Questo protocollo fornisce una strategia di combinazione di due erbe per trattare le cellule PC12 ferite. Il protocollo fornisce un riferimento per ottimizzare la migliore modalità di applicazione della medicina tradizionale cinese (MTC).
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Esplorare la strategia di combinazione di due erbe per trattare le cellule PC12 ferite
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
In considerazione dei vantaggi della combinazione della medicina tradizionale cinese (MTC) nel trattamento dell'ischemia cerebrale, abbiamo studiato le differenze nell'efficacia e nel meccanismo tra la combinazione di preparazione e la combinazione di componenti al fine di esplorare la strategia di combinazione di due erbe per trattare le cellule PC12 danneggiate. Il cloruro di cobalto (CoCl2) combinato con un mezzo privo di glucosio è stato impiegato per indurre il danno ossidativo delle cellule PC12. Quindi, la combinazione ottimale di iniezione di Astragalus mongholicus (Ast) e Erigeron breviscapus (Eri) è stata selezionata e combinata seguendo metodi di progettazione uniformi dopo aver esaminato la loro concentrazione sicura ed efficace sulle cellule PC12. Inoltre, la combinazione di componenti esaminata comprende 10 μM di astragaloside A, 40 μM di scutellarina e 75 μM di acido clorogenico in due erbe. Quindi, MTT, Annexin V-FITC / PI, immunofluorescenza e analisi Western blot sono stati utilizzati per valutare l'efficacia e il meccanismo della combinazione di preparazione e della combinazione di componenti su cellule PC12 danneggiate. I risultati hanno mostrato che la combinazione di preparazione ottimale per la pro-sopravvivenza cellulare era l'iniezione di Ast e la capsula di Eri con una concentrazione di 6:1,8 (μM). La combinazione di componenti (10 μM di astragaloside A, 40 μM di scutellarina e 75 μM di acido clorogenico) è risultata più efficace della combinazione di preparazione. Entrambe le combinazioni hanno notevolmente ridotto la velocità apoptotica, l'intensità di fluorescenza della caspasi-3 e il livello intracellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS); nel frattempo, hanno sovraregolato i livelli di espressione di p-Akt / Akt, Bcl-2 / Bax e Nrf2. Questi effetti erano più evidenti nella combinazione di componenti. In conclusione, entrambe le combinazioni possono inibire la lesione indotta da CoCl2 combinata con un mezzo privo di glucosio sulle cellule PC12, promuovendo così la sopravvivenza cellulare. Tuttavia, l'efficienza della combinazione di componenti rispetto alla combinazione di preparazione può essere dovuta alla sua più forte regolazione della via di segnalazione PI3K / Akt / Nrf2 correlata allo stress ossidativo e all'apoptosi.
Introduzione
L'ischemia cerebrale cronica, causata da ipoperfusione cerebrale, è una malattia comune nelle persone di mezza età e negli anziani1. Come una malattia da ischemia occulta a lungo termine, può portare a disfunzione neurologica progressiva o persistente. I principali meccanismi patologici includono l'apoptosi cellulare e il danno ossidativo, che portano a disfunzioni neurologiche progressive o persistenti; questa è la base patologica della malattia di Alzheimer, della demenza vascolare e di altre malattie e influisce seriamente sulla qualità della vita dei pazienti. Tuttavia, c'è ancora una mancanza di farmaci ideali nella medicina moderna per tr....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
1. Preparazione del reagente
- Preparare il terreno completo aggiungendo 90 ml di terreno ad alto contenuto di zucchero DMEM, 10 ml di siero bovino fetale (FBS) e 1 ml di soluzione di penicillina-streptomicina in un matraccio di coltura sterile da 125 ml. Miscelare il mezzo completo e conservare a 4 °C in condizioni chiuse.
- Preparare la soluzione di CoCl 2 aggiungendo 0,02 g di polvere di CoCl2 (accuratamente pesata) in 10 ml di terreno senza zucchero DMEM (completamente sciolto) per ottenere una soluzione madre da 8,4 mM. Filtrare la soluzione con un filtro batterico da 0,22 μm, sigillarla e conservarla a 4 °C ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Lo screening della combinazione ottimale di Ast iniezione ed Eri capsule è mostrato nella Figura 1. Il tasso di sopravvivenza cellulare dell'iniezione di Ast e della capsula Eri sulle cellule PC12 normali è mostrato nella Figura 1A. La vitalità cellulare era inferiore al 95% con iniezione di Ast a concentrazioni superiori a 12 μM (Figura 1A) e capsula Eri a concentrazioni superiori a 5 μM (Figura 1A), indicando che la concentrazione.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
C'è ancora una mancanza di farmaci ideali per il trattamento dell'ischemia cerebrale nella moderna pratica clinica2. Sotto la guida dell'integrazione del qi e dell'attivazione del metodo di circolazione sanguigna, Ast, Eri e altri preparati sono stati utilizzati in combinazione nella pratica clinica della MTC e hanno ottenuto buoni vantaggi globali13,14,15. Un gran numero di studi ha dimostrato che Ast pu.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata da progetti chiave di ricerca e sviluppo del Dipartimento provinciale di scienza e tecnologia del Sichuan (2020YFS0325).
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Cabina di biosicurezza di classe II serie 1300 | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 1374 | |
| 3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro | Guangzhou saiguo biotech Company | 1334GR001 | MTT |
| ACEA NovoExpress 1.4.0 | ACEA Biosciences, | Inc-Akt | |
| Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 10176-2-AP | ||
| Citometria a flusso analitica | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 62-2-1810-1027-0 | |
| Kit di rilevamento dell'apoptosi Annexin V-FITC | Beyotime Biotechnology Company | C1062L | |
| Iniezione di astragalo | Heilongjiang Zhenbao Azienda farmaceutica dell'isola | A03190612144 | Ast iniezione |
| Astragaloside A | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 84687-43-4 | |
| Bax | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 60267-1-Ig | |
| Kit di quantificazione delle proteine BCA | Beyotime Biotechnology Company | P0012 | |
| Bcl-2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 26593-1-AP | |
| Incubatori ad anidride carbonica | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 0816-2014 | |
| Caspase-3 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 19677-1-AP | |
| Acido clorogenico | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 327-97-9 | |
| Cloruro di cobalto esaidrato | Merck Biotechnology, Inc. | 7791-13-1 | CoCl2 |
| Dimethyl sulfoxide | Guangzhou saiguo biotech Company | 2020112701 | DMSO |
| Idrogeno fosfato disodico dodecaidrato | Chengdu Kolon Chemical Company | 2020090101 | |
| DMEM alto contenuto di zucchero | Thermo scientific Hyclone | 2110050 | |
| DMEM senza zucchero | medio Beijing Solarbio life sciences Azienda | ||
| ECL fluido luminoso | Lianshuo Biological Company | WBKLS0500 | |
| Bilancia elettronica | Haozhuang Hengping Scientific Instrument Co., Ltd., Shanghai, Cina | FA1204 | |
| Strumento per elettroforesi | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1658026 | |
| Erigeron breviscapus capsula | Yunnan Biogu Pharmaceutical Company | Capsula Z53021671 | Eri |
| Siero fetale bovino | Seasons Institute of Biological Engineering | 20210402 | Microscopio fluorescente FBS |
| Olympms Corporation | IX71-F32PH | ||
| Gel imager | Bio-Rad Laboratories (Shanghai) Co., Ltd | 1708265 | |
| Anticorpo secondario anti-topo di capra | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| Anticorpo secondario anti-coniglio di capra | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | SA00001- 2 | |
| IBM SPSS Statistics versione 26.0 | International Business Machines Corporation, USA-ImageJ | ||
| 1.8.0 | National Institutes of Health, USA-software | di imaging | |
| Immunol a fluorescenza kit di colorazione | Beyotime Biotechnology Company | P0196 | |
| KCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021070901 | |
| Marker | Thermo Fisher Scientific Instruments Company | 26616 | |
| Lettore di micropiastre | Perkin Elmer Corporate Management (Shanghai) Co. | ||
| Motic Microscopio invertito | Nanda Scientific Instruments Co. | ||
| NaCl | Chengdu Kolon Chemical Company | 2014081301 | |
| latte scremato | Beyotime Biotechnology Company | P0216 | |
| Nrf2 | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 16396-1-AP | |
| P-Akt | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| PC12 cellule | Accademia cinese delle scienze | ||
| Soluzione di penicillina-streptomicina | Thermo scientific Miscela di inibitori della proteasi dell'iclone | SV30010 | |
| della fosfatasi | Beyotime Biotechnology Company | P1045 | |
| Diidrogeno fosfato di potassio | Chengdu Kolon Chemical Company | 2015082901 | |
| Kit di analisi delle specie reattive dell'ossigeno | Beyotime Biotechnology Company | S0033S | |
| Soluzione di lisi RI-PA | Beyotime Biotechnology Company | P0013B | |
| Scutellarin | Chongqing Gao Ren Biotechnology Company | 27740-01-8 | |
| Tampone di caricamento del campione SDS-PAGE, 5x | Beyotime Biotechnology Company | P0015L | |
| Puntali filtranti sterili (0,22 µ m) | Merck Biotechnology, Inc. | ||
| Tris-base | Guangzhou saiguo biotech Company | 1115GR500 | Tbs |
| Tripsina | Thermo scientifico Hyclone | J190013 | |
| Tween-20 | Chengdu Kolon Chemical Company | 2021051301 | |
| oscillatore a vortice | OHAUS International Co., Ltd., Shanghai, Cina | VXMNAL | |
| β-actina | Wuhan Three Eagles Proteintech Group, Inc | 66009-1-IG |
Riferimenti
- Mendelevich, E. G. Chronic cerebral ischemia, and dizziness. Zhurnal Nevrologii i Psikhiatrii Imeni SS Korsakova. 122 (3), 22-26 (2022).
- Gao, L. Expert c....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
