Introduzione
La ricerca nel campo della nefrologia ha migliorato significativamente il benessere delle persone colpite da malattie renali. Tuttavia, le malattie renali sono ancora un grave problema sanitario che colpisce oltre il 10% della popolazione ed è responsabile dell'aumento dei costi sanitari e della mortalità in tutto il mondo1. Purtroppo, i meccanismi precisi che portano alla malattia renale non sono stati completamente chiariti. Questa raccolta di metodi JoVE evidenzia le recenti strategie per definire la fisiopatologia renale. In particolare, i gruppi di ricerca presentano un nuovo modello animale e metodi per valutare o trattare la malattia renale utilizzando modelli sperimentali o campioni clinici. Il lavoro presentato in questa raccolta è un'altra serie di eccellenti contributi nel campo della nefrologia e può fornire nuove strade per prevenire, diagnosticare o trattare le malattie renali in futuro.
Un modello animale traslazionale di danno renale acuto
Il danno renale acuto (AKI) è una forma comune di malattia renale2. Diversi modelli sperimentali sono stati utilizzati per studiare il danno da ischemia/riperfusione renale (I/R) 3,4,5. Tuttavia, la traduzione di questi risultati per migliorare il contesto clinico ha posto molte sfide poiché ci sono differenze significative tra le specie6. Doulamis et al. hanno sviluppato un modello di I/R renale suino utilizzando un catetere a palloncino bilaterale per affrontare questo problema7. Il loro modello era altamente riproducibile, causava una riduzione della produzione urinaria e stimava la velocità di filtrazione glomerulare e aumentava i livelli di creatinina plasmatica e azoto ureico nel sangue negli animali. Inoltre, l'esame istologico e dei tessuti macroscopici ha rivelato infarto ed emorragia all'interno dei reni. Questo nuovo modello è clinicamente rilevante e può aiutare a comprendere ulteriormente l'AKI nell'uomo.
Strategie per esaminare i meccanismi cellulari coinvolti nelle malattie renali
Le citochine possono contribuire al danno renale e alla riparazione8. Pertanto, è importante identificare la fonte e il ruolo delle citochine all'interno del rene. Taguchi et al. hanno sviluppato una tecnica per comprendere la secrezione proteica utilizzando la brefeldina A (BFA), un inibitore della secrezione proteica, in modelli murini di AKI e malattia renale cronica9. Hanno iniettato BFA nella vena caudale dei topi e successivamente hanno valutato i loro reni utilizzando la colorazione in immunofluorescenza. Hanno determinato che il BFA inibiva la secrezione proteica e causava l'accumulo di citochine in alcuni tipi di cellule utilizzando marcatori specifici per le cellule. Questo innovativo protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare la secrezione proteica in diverse patologie renali.
Un altro meccanismo proposto che si ritiene contribuisca alla malattia renale sono i microRNA (miRNA)10, che sono noti per degradare e inibire la trascrizione dell'mRNA. È stato riportato che esiste una correlazione tra l'espressione dei miRNA nei tessuti e nel siero nell'uomo11. Tuttavia, non esiste un metodo per purificare e quantificare sia i reni di topo che il miRNA sierico. Yanai et al. hanno ottimizzato un metodo quantitativo di reazione a catena della polimerasi in tempo reale per valutare l'espressione del miRNA nel rene e nel siero di topi con compromissione renale dipendente dall'età12. Hanno anche stabilito una correlazione tra entrambi i livelli di miRNA. Questo protocollo è ad alto rendimento e potrebbe essere applicabile a molte condizioni patologiche.
Nuove tecniche di imaging per valutare le malattie renali
L'imaging non invasivo del rene può valutare i difetti strutturali e funzionali. Tuttavia, ci sono alcune limitazioni con i metodi attuali. Per aggirare questo problema, Holmes et al. hanno sviluppato una tecnica di imaging 3D semplice ed economica basata sulla tecnologia degli ultrasuoni robotici (US) per quantificare la funzione renale, epatica e cardiaca13. Il loro protocollo ha fornito immagini di alta qualità e potrebbe essere utilizzato per studi in cui è possibile monitorare il tessuto macroscopico, le dimensioni del tumore o i benefici delle terapie. Il più grande punto di forza di questo metodo è l'elevata produzione di dati. Ad esempio, è possibile visualizzare tre ratti contemporaneamente o 20-30 topi all'ora. Questo protocollo è un'alternativa rapida alle tradizionali modalità di imaging non invasive.
Un altro gruppo di ricerca della collezione ha utilizzato l'imaging per studiare l'ostruzione ureterale unilaterale (UUO), un modello di lesione che induce glomeruli superficiali. Wagner et al. hanno utilizzato la microscopia intravitale a due fotoni per monitorare l'UUO nei ratti che sviluppano glomeruli superficiali e in quelli che non sviluppano glomeruli superficiali14. La microscopia a due fotoni fornisce una maggiore profondità di penetrazione e l'esame di diverse regioni del rene. Gli autori hanno scoperto che l'UUO induceva infiammazione e fibrosi e diminuiva anche il flusso di globuli rossi nei reni di ratto. Quantificare il flusso sanguigno, la vasocostrizione e la dilatazione in risposta ai farmaci e all'infiammazione sono alcuni dei vantaggi offerti da questo metodo. Collettivamente, questi studi forniscono nuove strategie di imaging per studiare vari tessuti.
Stima della nanocristalliluria come predittore di malattia renale
È stato proposto che la valutazione dei cristalli urinari potrebbe essere utile per prevedere il rischio di calcoli renali15. Abbiamo sviluppato un protocollo per quantificare i nanocristalli urinari (≤1 μm) di adulti sani prima e dopo aver consumato un carico alimentare di ossalato noto per indurre livelli di ossalato urinario16. Abbiamo isolato e analizzato nanocristalli urinari contenenti calcio utilizzando un fluoroforo di calcio e un'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA). Abbiamo determinato che l'NTA può rilevare in modo specifico i nanocristalli contenenti calcio nelle urine e i risultati sono stati coerenti con i nostri risultati precedenti17. Questo protocollo può essere utilizzato per studiare i nanocristalli urinari nei formatori di calcoli o in vari campi di ricerca in cui si verificano cristallopatie.
Approcci terapeutici per il trattamento delle malattie renali
I miRNA imitatori sintetizzati artificialmente sono stati suggeriti come possibile trattamento per le malattie renali. Tuttavia, l'RNAasi sierica può degradare i miRNA esogeni che imitano18. Yanai et al. hanno prodotto vettori non virali basati su un polimero lineare, nanoparticelle di polietilenimmina (PEI-NP), per fornire in modo sicuro un miRNA imitatore ai reni dei topi18. Hanno dimostrato che il mimico era efficace nella sovraespressione del miRNA bersaglio. I limiti di questo metodo includono la notevole quantità di PEI-NP necessarie per i modelli animali più grandi e la mancanza di specificità per i reni. Tuttavia, sulla base del successo dei vaccini a RNA, i miRNA imitatori potrebbero essere un'opzione terapeutica ideale per le malattie renali.
Osservazioni conclusive
La ricerca completa qui presentata introduce un nuovo modello animale e tecniche per studiare le questioni prevalenti che circondano la nefrologia. È importante notare che alcuni di questi metodi potrebbero essere applicati ad altre aree al di fuori della nefrologia. I prossimi passi logici saranno quelli di studiare come questi metodi potrebbero essere testati in modelli animali più grandi e studi clinici. Ci auguriamo che la condivisione di questi protocolli amplierà le nostre conoscenze sulla fisiopatologia renale e darà alla luce nuove idee per mitigare la malattia renale negli individui.