo piano Z di una sezione trasversale di un femore colorato con FITC scattate con obiettivi di olio 5x, 20x e 100x. La rete lacunare-canalicolare è visibile nell'immagine scattata con l'obiettivo 100x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Modelli confocali basati su immagini di un osteocita giovane (Modello 1) e di un osteocita invecchiato (Modello 2) generati dal femore colorato con FITC di un topo C57BL6 di 4 mesi e di 22 mesi. L'immagine ingrandita mostra lo spessore lacunare-canalicolare (LC) per l'osteocita giovane e lo stesso per l'osteocita invecchiato. L'immagine del modello 1 è stata modificata con il permesso di Niroobakhsh et al.23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Sei modelli di osteociti sviluppati dal Modello 1 utilizzando la tecnica di modifica della geometria. La densità canalicolare è stata ridotta per generare il Modello 3 (di mezza età simulato) e il Modello 4 (di età simulata), mentre il diametro dei dendriti e lo spessore LC erano gli stessi del Modello 1. Il modello 5 e il modello 6 sono stati sviluppati con la stessa densità canalicolare e lo stesso spessore LC del modello 1, mentre il loro diametro dei dendriti era due e quattro volte maggiore del modello 1. Il modello 7 e il modello 8 avevano rispettivamente uno spessore lacunare-canalicolare due volte e quattro volte maggiore, mentre la densità canalicolare e il diametro dei dendriti sono rimasti gli stessi del modello 1. L'immagine del modello 1 è stata modificata con il permesso di Niroobakhsh et al.23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Modello di giovani osteociti confocale basato su immagini 3D. Vista 3D dell'area della sezione trasversale del modello confocale di giovani osteociti basato su immagini che raffigura la modellazione dello spazio lacunare-canalicolare, che viene utilizzato per l'analisi dei fluidi intorno all'osteocita e ai dendriti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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La Figura 5: La distribuzione della FFSS per tutti i modelli di osteociti mostra la dipendenza dell'entità della FFSS dalla morfologia degli osteociti. Le regioni rosse mostrano i valori FFSS più elevati, specialmente sulle membrane dendritiche piuttosto che sul corpo cellulare degli osteociti. Questa immagine è stata modificata con il permesso di Niroobakhsh et al.23. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

ModelliSuperficie lacunar-canalicolare (μm2)Volume dello spazio lacunare-canalicolare (μm3)Ave FFSS (Pa)
Modelli confocali di osteociti basati su immaginiModello 12652.92610.42
Giovane (4 mesi)
Modello 21372.7229.40.19
Invecchiato (22 mesi)
Modelli di osteociti simulati generati utilizzando la tecnica di modifica della geometriaModello 31530.4242.60.27
(Simulazione di mezza età)
Modello 41122.6203.50.13
(Invecchiato simulato)
Modello 53724.9302.90.49
(2 x diametro dendrite)
Modello 647913370.57
(4 x diametro dendrite)
Modello 73116.3440.61.17
(2 x spessore LC)
Modello 83542.2658.21.89
(4 x spessore LC)

Tabella 1: Confronto tra modelli di osteociti. Confronto della FFSS media, del volume dello spazio lacunare-canalicolare e dell'area superficiale in otto distinti modelli di osteociti, inclusi due modelli confocali basati su immagini e sei modelli simulati generati dal Modello 1 utilizzando la tecnica di modifica della geometria.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo delinea una tecnica di imaging confocale per la visualizzazione e la modellazione computazionale degli osteociti. Prima dell'imaging confocale, viene eseguito il processo di preparazione ossea per il sezionamento e la colorazione dei campioni ossei. Le immagini confocali con ingrandimento 100x vengono importate in vari software per sviluppare modelli computerizzati degli osteociti e dello spazio lacunare-canalicolare. Infine, viene condotta un'analisi CFD sui modelli confocali basati su immagini per modellare la FFSS che circonda gli osteociti e le membrane dendritiche a causa dell'attività fisica, che è tecnicamente impegnativa in vivo a causa dell'inaccessibilità degli osteociti nella matrice ossea. Il protocollo fornito è utile anche per determinare altre sollecitazioni o deformazioni utilizzando un approccio agli elementi finiti o di interazione fluido-struttura (FSI) nella modellazione multifisica.

L'imaging confocale è stato utilizzato per visualizzare l'LCN 7,9,24,25 grazie alle immagini ad alta risoluzione che possono essere ottenute utilizzando la colorazione FITC dell'osso. Sebbene il diametro dei canalicoli sia vicino al limite di risoluzione del microscopio, è possibile ottenere immagini confocali affidabili dei canalicoli, che possono catturare la maggior parte dei canalicoli. A causa del diametro più piccolo dei dendriti degli osteociti, è tecnicamente più difficile acquisire con precisione le immagini dei dendriti. È stata quindi sviluppata una tecnica utile per modellare l'osteocita e i dendriti da immagini confocali dell'LCN riducendone il volume utilizzando un'operazione di livellamento nel software. Alcuni altri studi pubblicati hanno utilizzato un approccio simile per compensare l'LCN per generare la membrana osteocitaria-dendritica9. L'altro vantaggio della tecnica di levigatura è il miglioramento di alcuni errori di imaging nel CLSM, come l'allungamento del diametro canalicolare che si verifica sull'asse Z a causa della minore risoluzione di imaging sull'asse Z, che è una caratteristica dell'imaging ottico. La deconvoluzione è anche considerata un metodo alternativo per ridurre l'allungamento ottico nella direzione Z poiché migliora il rapporto segnale/rumore nel set di dati originale. Lo spazio lacunare-canalicolare è modellato a partire da LCN e membrane osteociti-dendritiche per analizzare il profilo del fluido all'interno dell'LCN.

In particolare, è stata introdotta una nuova tecnica rispetto ai metodi esistenti per sviluppare modelli di osteociti modificati in geometria senza sacrificare un altro topo. La tecnica di modifica della geometria aiuta anche a simulare l'alterazione della microstruttura ossea dovuta all'invecchiamento o a malattie ossee come l'osteoporosi, il diabete e condizioni come la carenza di perlecan, ecc. In questa tecnica, è stato utilizzato un modello confocale di osteociti basato su immagini di un topo giovane per modellare la morfologia di osteociti anziani o di altre malattie ossee modificando parametri come la densità canalicolare, lo spazio lacunare-canalicolare e il diametro dei dendriti. Questo approccio è stato convalidato dalla somiglianza dei due modelli di osteociti invecchiati, uno dalla modellazione confocale basata su immagini di un osteocita reale da un topo di 22 mesi e l'altro dalla modellazione di modifica della geometria di un osteocita originariamente ripreso da un topo di 4 mesi riducendo la sua densità canalicolare. Questi due modelli di osteociti invecchiati hanno mostrato un'entità FFSS simile, che era la più bassa tra tutti i modelli di osteociti. La tecnica di modifica della geometria potrebbe avere molte applicazioni in diversi campi biologici in quanto può prevedere risultati comparabili a modelli di osteociti generati utilizzando osteociti reali di un animale. Alcuni dei limiti di questo lavoro includono la perdita di alcuni dettagli della rugosità superficiale a causa della tecnica di levigatura e il fatto che i diametri canalicolari sono al limite della risoluzione dei microscopi confocali, il che potrebbe potenzialmente portare a una certa imprecisione per i canalicoli con diametri più piccoli, e anche all'idealizzazione del flusso del fluido invece di modellare utilizzando il flusso oscillatorio.

Per dimostrare la funzionalità della tecnica, i valori FFSS degli osteociti sono stati misurati per modelli di osteociti distinti generati da un topo giovane e uno anziano o utilizzando la tecnica di modifica della geometria. Uno dei risultati degni di nota utilizzando questi modelli computerizzati è stato che il volume dello spazio lacunare-canalicolare è direttamente proporzionale alla FFSS media sperimentata dagli osteociti. Questa nuova scoperta, che non era stata studiata in precedenza, può avere varie applicazioni nel determinare la meccano-responsività degli osteociti, in quanto può correlare la morfologia della rete di osteociti alla FFSS rilevata dagli osteociti e dai loro processi.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desiderano ringraziare la National Science Foundation (NSF, numero di premio NSF-CMMI-1662284 PI: T Ganesh), il National Institute of Health (NIH - NIA P01 AG039355 PI: LF Bonewald) e (NIH/SIG S10OD021665 e S10RR027668 PI: SL Dallas) e il programma di sovvenzioni per la ricerca della University of Missouri-Kansas City School of Graduate Studies.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Carta abrasiva a grana 1.200Buehler30-5170-012-100
Software 3-MaticSoftware Materialisehttps://www.materialise.com/en/industrial/software/3-maticper l'ottimizzazione dei dati 3D
abrasiva a grana 600Buehler30-5118-600-100
Carta abrasiva a grana 800Buehler30-5170-800-100
ANSYSANSYShttps://www.ansys.com/software di simulazione
Isotiocianato di fluoresceina (FITC)Software Sigma-AldrichF7250
ImageJhttps://imagej.net/ij/
Olio da immersione per microscopiLeica Microsystems195371-10-9
Leica TCS Sp5 II microscopio confocale Leica MicrosystemsTCS Sp5 II 
Sega diamantata Leitz 1600 foro internoLeica 
Software MIMICS Innovation SuiteMaterialisehttps://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suiteSoftware di elaborazione 3D basato su immagini
Mezzo di montaggio PermountFisher scientificSP15-500
Sampl-Kwick Kit acrilico a polimerizzazione rapidaBuehler20-3560
Agitatore da laboratorio a piattaforma singolaINC scientifico affidabileModello 55S
Carta

Riferimenti

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