Qui descriviamo un metodo specifico del tempo per manipolare efficacemente i percorsi di sviluppo critici nella placenta del topo in vivo. Questo viene eseguito attraverso l'iniezione e l'elettroporazione di plasmidi CRISPR nelle placente di madri gravide il giorno embrionale 12.5.
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Articolo metodologico
Manipolazione CRISPR mirata alla placenta del mouse in vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
La placenta è un organo essenziale che regola e mantiene lo sviluppo dei mammiferi in utero. La placenta è responsabile del trasferimento di nutrienti e rifiuti tra la madre e il feto e della produzione e consegna di fattori di crescita e ormoni. Le manipolazioni genetiche placentari nei topi sono fondamentali per comprendere il ruolo specifico della placenta nello sviluppo prenatale. I topi transgenici che esprimono Cre specifici per la placenta hanno un'efficacia variabile e altri metodi per la manipolazione genica placentare possono essere alternative utili. Questo articolo descrive una tecnica per alterare direttamente l'espressione genica placentare utilizzando la manipolazione genica CRISPR, che può essere utilizzata per modificare l'espressione di geni mirati. Utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato, le madri gravide subiscono una laparotomia al giorno embrionale 12.5 (E12.5) e un plasmide CRISPR viene somministrato da una micropipetta di vetro nelle singole placente. Il plasmide viene immediatamente elettroporato dopo ogni iniezione. Dopo il recupero della madre, la placenta e gli embrioni possono continuare lo sviluppo fino alla valutazione in un secondo momento. La valutazione della placenta e della prole dopo l'uso di questa tecnica può determinare il ruolo della funzione placentare specifica del tempo nello sviluppo. Questo tipo di manipolazione consentirà una migliore comprensione di come la genetica e la funzione placentare influenzano la crescita e lo sviluppo fetale in più contesti patologici.
Introduzione
La placenta è un organo essenziale coinvolto nello sviluppo del feto. Il ruolo principale della placenta è quello di fornire fattori essenziali e regolare il trasferimento di nutrienti e rifiuti da e verso il feto. Le placente dei mammiferi sono composte da tessuto fetale e materno, che costituiscono l'interfaccia fetale-materna e, quindi, la genetica della madre e del feto influisce sulla funzione1. Anomalie genetiche o compromissione della funzione della placenta possono alterare drasticamente lo sviluppo fetale. Lavori precedenti hanno dimostrato che la genetica e lo sviluppo placentare sono associati allo sviluppo alterato di specifici sist....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità e conformità con le normative federali e la politica dell'Università dell'Iowa e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali.
1. Animali e allevamento
- Tenere gli animali in un ciclo di luce diurna di 12 ore con cibo e acqua ad libitum.
- Utilizzare topi femmina CD-1 di età compresa tra 8 e 15 settimane. Utilizzare la presenza di un tappo copulatore per identificare E0.5.
- Su E0.5, ospitare singolarmente le madri gravide.
2. Taratura della micropipetta....
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Risultati
Risultati generali della procedura (Figura 6)
Nello studio, c'erano tre gruppi manipolati. Questi includevano placente iniettate con un plasmide di controllo generale CRISPR Cas9 (Cas9 Control), un plasmide CRISPR di controllo dell'attivazione (Act Control) o un plasmide di attivazione IGF-1 SAM (Igf1-OE). Il controllo Cas9 è più adatto per i plasmidi knockout e il controllo di attivazione è più adatto per i plasmidi di sovraespressione/attivazio.......
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Discussione
La placenta è un regolatore primario della crescita fetale e, come notato in precedenza, i cambiamenti nell'espressione o nella funzione genica placentare possono avere un impatto significativo sullo sviluppo fetale6. Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per eseguire una manipolazione CRISPR mirata in vivo della placenta del topo utilizzando un approccio chirurgico relativamente avanzato. Questa tecnica consente una resa significativa di embrioni vitali e delle loro placente .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono le seguenti fonti di finanziamento: R01 MH122435, NIH T32GM008629 e NIH T32GM145441. Gli autori ringraziano i laboratori del Dr. Val Sheffield e del Dr. Calvin Carter presso l'Università dell'Iowa per l'uso della loro sala operatoria e delle attrezzature, così come il Dr. Eric Van Otterloo, il Dr. Nandakumar Narayanan, e il Dr. Matthew Weber per la loro assistenza con la microscopia. Gli autori ringraziano anche la dottoressa Sara Maurer, Maya Evans e Sreelekha Kundu per la loro assistenza con gli interventi chirurgici pilota.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 1,5 ml | USA Scientific Inc | 1615-5500 | |
| 4% Paraformeldhyde (PFA) in PBS | Thermo Fisher Scientific | J61899. | |
| 96 Piastra a pozzetti | Cornings | 3598 | Per kit BCA |
| Assorbenti Underpads | Fisher Scientific | 14-206-62 | |
| Controllo dell'attivazione Plasmide | Santa Cruz Biotechnology | sc-437275 | Acqua priva di DNA fornita per la diluizione |
| AMV Trascrittasi inversa | New England Biolabs | M0277L | Utilizzare per la sintesi di cDNA |
| Anestetico Vaporizzatore a gas | Vetamac | VAD-601TT | VAD-vaporizzatore compatto |
| Gel lacrimale artificiale | Akorn | NDC 59399-162-35 | |
| Kit di analisi delle proteine BCA | Thermo Fisher Scientific | 23227 | Quantificazione delle proteine |
| Biovortexer | Bellco Glass, Inc. | 198050000 | Omogeneizzatore di tessuti portatile |
| Software CellSens | Olympus | V4.1.1 | Elaborazione di immagini in immagini FISH. |
| Centrifuga 5810 | Eppendorf | EP022628168 | Centrifuga a piastre |
| Cloroformio | Thermo Fisher Scientific | J67241-AP | Isolamento dell'RNA |
| Applicatori con punta in cotone | ProAdvantage | 77100 | Sterilizzare prima dell'uso |
| CRISPR/Cas9 Controllo del plasmide | Santa Cruz Biotechnology | sc-418922 | Acqua priva di DNA fornita per la diluizione |
| CryoStat | Leica | CM1950 | |
| Microscopio per dissezione | Leica | M125 C | Utilizzato per l'imaging post-necroscopia |
| Suture solubili | Med Vet International | J385H | |
| Acqua distillata | Gibco | 15230162 | |
| salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) | Thermo fisher Scientific | 14190144 | (-) Calcio; (-) Magnesio |
| ECM 830 Electro Electroporator (Macchina per elettroporazione) | BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | Solo generatore |
| Electric Razor | Wahl | CL9990 | Kent Scientific |
| Palette per elettroporazione/Pinzette | BTX Harvard Apparatus | 45-0487 | Pale da 3 mm di diametro; cavi inclusi |
| Cassetta da incasso: 250 PK | Grainger | 21RK94 | Cassette di inclusione della placenta |
| Etanolo | Thermo Fisher Scientific 268280010 | ||
| F-Air Canisters | Penn Veterinary Supply Inc | BIC80120 | Filtro isoflurano in eccesso |
| Fast Green Dye FCF | Sigma | F7252-5G | Dissolvere in 1 μ g/ml e filtro; proteggere dalla luce |
| Fotometro per micropiastre basato su filtro (lettore di piastre) | Fisher Scientific | 14377576 | Può essere utilizzato per BCA e pinze ELISA |
| VWR | 82027-386 | Punte sottili, diritte, seghettate | |
| Soluzione di formalina, tamponato neutro, 10% | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Capillari in vetro - Vetro borosilicato (micropipetta) | Strumento | SutterB150-86-10 | Diametro esterno: 1,5 mm, diametro interno: 0,86 mm, lunghezza 10 cm |
| Cocktail di inibitori della proteasi e della fosfotasi Halt (100x) | Thermo Scientific | 1861281 | Tampone per omogeneizzazione delle proteine |
| Termoforo | Thermotech | S766D | Emostatico per termoforo umido digitale |
| VWR | 10806-188 | Mascella completamente surriscaldata; bagno di | |
| acqua calda | Fisher Scientific | 20253 | Isotemp 205 |
| Igf-1 SAM Plasmide (m1) | Santa Cruz Biotechnology | sc-421056-ACT | Acqua priva di DNA fornita per la diluizione |
| Camera di induzione | Vetamac | 941443 | Non è richiesta alcuna dimensione specifica in litri |
| Isoflurano | Piramal Pharma Limited | NDC 66794-013-25 | |
| Isoproponale/2-Proponal | Fisher Scientific | A451-4 | Isolamento dell'RNA |
| Ketamina HCl 100mg/ml | Akorn | NDC 59399-114-10 | |
| MgCl2/Magneisum Chloride | Sigma Aldrich | 63069-100ML | 1M. Tampone per omogeneizzazione proteica |
| MicroAmp™ Piastra di reazione ottica a 384 pozzetti con codice a barre | Fisher Scientific | 4309849 | Piastre con codice a barre non necessarie |
| Punta microcapillare | Eppendorf | 5196082001 | collegata al microiniettore BTX |
| Apparecchio Harvard BTX | 45-0766 | Supporto per pipette in acciaio inossidabile, lunghezza 130 mm, per pipette da 1 a 1,5 mm | |
| Microject 1000A (macchina per iniezione) | Apparecchio BTX Harvard | 45-0751 | MicroJect 1000A Plus System |
| Modello P-97 | Strumento Sutter | P-97 | Estrattore per micropipette di tipo fiammante/marrone Miscelatore |
| micropiastre (agitatore per piastre) | scilogex | 822000049999 | |
| Mouse/Rat IGF-I/IGF-1 Kit ELISA Quantikine | R & D Systems | MG100 | |
| Aghi | BD - Becton, Dickson e società | 305106 | 30 Gx 1/2 (0,3 mm x 13 mm) |
| Serbatoio di azoto | Linde | 7727-37-9 | Qualsiasi gas innert |
| Farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS) | Norbrook Laboratories Limited | NDC 55529-040-10 | Analesgico come Meloxicam |
| Nose Cone | Vetamac | 921609 | 9-14 mm |
| Colorante di rilevamento opale 620 | Akoya Biosciences | SKU FP1495001KT | utilizzato per il |
| FISH Temperatura di taglio ottimale (O.C.T) Composto | Sakura | 4583 | |
| Serbatoio di ossigeno | Linde | 7782 - 44 - 7 | di ossigeno per uso medico |
| USA Scientific Inc | 14155390 | ||
| Soluzione di iodio povidone, 5% | Avrio Health L.P. | NDC 67618-155-16 | |
| Potenza SYBR&commercio; Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4367659 | qPCR |
| (primer casuali) | New England Biolabs | S1330S | Utilizzare per la sintesi di cDNA |
| Lama di rasoio | Grainger | 26X080 | |
| Kit di pulizia dell'RNA & Concentratore | Zymo Research | R1013 | |
| RNALater | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Kit RNAscope v.2.5 | Advanced Cells Diagnostics | 323100 | Contiene tutti i reagenti necessari per l'ibridazione fluorescente in situ. Sonde vendute separatamente. |
| RNAscope e commercio; Sonda- Mm-PRL8A8-C2 | Diagnostica avanzata delle cellule | 528641-C2 | |
| RNAscopio&commercio; Probe- Vector-dCas9-3xNLS-VP64 | Diagnostica avanzata delle cellule | 527421 | |
| Roto-Therm Mini | Benchmark | R2020 | Forno a secco per forbici di ibridazione in situ |
| VWR | 82027-578 | Forbici da dissezione, punta affilata, 4¹/? | |
| Cloruro di sodio (soluzione salina) | Hospra | NDC 0409-4888-03 | Sterile, 0,9% |
| Citrato di sodio, sale trisodico, diidrato, [acido citrico, trisodico diidrato] | Prodotto di ricerca internazionale | 03-04-6132 | |
| Idrossido di sodio 1N concentrato, Fisher Chemical | Fisher Scientific | SS277 | Tampone di omogeneizzazione delle proteine |
| Vaporiera | Bella | B00DPX8UBA | |
| Telo chirurgico sterile | Busse | 696 | Sterilizzare prima dell'uso |
| Vetrini per microscopio Superfrost Plus | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Surgipath Cover Glass 24x60 | Siringhe Leica | 3800160 | |
| BD | - Becton, Dickson and Company | 309659 | BD Luer Slip Tip Siringa sterile, monouso, 1 mL |
| Thermo Scientific™ Invitrogen&commercio; Nanodrop&commercio; Uno spettrofotometro con WiFi e Qubit™ 4 Fluorimetro | Fisher Scientific | 13-400-525 | Questa configurazione viene fornita con il fluorimetro Qubit 4. Quantificazione dei qubit non richiesta. |
| Adesivo tissutale | 3M | 1469SB | VetBond |
| Tris HCl | Thermo Fisher Scientific 15568025 | 1M. Tampone per omogeneizzazione proteica | |
| TRIzol™ Reagente | Thermo Fisher Scientific | 15596018 | Isolamento dell'RNA |
| Pacchetto tampone TSA | Diagnostica avanzata delle cellule | 322810 | Utilizzato per diluire il colorante di rilevamento Opal 620 |
| Circuito F universale | Vetamac | 40200 | Collegato al vaporizzatore e agli accessori del vaporizzatore |
| Microscopio a fluorescenza composto verticale | Olympus | BX61VS | Utilizzato per l'imaging FISH |
| Vectorshield con DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Supporti di montaggio per vetrini coprioggetti |
| ViiA™ 7 Sistema PCR in tempo reale con blocco a 384 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 4453536 | Questo è per il rilevamento di blocchi SYBR a 384 pozzetti. TaqMan e/o blocchi più piccoli disponibili |
| Smalto per unghie Wet n Wild Shine, Clear Nail Protector, Colore per unghie | Amazon | C450B | |
| Xilazina 20mg/ml | Anased 343730_RX |
Riferimenti
- Cross, J. C., et al. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24 (2-3), 123-130 (2003).
- Perez-Garcia, V., et al. Placentation defects are highly prevalent in embryonic lethal mouse mutants. Nature. 555 (7697), 463-468 (2018).
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Ristampe e permessi
