Il protocollo ha aderito al codice australiano del National Health and Medical Research Council per la cura e l'uso degli animali per scopi scientifici18. Il Comitato Etico Animale dell'Università dell'Australia Occidentale ha approvato in modo prospettico il protocollo (RA3/100/1596). Le pecore provengono dalla fattoria Ridgefield dell'Università dell'Australia occidentale (UWA) (2018-2020). Le pecore sono state introdotte nella struttura per animali di grossa taglia UWA accreditata AAALAC 2-3 settimane prima dell'intervento chirurgico. Le pecore sono state inizialmente alloggiate al chiuso in recinti condivisi con pavimento rialzato, con recinti singoli utilizzati nel periodo perioperatorio. Le pecore venivano nutrite con pellet, avena pula e lupini con una miscela di minerali calcolata sul peso corporeo. Le camere sono state controllate per la temperatura (20,5-21,5 °C) e mantenute su un ciclo chiaro: buio 12:12 h. Il dolore e il benessere sono stati valutati nel periodo postoperatorio due volte al giorno per 7 giorni, poi ogni giorno fino al completamento dello studio. I parametri postoperatori monitorati includevano segni di dolore, restringimento orbitale, sforzo respiratorio, temperatura, frequenza cardiaca, sito chirurgico, appetito e assunzione di acqua, attività, zoppia, condizioni del mantello, consistenza fecale, travaglio pretermine, comportamento e segni di tossiemia gravidica. I punteggi attribuiti a ciascun parametro hanno innescato un intervento ove necessario.
NOTA: Sono state necessarie due procedure chirurgiche di recupero: preparazione della pecora, approccio chirurgico e chiusura e recupero della pecora sono le stesse per entrambe le procedure chirurgiche. La prima procedura è la creazione chirurgica dell'ernia diaframmatica nell'agnello fetale. La seconda procedura consiste nel posizionare l'intervento fetale e il dispositivo di monitoraggio della pressione. Il disegno dello studio ha richiesto due interventi chirurgici di sopravvivenza per consentire al contenuto addominale di spostarsi nella cavità toracica dopo la creazione dell'ernia diaframmatica in modo che l'ipoplasia polmonare potesse svilupparsi prima del successivo intervento chirurgico.
1. Creazione chirurgica dell'ernia diaframmatica nell'agnello fetale
- Preparazione della pecora
- A ~80 giorni di gestazione, premedicare la pecora con un'iniezione intramuscolare di acepromazina (0,04 mg/Kg) e morfina (0,3 mg/Kg).
- Indurre l'anestesia per via endovenosa con ketamina (5 mg/Kg) e midazolam (0,25 mg/Kg).
- Intubare la trachea della pecora con un tubo endotracheale (diametro interno di 8 mm [ID]). Mantenere l'anestesia con isoflurano (1%-3% in ossigeno) erogato mediante ventilazione a pressione positiva (10-12 respiri/min, volume corrente 8-10 mL/kg).
- Stabilire il monitoraggio delle pecore con un elettrocardiogramma (ECG), la pressione arteriosa invasiva tramite un catetere arterioso auricolare, la CO2 espirata, la saturazione periferica di ossigeno e la temperatura durante l'intervento chirurgico.
- Posizionare la pecora supina sulla barella. Avvolgere le corde intorno alle zampe della pecora e fissarle delicatamente al tavolo.
- Tosare la lana dall'addome e dal fianco della pecora e poi agganciarla alla pelle.
- Rimuovere lo sporco e la lanolina dall'addome, dal fianco e dall'inguine della pecora con acqua e sapone.
- Somministrare cefazolina (20 mg/Kg) per via endovenosa ogni 90 minuti durante l'intervento chirurgico.
- Trasferire la pecora in sala operatoria su una barella.
- Spostare la pecora dalla barella di trasporto al tavolo operatorio.
- Posizionare la pecora in posizione di decubito dorsale sul tavolo operatorio.
- Fissare tutti gli arti al tavolo operatorio con morbidi lacci di corda.
- Preparazione asettica dell'addome esposto: lavare 3 volte con scrub chirurgico alla clorexidina al 4%, rimuovendo la soluzione contaminata tra ogni lavaggio con alcol al 70%.
- Completare la preparazione sterile spruzzando leggermente una soluzione di iodio al 10% sull'addome, sul fianco e sull'inguine.
- Coprire la pecora con un telo chirurgico fenestrato sterile in modo che sia esposto solo il sito dell'incisione addominale. Assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici, i cateteri, le siringhe e le soluzioni utilizzate durante l'intervento chirurgico siano sterili.
- Approccio chirurgico
- Stabilire l'anestesia locale a blocco di linea mediante infiltrazione locale sottocutanea e muscolare di bupivacaina (5%; 9,5 ml) con una siringa da 10 ml e un ago da 22 g.
- Esporre l'utero mediante un'incisione addominale para-mediana (8-11 cm) attraverso la pelle della pecora, il tessuto sottocutaneo e la linea alba realizzata con una lama chirurgica di misura 10 con cauterio come richiesto per ridurre al minimo il sanguinamento incisionale.
- Creazione di ernia diaframmatica
- Localizzare la testa/torace fetale tramite la palpazione.
- Copri l'utero con pellicola trasparente.
- Usa le forbici chirurgiche per creare una finestra (6 cm x 4 cm) nell'involucro di plastica.
- Praticare un'incisione uterina di 5-7 cm attraverso l'utero e il sacco amniotico con taglio cauterario, evitando i vasi sanguigni uterini e i cotiledoni placentari.
- Esteriorizzare la testa e gli arti anteriori fetali.
- Utilizzare le pinze uterine Babcock per sigillare i bordi dell'incisione uterina e avvolgere strettamente la plastica sterile attorno all'addome fetale per prevenire la perdita di liquido amniotico.
- Posizionare il feto sul lato destro e fissare un secondo involucro di plastica sterile sul feto esteriorizzato per ridurre la perdita di calore e umidità. Identificare lo spazio intercostale tra la 9ae la 10acostola a sinistra e praticare un foro nell'involucro di plastica con le forbici chirurgiche per accedere al sito di incisione fetale previsto.
- Stabilire l'anestesia locale a blocco di linea nel feto mediante infiltrazione sottocutanea e muscolare locale di bupivacaina (5%; 0,25 ml diluiti a 0,5 ml con soluzione fisiologica sterile; 1 ml di siringa sterile e ago da 27 G) nel 9°spazio intercostale immediatamente adiacente al bordo superiore della 10° costola per evitare vasi sottocostali.
- Utilizzare una siringa sterile da 60 ml per bagnare la pelle fetale esposta con una soluzione calda di Hartmann (5-10 ml ogni 5-10 minuti) per mantenere umida la pelle fetale durante le fasi successive.
- Creare una toracotomia posterolaterale sinistra praticando un'incisione cutanea di 2-4 cm con elettrocauterizzazione nel 9° spazio intercostale immediatamente adiacente al bordo craniale della 10° costola.
- Utilizzare emostatici per zanzare per sezionare senza mezzi termini il tessuto sottocutaneo, i muscoli intercostali e la membrana pleurica per accedere al diaframma.
- Utilizzare due piccoli emostatici per zanzare per raccogliere il diaframma a ciascuna estremità del sito dell'ernia lungo 1 cm previsto e sollevare cranialmente il diaframma per tenerlo lontano dallo stomaco, dal fegato e dalla milza sottostanti.
- Praticare un'incisione di 1 cm tra i due emostatici utilizzando piccole forbici angolate.
- Rilasciare gli emostatici che tengono il diaframma.
- Usa una pinza di Potts atraumatica per tirare lo stomaco superiormente attraverso il foro nel diaframma.
- Utilizzare un singolo laccio di monofilamento di polidiossanone 5-0 assorbibile (ago RB-1 con punta conica) per avvolgere accuratamente la 9ae la 10a costola in modo che si oppongano alle costole fetali, evitando il polmone sottostante.
- Incisione toracotomica chiusa con sutura a materasso (monofilamento di polidiossanone 5-0 riassorbibile).
- Chiusura chirurgica
- Rimettere il feto nel sacco amniotico.
- Somministrare meloxicam intraoperatorio (0,25 mg/Kg; per via sottocutanea) alla pecora per l'analgesia postoperatoria.
- Sostituire il liquido amniotico perso utilizzando la soluzione di Hartmann riscaldata (~50 mL) insieme a piperacillina/tazobactam intra-amniotico (1000 mg/125 mg).
- Posizionare le superfici opposte del corioamnio e delle pareti uterine adiacenti e utilizzare una sutura riassorbibile in poliglactina 910 intrecciata 2-0 con una sutura a materasso rovesciato per chiudere insieme l'utero e il sacco amniotico.
- Chiudere la linea alba, il tessuto sottocutaneo e la pelle della pecora (rispettivamente monofilamento di polidiossanone 1 assorbibile, monofilamento di poliglecaprone 25 3-0 assorbibile e monofilamento di polipropilene 2-0 non assorbibile).
- Recupero e monitoraggio delle pecore
- Spruzzare la ferita addominale dopo l'intervento con nastro adesivo impermeabile e coprirla con una medicazione per ridurre il rischio di infezione della ferita postoperatoria.
- Applicare un cerotto transdermico al fentanil (100 μg/h) sull'inguine per un'ulteriore analgesia postoperatoria.
- Recupera la pecora ed estuba quando respiri spontaneamente, quindi lasciala svegliare.
- Monitorare le pecore ogni giorno fino al parto per l'intervento chirurgico fetale.
- Rimuovere i punti di sutura dopo 14 giorni.
2. Posizionamento dell'intervento fetale e del dispositivo di monitoraggio della pressione
- Preparazione della pecora per l'intervento chirurgico fetale a 101 giorni di gestazione
- Iniettare medrossiprogesterone (1 ml) per via intramuscolare a ~85 giorni di gestazione (termine ~147 giorni) per ridurre il rischio di parto pretermine.
- Utilizzare la stessa procedura di preparazione anestesiologica e chirurgica utilizzata per l'intervento chirurgico iniziale di creazione del diaframma.
- Seguire l'approccio chirurgico nei passaggi 2.1.2.2 e 2.1.2.3, in modo simile ai passaggi 1.2.1-1.2.2.
- Stabilire l'anestesia locale a blocco di linea mediante infiltrazione locale sottocutanea e muscolare di bupivacaina (5%; 9,5 ml) con una siringa da 10 ml e un ago da 22 g.
- Con un'incisione addominale para-mediana (8 - 11 cm) adiacente al sito di incisione addominale utilizzato per l'intervento chirurgico di creazione del diaframma, esporre l'utero con un attraverso la pelle della pecora, il tessuto sottocutaneo e la linea alba realizzata con una lama chirurgica di misura 10 con cauterio come richiesto per ridurre al minimo il sanguinamento incisionale.
- Inoltre, somministrare ossitetraciclina (20 mg/Kg) per via intramuscolare alla pecora per fornire protezione antimicrobica fetale contro il dispositivo di monitoraggio impiantato cronicamente.
- Attivazione del dispositivo
- Attivare il misuratore di pressione19.
- Tubo di misurazione della pressione a morsetto con emostatici.
- Posizionare l'intero dispositivo in una ciotola sterile contenente una miscela di acido peracetico allo 0,08% e perossido di idrogeno all'1% per almeno 1 ora, assicurandosi che l'intero dispositivo sia coperto.
- Utilizzando una pinza sterile, spostare il dispositivo in una ciotola sterile contenente acqua sterile per almeno 10 minuti prima dell'impianto fetale. Assicurarsi che l'intero dispositivo sia coperto con acqua sterile.
- Approccio chirurgico e intervento fetale
- Esteriorizzare la testa fetale mediante isterotomia utilizzando lo stesso approccio chirurgico utilizzato per l'intervento chirurgico iniziale ma con incisioni uterine adiacenti (passaggi 1.1-2.2).
- Tenere la testa e il collo fetali esteriorizzati avvolti nel telo di plastica sterile per ridurre al minimo la perdita di temperatura e liquidi.
- Strumentare la trachea con un catetere per le misurazioni della pressione (Figura 1).
- Per la trachea non clulata, seguire i passaggi 2.3.3.2-2.3.3.3.
- Intubare l'agnello fetale con un catetere di aspirazione a 5 French (1,67 mm ID) con il connettore di aspirazione rimosso a una profondità di 14 cm all'angolo della bocca dell'agnello.
- Collegare l'estremità esterna del catetere con un connettore da 1,59 mm (diametro esterno, diametro esterno) a 3,18 mm (diametro esterno) con un tubo in silicone lungo 30 cm e 3,18 mm (diametro interno).
- Per la trachea ccclusa, seguire i passaggi 2.3.3.5-2.3.3.6.
- Intubare l'agnello fetale con un tubo endotracheale microcuffia 3.0 con il connettore rimosso a una profondità di 14 cm fino a un angolo della bocca dell'agnello.
- Collegare l'estremità esterna del catetere con un connettore da 3,18 mm (OD) a 3,18 mm (OD) a un tubo in silicone lungo 30 cm e 3,18 mm (ID).
- Collegare l'altra estremità del tubo in silicone lungo 30 cm e 3,18 mm (ID) al dispositivo di misurazione della pressione tramite un connettore da 3,18 mm (OD) a 1,59 mm (OD) sul dispositivo di misurazione della pressione.
- Sutura del catetere all'angolo della bocca e del collo dell'agnello (monofilamento di nylon non assorbibile 4-0).
- Fissare il dispositivo di misurazione della pressione alla pelle dell'agnello sul petto (monofilamento di nylon non assorbibile 4-0) (Figura 2).
- Chiudere le incisioni chirurgiche fetali e pecora come per l'intervento chirurgico iniziale di creazione dell'ernia diaframmatica (passaggi 1.4-1.5).
- Dispositivo di prova
- Verificare se il dispositivo sta trasmettendo il segnale19.
- Recupero e monitoraggio delle pecore
- Recupera la pecora come per l'intervento chirurgico iniziale.
- Monitorare le pecore ogni giorno fino al parto.
- Somministrare una seconda dose di medrossiprogesterone (0,5 ml) per via intramuscolare a ~120 giorni di gestazione.
- Somministrare betametasone (5,7 mg) per via intramuscolare 48 ore e 24 ore prima del parto cesareo per promuovere la maturazione fetale per l'assistenza postnatale.
- Consegna agnello
- A ~142 giorni di gestazione (termine ~147-150 giorni), pre-medicare la pecora mediante iniezione intramuscolare di acepromazina (0,03 mg/Kg) e morfina (0,3 mg/Kg).
- Indurre l'anestesia per via endovenosa con tiopentale (10-15 mg/Kg), intubare la pecora con un tubo endotracheale (dimensione 8,5 mm) e mantenere l'anestesia mediante isofluorano con un monitoraggio appropriato per gli anestetici precedenti.
- Procedere con il parto chirurgico del feto tramite isterotomia come per gli interventi chirurgici precedenti, con pecora in decubito dorsale (passaggi 1.1 - 2.2).
- Rimuovere il dispositivo di monitoraggio. Pulire il dispositivo con acqua ed etanolo al 70%.
- Uccidere umanamente la pecora con un'iniezione endovenosa di 160 mg/Kg di soluzione di pentobarbitone sodico.
- Rianimare e ventilare l'agnello per 2-3 ore e poi ucciderlo umanamente (160 mg/Kg di soluzione di pentobarbitone sodico, iniezione endovenosa).
- Dati
- Scarica i dati su un laptop e analizzali19. Filtra i dati di pressione utilizzando una finestra di 6 ore. Calcola la differenza di pressione tra la pressione amniotica e quella tracheale.