Ablazione laser e microscopia intravitale per studiare il rimodellamento intestinale

Sommario

Qui, presentiamo un metodo per ottenere immagini dell'intestino dopo la ferita indotta dal laser. Esponendo l'intestino del topo a un laser multifotone, la perdita di una cripta singola o multipla viene indotta localmente. Visualizzando ripetutamente l'area danneggiata per mesi, vengono catturate le dinamiche in tempo reale del recupero intestinale.

Abstract

Studiare il recupero intestinale in vivo è una sfida tecnica squisita. La mancanza di protocolli di imaging longitudinale ha impedito una comprensione più profonda delle dinamiche della scala cellulare e tissutale che orchestra la rigenerazione intestinale. Qui, descriviamo un metodo di microscopia intravitale che induce localmente danni tissutali alla scala della singola cripta e segue la risposta rigenerativa dell'epitelio intestinale nei topi vivi. Singole cripte o campi intestinali più grandi sono stati ablati da un laser a infrarossi multifotone ad alta intensità in modo controllato nel tempo e nello spazio. La successiva imaging intravitale ripetitiva a lungo termine ha permesso il monitoraggio delle aree danneggiate nel tempo e ha permesso il monitoraggio delle dinamiche della cripta durante il recupero dei tessuti per un periodo di più settimane. Eventi di rimodellamento della cripta come la fissione della cripta, la fusione e la scomparsa sono stati osservati nel tessuto vicino dopo danni indotti dal laser. Questo protocollo consente lo studio della dinamica della cripta sia in ambito omeostatico che fisiopatologico, come l'invecchiamento e l'iniziazione del tumore.

Introduzione

Il rivestimento epiteliale dell'intestino è costantemente sfidato da acidi gastrici, tossine e microbiota che possono causare la rottura della barriera epiteliale. La struttura intestinale e l'organizzazione dei tessuti sono specializzate per auto-rinnovarsi e riparare costantemente i danni. L'epitelio a strato singolo dell'intestino tenue è organizzato in unità crypt-villus¹. Nell'omeostasi, le cellule staminali intestinali Lgr5⁺ autorinnovanti che risiedono alla base della cripta danno origine a progenie differenziata. Le cellule figlie differenziate viaggiano verso la punta dell'asse dei villi in modo a nastro trasportatore, dove vengono versate in modo che il rivestimento intestinale venga reintegrato in 3-5 giorni ^2,3. A lungo termine, non tutte le cellule Lgr5⁺ contribuiscono allo stesso modo al rinnovamento tissutale, poiché ciò dipende anche dalla capacità delle cellule di muoversi contro il nastro trasportatore verso la base della cripta (cioè il movimento retrogrado)^4,5. Infatti, dopo l'ablazione delle cellule Lgr5⁺ da, ad esempio, radiazioni, le cellule progenitrici al di fuori della base della cripta si spostano nella base per dedifferenziare e ricostituire il pool di cellule staminali ^6,7,8.

L'infiammazione acuta può causare la perdita di cellule staminali Lgr5^{+ 9,10}. Oltre alla perdita di cellule staminali, molti fattori esterni possono causare danni acuti all'epitelio a scala di cripta. Radiazioni, trattamenti chimici e antibiotici hanno dimostrato di danneggiare le cripte intestinali e i villi¹¹. Campi più grandi di cripte e villi possono essere influenzati da infezioni batteriche, virali e parassitarie¹². L'intestino possiede una notevole capacità di recuperare dai danni interni ed esterni alla scala della cripta mediante fissione della cripta (una divisione di una cripta in due)¹³. Dopo il ferimento, le cripte nell'area adiacente al danno subiscono la fissione per ricostituire il numero della cripta. Questo fenomeno si verifica anche, anche se in misura minore, durante l'omeostasi^14,15. Per controbilanciare un potenziale aumento del numero di cripte durante l'omeostasi, le cripte possono anche fondersi (fondendo due cripte in una)^16,17. Non è noto se la fusione della cripta abbia anche un ruolo nel ristabilire il numero di cripte dopo il ferimento. Inoltre, le dinamiche e i fattori normativi di questo processo devono ancora essere chiariti.

I modelli di lesione sono indispensabili per studiare la rigenerazione dei tessuti in vivo. Vari modelli di lesioni sono stati utilizzati per studiare la rigenerazione del tessuto intestinale. Precedenti strategie sperimentali impiegavano radiazioni ad alte dosi per esaurire i pool di cellule staminali¹⁸ o il trattamento con destrano solfato sodico (DSS) per indurre colite cronica e acuta e perdita di cripta nei topi ^19,20. L'ablazione unicellulare per via genetica o ottica è stata utilizzata per perfezionare il danno tissutale ed è stata considerata uno strumento interessante per districare il ruolo delle cellule staminali e progenitrici ^21,22 e studiare la rigenerazione vascolare²³. Inoltre, è stato sviluppato un sistema di lesioni da biopsia per indurre danni in campi più ampi di diverse cripte e villi²⁴. È importante sottolineare che la risposta all'insulto dannoso può variare lungo l'asse prossimale-distale dell'intestino, come riportato per le radiazioni, che hanno causato più danni nell'intestino tenue che nel colon²⁵. Ciò evidenzia la necessità di metodi mirati che controllino sia l'entità dell'insulto dannoso che la sua localizzazione nel tratto intestinale.

L'entità del danno e il recupero sono stati convenzionalmente valutati con mezzi statici, che forniscono informazioni limitate sulla dinamica del recupero dei tessuti. La microscopia intravitale (IVM) ha aperto opportunità uniche per quantificare il comportamento delle cellule staminali, il rimodellamento epiteliale e la rigenerazione in molti organi 26,27,28,29,30 e ha fornito approfondimenti di grande impatto sulla biologia intestinale 4,5,21,31,32,33,34^{, 35,36}.

Qui, descriviamo un metodo per causare danni intestinali spazio-temporali e catturare il recupero del rivestimento epiteliale intestinale. Utilizziamo due ablazioni laser basate su fotoni per danneggiare le cripte intestinali e seguire la risposta immediata della ferita e il recupero a lungo termine mediante microscopia intravitale ripetitiva. Il nostro protocollo consente di mappare il rimodellamento rigenerativo dell'architettura del tessuto intestinale in risposta al danno tissutale locale. Le dinamiche della cripta, compresi gli eventi di fissione e fusione, possono essere facilmente quantificate e tracciate nel tempo. L'applicazione dell'ablazione laser e dell'imaging intravitale ripetitivo può essere utilizzata come piattaforma per studiare le dinamiche su scala tissutale dell'architettura intestinale durante l'omeostasi e la fisiopatologia, come l'inizio del tumore.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti in questo studio sono stati condotti in conformità con le linee guida e l'approvazione dell'Animal Welfare Body (AWB) del Netherlands Cancer Institute (NKI).

NOTA: Consultare il comitato etico animale dell'istituto prima di eseguire qualsiasi esperimento sugli animali.

1. Preparazione per la chirurgia e l'imaging intravitale

1. Trattamenti pre-chirurgici
   1. Indurre K19-CreERT2³⁷ di 8-12 settimane: Rosa26-mTmG 38 e Lgr5eGFP-IRES-CreERT2¹⁸: Rosa26-Confetti³⁹ topi iniettando tamoxifene sciolto in olio di girasole per via intraperitoneale 4-6 settimane prima dell'intervento chirurgico (Figura 1).
   2. Applicare l'analgesia. Iniettare 200 μL di buprenorfina (0,1 mg/kg di peso corporeo) diluita in NaCl 0,9% per 30 g di topo per via sottocutanea 30 minuti prima dell'intervento. Somministrare carprofen (0,067 mg/ml) in un flacone contenente 125 ml di acqua potabile autoclavata non acidificata 24 ore prima dell'intervento. In alternativa, somministrare un'iniezione di carprofen per via sottocutanea (5 mg/kg) 30 minuti prima dell'inizio dell'intervento.
2. Preparazione per l'intervento chirurgico
   1. Introdurre strumenti chirurgici sterili autoclavati nell'armadio a rischio biologico.
   2. Accendere il termoforo e impostare la temperatura a 37 °C.
3. Preparazione per l'imaging intravitale
   1. Accendere la camera a temperatura controllata del microscopio almeno 4 ore prima dell'imaging per consentire un tempo sufficiente per la stabilizzazione della temperatura.
      NOTA: Il tempo necessario può variare a seconda della macchina utilizzata.
   2. Mantenere stabile la temperatura all'interno della camera climatica a 37 °C.
   3. Accendere il microscopio a due fotoni, lo scanner e il laser.
   4. Avviare il software di imaging.
   5. Sintonizzare la lunghezza d'onda del laser a 960 nm e aprire l'otturatore.

2. Chirurgia e imaging intravitale

1. Esposizione chirurgica dell'intestino
   1. Anestetizzare il mouse usando isoflurano al 2% -3% e posizionarlo su una piastra riscaldante, coperta con un panno sterile. Controllare la profondità dell'anestesia valutando la frequenza e la qualità della respirazione (un respiro/secondo) e controllando il riflesso del topo.
   2. Coprire gli occhi del topo con un unguento per gli occhi.
   3. Iniettare 200 μL di soluzione salina sterile preriscaldata per via sottocutanea.
   4. Rasare l'addome e rimuovere i capelli. Cambiare il panno sterile nell'area chirurgica.
   5. Inserire una sonda rettale per monitorare la temperatura del mouse.
      NOTA: La temperatura deve essere di circa 37 °C.
   6. Indossa un nuovo paio di guanti sterili.
   7. Pulire l'area chirurgica in modo circolare alternando scrub di soluzione antisettica seguita da etanolo all'80% tre volte. Rimuovere l'etanolo in eccesso con un batuffolo di cotone sterile.
      NOTA: a questo punto è fondamentale monitorare il mouse per l'ipotermia.
   8. Coprire il mouse con un drappo chirurgico sterile.
   9. Controllare il riflesso del mouse.
   10. Fare un'incisione verticale della linea mediana di ~ 10 mm attraverso la pelle usando un bisturi sterile.
   11. Incidi la linea alba usando le forbici per separare i muscoli retti dell'addome e aprire l'addome.
   12. Trova il cieco del topo usando tamponi di cotone sterili inzuppati in soluzione salina sterile preriscaldata per usarlo come punto di riferimento.
   13. Fai un piccolo taglio in un pezzo di garza sterile, bagnalo in soluzione salina sterile preriscaldata e posizionalo sopra l'incisione.
   14. Estrarre l'intestino con tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina sterile preriscaldata. Mantenere l'intestino idratato aggiungendo soluzione salina sterile preriscaldata.
   15. Posizionare una camera di imaging sterile su misura accanto al mouse.
   16. Trasferire il mouse nella scatola di imaging sterile preriscaldata.
   17. Posizionare l'intestino sul vetro sterile della scatola di imaging. Posizionare la testa del topo all'interno del tubo di inalazione della scatola di imaging, come mostrato nella Figura 1.
   18. Se necessario, fissare il mouse con pellicola flessibile sterile e nastro adesivo.
   19. Posizionare la scatola di imaging contenente il mouse nella camera del microscopio.
2. Imaging intravitale
   1. Monitorare il mouse durante l'imaging controllando la frequenza e la profondità della respirazione e la temperatura tramite una sonda rettale ogni 15 minuti. La percentuale di isoflurano deve essere mantenuta tra l'1% e il 2%. Regolare se necessario.
   2. Trova una regione nell'intestino usando l'oculare del microscopio.
   3. Ottenere una visione ad ampio campo della regione di interesse utilizzando la fotocamera interna del microscopio, come mostrato nella Figura 2A.
   4. Immagine della regione di interesse utilizzando il laser a 960 nm del microscopio multifotone. Regolare la potenza e la lunghezza d'onda del laser in base ai fluorofori utilizzati nell'esperimento.
   5. Acquisire uno z-stack di 10-20 step di 3 μm della regione di interesse.
3. Ablazione laser
   1. Scegli una singola posizione o più posizioni dal riquadro rivestito in precedenza.
   2. Utilizzare la funzione di calibrazione del punto di candeggina nel software di imaging con uno zoom di 32 e una risoluzione di 124 x 124 pixel con una velocità di scansione di 400 Hz, utilizzando la proprietà di scansione bidirezionale per 3-10 s, a seconda delle dimensioni del danno previsto. L'inizio del danno nell'area della cripta può essere riconosciuto da un aumento dell'autofluorescenza sia nei canali verde che rosso.
   3. Ripetere i due passaggi precedenti per più regioni nello stesso mouse.
   4. Dopo l'ablazione, acquisire z-stack delle regioni danneggiate per confermare la posizione e l'entità del danno.
4. Chiusura del sito chirurgico
   1. Posizionare il topo, mentre è ancora sotto anestesia, in un'area di sutura sterile.
   2. Inserire nuovamente l'intestino esposto nell'addome utilizzando tamponi di cotone sterili imbevuti di soluzione salina sterile preriscaldata.
   3. Suturare la linea alba eseguendo una semplice sutura continua utilizzando una sutura 5-0 assorbibile. Chiudere le estremità della sutura con nodi chirurgici.
   4. Ripeti lo stesso passaggio con lo strato della pelle.
   5. Spegnere la stazione di isoflurano, pulire e sterilizzare la scatola di imaging e l'intarsio.
   6. Pulire gli strumenti chirurgici con il detergente per strumenti chirurgici, il detergente enzimatico e il lubrificante per strumenti chirurgici. Una volta asciugati, sterilizzare gli strumenti chirurgici insieme alla scatola chirurgica nell'autoclave.
5. Assistenza post-operatoria
   1. Lascia che il topo si riprenda dall'intervento chirurgico mentre la gabbia viene posizionata sulla piastra riscaldante per ~ 1 ora.
      NOTA: posizionare il mouse con altri compagni di gabbia, se possibile. L'alloggio solitario non è necessario per il recupero.
   2. Controllare la temperatura del mouse ogni 15 minuti durante il recupero.
   3. Iniettare 200 μL di buprenorfina (0,1 mg/kg di peso corporeo) diluita in NaCl 0,9% per 30 g di topo per via sottocutanea 6-12 ore dopo l'intervento.
   4. Somministrare carprofen (0,067 mg/ml) in un flacone contenente 125 mL di acqua potabile autoclavata non acidificata per 72 ore dopo l'intervento.
   5. Pesare il topo e monitorare il benessere ogni giorno per 1 settimana dopo l'intervento.

3. Chirurgia ripetitiva e imaging intravitale

1. Chirurgia
   1. Al secondo punto temporale (almeno 1 settimana dopo la prima sessione di imaging), ripetere i passaggi 1.1.2, 1.2, 1.3 e 2.1.
2. Imaging intravitale
   1. Ripetere i passaggi 2.2.1-2.2.3.
   2. Usa il modello dei vasi sanguigni per trovare le stesse regioni di interesse ripreso nel primo punto temporale.
   3. Ripetere i passaggi 2.2.4 e 2.2.5.
3. Chiusura del sito chirurgico
   1. Ripetere il passaggio 2.4.1.
   2. Se il mouse non è destinato ad essere ripreso in un altro punto temporale, sacrificare il topo eseguendo la dislocazione cervicale in anestesia terminale. In caso contrario, continuare con il passaggio successivo.
      NOTA: Secondo le linee guida della Direttiva UE 2010/63/UE, appendice IV, la lussazione cervicale è un metodo accettabile.
   3. Ripetere i passaggi 2.4.2-2.4.6.
4. Assistenza post-operatoria
   1. Ripetere i passaggi 2.5.1-2.5.5.

Risultati

Per dimostrare il tipo di risultati che possono essere ottenuti dal metodo di ablazione laser combinato con l'imaging intravitale, abbiamo eseguito un esperimento come mostrato in Figura 1. In primo luogo, abbiamo iniettato K19-CreERT2;mTmG (K19cre-mTmG) e Lgr5eGFP-IRES-CreERT2; Topi Rosa26-Confetti (Lgr5cre-Confetti) con tamoxifene per marcare stocasticamente le cellule con uno dei colori Confetti (o proteina fluorescente verde [GFP] nel caso di topi mTmG). K19-cre induce il tracciamento del lignaggio da tutte le cellule epiteliali, mentre Lgr5-cre induce il tracciamento dalle cellule staminali solo ^8,18,37. L'iniezione di tamoxifene è stata somministrata 4-6 settimane prima dell'intervento chirurgico e la prima sessione di imaging al fine di ottenere cripte in cui tutte le cellule sono monoclonali per un certo colore. Una solida identificazione delle stesse regioni tissutali per diverse settimane è essenziale per tracciare il destino delle stesse cripte nel tempo. Le caratteristiche architettoniche dei tessuti intrinseci, come la vascolarizzazione, possono essere utilizzate come punti di riferimento tissutali affidabili e sono state qui registrate con la fotocamera interna del microscopio. Inoltre, etichettare una piccola frazione di cripte con (almeno due) colori diversi ha aiutato a riconoscere le stesse cripte in ogni sessione di imaging e a seguire il loro comportamento durante il processo rigenerativo dopo il danno laser. Dopo aver esposto chirurgicamente l'intestino del topo e acquisito sia le immagini della fotocamera che quelle fluorescenti della regione di interesse (Figura 2A), le impostazioni del punto di candeggina del laser multifotone possono essere utilizzate per ablare una o più cripte (Figura 2B, C). L'inizio del danno potrebbe essere riconosciuto da un aumento dell'autofluorescenza sia nei canali verde che in quelli rossi. Per studiare le dinamiche del recupero della cripta, la chirurgia e la procedura di imaging sono state ripetute settimane / mesi dopo la prima sessione di imaging e le strutture intrinseche del tessuto (vascolarizzazione e modelli di cripte etichettate clonalmente) sono state utilizzate come punti di riferimento per trovare la stessa esatta posizione della lesione (Figura 2). Quando questo metodo è stato applicato nei topi Lgr5Cre-Confetti, dove Lgr5-eGFP è espresso in modo irregolare, è stato possibile catturare i cambiamenti nei numeri e nelle forme della cripta in seguito al danno indotto dal laser (Figura 3). Mentre alcune regioni non hanno mostrato cambiamenti nel numero e nella struttura delle cripte (Figura 3B), altre regioni hanno mostrato un ampio rimodellamento delle cripte, come si vede nel numero di eventi di fissione e fusione della cripta (Figura 3C) e nella perdita di cripte 2 settimane dopo la lesione indotta dal laser (Figura 3D). Introducendo diverse dimensioni di danno e quantificando gli eventi di fissione, fusione e scomparsa dopo l'ablazione, come nell'esempio mostrato in (Figura 3E), la dinamica della rigenerazione indotta da lesioni può essere mappata in diversi modelli murini.

Figura 1: Rappresentazione schematica del setup sperimentale. La marcatura in vivo delle cellule intestinali si ottiene iniettando tamoxifene per via intraperitoneale in modelli murini geneticamente modificati per indurre la ricombinazione Cre-mediata nelle cripte intestinali. Dopo giorni o settimane (quando le cripte sono monoclonali per un certo colore), l'intestino viene esposto chirurgicamente e sottoposto ad ablazione laser utilizzando un microscopio multifotone con una camera a temperatura controllata. L'entità del danno alla cripta è caratterizzata immediatamente dopo l'ablazione e il mouse può riprendersi dalla procedura. L'esposizione chirurgica ripetuta e l'IVM vengono utilizzate per monitorare il recupero intestinale nel tempo. Il modello e la distribuzione della vascolarizzazione del sangue e delle cripte di colore diverso vengono utilizzati per ritrovare le stesse regioni settimane o mesi dopo l'ablazione. Il rimodellamento della cripta (ad esempio, fissione o fusione) può essere osservato nel sito del danno settimane dopo l'ablazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Imaging longitudinale della rigenerazione tissutale in caso di danno indotto dal laser nell'intestino. Quando l'intestino è posizionato esattamente nello stesso modo, i vasi sanguigni dell'intestino possono essere utilizzati come mappa per trovare e visualizzare le stesse regioni esatte. (A) Immagini panoramiche dell'intestino della fotocamera. Le linee bianche tratteggiate rappresentano il modello della vascolarizzazione vicina al sito del danno (scatola bianca), utilizzata come punto di riferimento per trovare la stessa regione ablata al laser su un altro punto temporale. Le due immagini inferiori mostrano la vista ingrandita del riquadro bianco. La freccia raffigura il sito esatto dell'ablazione laser al giorno 1 e 1 mese dopo. (B) Immagini fluorescenti di un singolo danno della cripta catturato dal microscopio multifotone. La freccia nella casella blu mostra il sito del danno al giorno 1 e 1 mese dopo. (C) Immagini fluorescenti di un campo danneggiato di cripte. Le frecce nella casella blu indicano la regione del danno al giorno 1 e 1 mese dopo. Barre scala: 1 mm (A, superiore); 0,25 mm (A, inferiore); 200 μm (grande panoramica B e C); e 50 μm (immagini ingrandite B e C). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Imaging intravitale dei destini delle cripte dopo l'ablazione laser. (A) Utilizzando il modello Confetti, le cripte etichettate con colori diversi possono essere seguite nel tempo per mappare le dinamiche del recupero. La freccia bianca raffigura il sito di ablazione laser. La scatola gialla rappresenta una regione vicina (<100 μm dal sito del danno), mentre le caselle blu e viola rappresentano regioni lontane (>100 μm) dalla regione ablata al laser. Si osservano diverse modalità di rigenerazione. (B) Alcune regioni rimangono invariate come nella casella viola. (C) Altre regioni mostrano il rimodellamento della cripta sotto forma di fissione o fusione della cripta; Le linee bianche tratteggiate e le frecce raffigurano gli eventi di fissione della cripta e le linee tratteggiate arancioni raffigurano gli eventi di fusione della cripta. (D) In alcune regioni si osserva la scomparsa della cripta, come nel riquadro giallo in cui la cripta evidenziata con una linea tratteggiata arancione è scomparsa. (E) Un esempio di quantificazione che mostra il numero di eventi di rimodellamento della cripta osservati nelle aree limitrofe (cioè meno di 100 μm) e lontane (cioè più di 100 μm) dal sito del danno. Barre scala: 200 μm (A); 50 μm (B-D). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Questo protocollo combina l'ablazione laser microscopica e la microscopia intravitale longitudinale per seguire la rigenerazione intestinale dalla risposta precoce al danno al rimodellamento tissutale a lungo termine. La tecnica è stata stabilita nel rigoroso rispetto di considerazioni etiche per indurre e visualizzare l'ablazione laser microscopica e, se seguita con precisione, manterrà il benessere degli animali. Durante l'intervento chirurgico, è importante assicurarsi che l'integrità dell'intestino sia ben preservata. Ciò può essere ottenuto maneggiando delicatamente il tessuto con tamponi di cotone bagnati sterili, che impediscono il sanguinamento o l'essiccazione del tessuto. L'entità del danno microscopico indotto dal laser dovrebbe anche essere attentamente valutata mediante imaging dei diversi strati intestinali dell'area dopo l'ablazione laser. Se il ricercatore desidera adattare la frequenza delle fasi sperimentali descritte nel presente protocollo, il comitato etico animale dell'istituto dovrebbe essere consultato prima dell'esperimento per stabilire le conseguenze sul benessere.

La microscopia intravitale ripetitiva consente di monitorare il recupero dei tessuti nello stesso topo nel tempo. L'esposizione chirurgica ripetuta dell'intestino garantisce prontamente l'accesso ottico all'intero tratto intestinale. Le caratteristiche intrinseche dei tessuti, come la vascolarizzazione, servono come punti di riferimento per identificare le stesse regioni intestinali in ogni sessione di imaging. Pertanto, la stessa regione tissutale può essere visualizzata per diverse settimane, il che consente di quantificare la rigenerazione tissutale a lungo termine nella stessa area intestinale nello stesso topo. Il controllo spaziotemporale offerto dal metodo combinato di chirurgia e imaging offre il vantaggio che lo stesso organo può essere ripreso sia in condizioni omeostatiche che rigeneranti nello stesso topo, il che è in contrasto con i precedenti modelli di danno all'intero organo in cui i controlli e i campioni rigeneranti hanno avuto origine da topi diversi 11,12,18,19,20 . Quindi, il nostro ambiente sperimentale riduce al minimo il numero richiesto di animali necessari per l'esperimento e riduce la variazione intra-animale.

La risoluzione dei problemi del protocollo dovrebbe iniziare con una revisione della tecnica di manipolazione del mouse e dell'intestino e un controllo delle apparecchiature e delle impostazioni di microscopia. Ci sono molti passaggi critici in questo protocollo che richiedono particolare attenzione. In primo luogo, al fine di garantire il benessere degli animali e un'elevata qualità dei dati, tutto il lavoro deve essere eseguito in un ambiente pulito e sterile utilizzando la tecnica asettica e la temperatura del topo deve essere mantenuta durante l'intervento chirurgico e ogni sessione di imaging. Mantenere il tessuto idratato con soluzione salina sterile e preriscaldata durante l'imaging è essenziale e previene la fibrosi tissutale.

Per garantire che l'esperimento venga eseguito in modo riproducibile, è importante allineare i laser prima dell'uso per un'acquisizione ottimale e misurare la potenza del laser multifotone all'inizio di ogni sessione. Parametri come il tipo di obiettivo, l'ingrandimento, il tempo di permanenza, la potenza del laser e la lunghezza d'onda hanno influenze sull'estensione dell'ablazione laser microscopica e dovrebbero essere considerati. In questo studio, sia l'ablazione laser che l'imaging sono condotti con una potenza laser di 1,2 W (fuori dall'obiettivo) a una lunghezza d'onda di 960 nm attraverso un obiettivo Fluotar VISIR 25x/0.95 WATER. La modifica della lunghezza d'onda o delle proprietà di scansione ottica influisce sull'entità del danno microscopico. Una lunghezza d'onda inferiore (come 840 nm) si traduce in fotoni di energia più elevata e spesso in una maggiore uscita del laser, e può aumentare il danno microscopico. Uno zoom più elevato si traduce in più energia per regione, e quindi meno tempo per ablare le cripte, e viceversa. Il tempo di permanenza dei pixel può anche essere aumentato o diminuito per modificare la velocità di ablazione e l'entità del danno. Quando il tessuto ripreso non è stabile (ad esempio, a causa di movimenti peristaltici), l'ablazione deve essere eseguita rapidamente. A tale scopo, la velocità di ablazione dovrebbe essere ottimizzata, ad esempio, aumentando lo zoom e / o l'uscita laser.

Trovare la stessa regione intestinale su più sessioni di imaging è un altro passaggio critico che deve essere eseguito correttamente per garantire il successo dell'esperimento. Per fare ciò, l'intestino deve essere posizionato esattamente allo stesso modo in tutti i punti temporali. Si consiglia di utilizzare sempre il cieco come punto di riferimento per trovare le stesse regioni nell'intestino tenue e crasso. Allungando delicatamente il tessuto di interesse con tamponi di cotone assicura che la regione di interesse sia nell'intervallo della distanza di lavoro oggettiva e massimizza il numero di regioni che possono essere risalite. Inoltre, si consiglia di ablare e visualizzare sempre più posizioni microscopiche in ciascun topo per tenere conto delle regioni che potrebbero non essere localizzate in una sessione di imaging successiva. Se le regioni non possono essere trovate, anche se il posizionamento dell'intestino è corretto, può aiutare a riposizionare il mouse e cambiare l'orientamento dell'area esposta. Tracciare le cripte nel tempo può essere ingombrante per esperimenti in cui vengono ablati campi intestinali più grandi di diverse cripte adiacenti. Tali insulti dannosi possono evocare il rimodellamento dei tessuti oltre il monostrato epiteliale, che può culminare nella modifica dei punti di riferimento tissutali utilizzati per il monitoraggio della regione nel tempo. La scelta di punti di riferimento a una distanza sufficiente dal sito danneggiato e l'acquisizione di campi visivi più ampi che superano l'area danneggiata di diverse centinaia di micrometri aumenta le possibilità di successo degli esperimenti a lungo termine. Oltre al posizionamento errato dell'intestino sullo stadio del microscopio, i movimenti peristaltici del tratto gastrointestinale possono interferire con l'imaging. Questo problema può essere migliorato in due modi. Se la frequenza dei movimenti non è troppo elevata, il processo può essere ripetuto nella stessa regione con un tempo di esposizione maggiore. In alternativa, è possibile utilizzare quantità più elevate di anestesia per ridurre la peristalsi. Si consiglia di limitare dosi più elevate di isoflurano a brevi aggiustamenti. Complessivamente, le sessioni di imaging dovrebbero essere mantenute il più brevi possibile, in modo ottimale al di sotto delle 3 ore, per garantire un rapido recupero.

L'approccio combinato di ablazione laser e microscopia longitudinale intravitale presenta diversi vantaggi rispetto ad altri modelli di danno. I precedenti modelli di danno (chimico) mancavano della capacità di limitare localmente l'insulto dannoso 6,11,12,19,20. L'ablazione laser supera questa lacuna limitando il danno a una determinata regione di interesse. Ciò consente ai ricercatori di controllare la posizione della lesione, nonché l'entità del danno. La gravità del danno può essere modulata per ablare cripte o interi campi intestinali microscopici per informare sulle risposte rigenerative a scala di cripta. Oltre al controllo spaziale, l'ablazione laser consente anche di cronometrare con precisione l'insorgenza del danno, superando così la precisione dei precedenti modelli farmacologici, chimici e di infezione 9,10,11,12,19,20. Il nostro protocollo amplia studi precedenti che utilizzavano l'ablazione termica indotta dal laser come metodo per indurre danni localizzati nell'intestino^21,23. Precedenti modelli di danno indotti dal laser hanno ripreso aree locali nell'intestino tenue²¹ o nella superficie luminale del colon distale²³. L'approccio combinato di chirurgia e ablazione laser consente di visualizzare l'epitelio intestinale (cripte in particolare) ad alta risoluzione e di eseguire l'ablazione laser e l'imaging di follow-up del recupero tissutale in qualsiasi posizione dell'intestino tenue, del cieco e del colon prossimale. Cattura il recupero delle stesse regioni intestinali nel tempo, consentendo di visualizzare diversi strati dell'intestino (mucosa, sottomucosa, muscolo e sierosa) secondo la configurazione sperimentale. La nostra tecnica è principalmente su misura per l'imaging ripetuto a lungo termine per un periodo di più settimane / mesi. Per studiare le dinamiche di recupero a breve termine delle cripte (ad esempio, per diversi giorni consecutivi dopo il danno), l'approccio di ablazione laser qui descritto può essere combinato con finestre di imaging intravitale^27,28,40.

Questo protocollo può essere utilizzato per una moltitudine di applicazioni di ricerca da diverse aree scientifiche che spaziano dalla rigenerazione, all'immunologia e alla ricerca sul cancro. L'imaging longitudinale della rigenerazione intestinale fa luce sulle dinamiche cellulari che preservano l'integrità epiteliale e la funzione barriera, consentono la difesa dell'ospite contro i patogeni nel lume intestinale e che sono alla base della clearance e della diffusione delle mutazioni oncogeniche. Ogni domanda scientifica getterà richieste uniche sull'entità del danno indotto dal laser e sulla durata dell'imaging. Topi reporter fluorescenti e coloranti iniettati possono espandere e raffinare drasticamente i dati che possono essere acquisiti consentendo la visualizzazione di qualsiasi cellula e struttura di interesse. Ad esempio, un topo Lgr5-CreERt2:Rosa26-Confetti può essere utilizzato per visualizzare le progenie delle cellule staminali, mentre il reporter Rosa26-mTmG informa sull'architettura dei tessuti. Insieme, questi recenti progressi tecnologici rendono la sperimentazione intestinale intravitale uno strumento redditizio per far progredire la nostra comprensione della biologia e delle malattie intestinali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Scatola di induzione per anestesia	Autoclave Veterinary Technics
	Certoclav
Betadine	Mylan	202809
Pannolino (sottopiede)	Absorin comfort
Pinze Dumont	Fine Scientific Tools	11255-20 o 11272-40	Inox, stile #55, utilizzato per contenere il peritoneo
Enzimatico detergente per strumenti	Roboz	EC-1000
Etanolo 80%	in casa	NA
Unguento per gli occhi	Duratears Z (Alcon)	288/28282-6
Forbici fini Dritte 9 cm	Fine Scientific Tools	14060-09	Utilizzato per tagliare la pelle e il peritoneo del topo
Garza 5 cmX5 cm	Cutisoft (Bsn medical)	45847-00
Graefe Pinze Curvo Seghettato	Fine Scientific Tools	11051-10	Utilizzato per tenere la pelle
Hartman Hemostat Straight	Fine Scientific Tools	13002-10	Utilizzato per suturare
il termoforo	Comfort	T5-5000
Scatola di imaging	su misura
	Nobafilm	172215
Multi-fotone invertito microscopio con tavolino automatizzato	Leica Microsystems	NA
Isoflurane (vetflurane)	Pharmachemie BV, Haarlem, Paesi Bassi	305788
Vaporizzatore di isoflurano	Penlon sigma delta
Nastro di carta Micropore	Micropore
NaCl 0.9%	Braun		Altre marche disponibili
Ago 25G	BD	300600
Nastro di carta tesa	Tesa	NA
Parafilm	Bemis	PM-994	semitrasparente
Lame di rasoio	Supermax acciaio inossidabile		Altre marche disponibili
Sonda rettale	Kent Scientific	20250-91
Rimadyl Bovini (carprofene)	Zoetis BV	Registrazione# REG NL 10130
Forbici fini per studenti Dritte 11,5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11	Utilizzato per tagliare le garze
Detergente per strumenti chirurgici	Roboz	IC-1000
Lubrificante per strumenti chirurgici	Roboz	IL-1000
Siringhe (1 ml)	BD	303172	Altre marche disponibili
Tamoxifen	Sigma	T5648
Temgesic (Buprenorfina cloridrato)	Indivior UK Limited/Reckitt Benckiser Healthcare	Registration# RVG 08725
Vicryl polyglactin sutura 5-0 FS-2 ago	Ethicon	V292ZH
VirkonS	Bio-services		soluzione antisettica
Cotton fioc in legno (sterile)	Klinion	531530	Altre marche disponibili