Nel sistema di cocoltura dei gangli della radice dorsale e delle cellule di Schwann, può essere studiata la mielinizzazione del sistema nervoso periferico. Questo modello offre opportunità sperimentali per osservare e quantificare la mielinizzazione periferica e per studiare gli effetti dei composti di interesse sulla guaina mielinica.
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Articolo metodologico
Mielinizzazione in vitro di assoni periferici in una cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale di ratto e cellule di Schwann
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il processo di mielinizzazione è essenziale per consentire una rapida e sufficiente trasduzione del segnale nel sistema nervoso. Nel sistema nervoso periferico, i neuroni e le cellule di Schwann si impegnano in una complessa interazione per controllare la mielinizzazione degli assoni. I disturbi di questa interazione e la rottura della guaina mielinica sono segni distintivi delle neuropatie infiammatorie e si verificano secondariamente nei disturbi neurodegenerativi. Qui, presentiamo un modello di cocoltura di espianti di ganglio di radice dorsale e cellule di Schwann, che sviluppa una robusta mielinizzazione degli assoni periferici per studiare il processo di mielinizzazione nel sistema nervoso periferico, studiare le interazioni assone-cellule di Schwann e valutare separatamente i potenziali effetti degli agenti terapeutici su ciascun tipo di cellula. Metodologicamente, i gangli delle radici dorsali di ratti embrionali (E13.5) sono stati raccolti, dissociati dal tessuto circostante e coltivati come espianti interi per 3 giorni. Le cellule di Schwann sono state isolate da ratti adulti di 3 settimane e i nervi sciatici sono stati digeriti enzimaticamente. Le cellule di Schwann risultanti sono state purificate mediante selezione cellulare attivata magneticamente e coltivate in condizioni arricchite di neuregulina e forskolina. Dopo 3 giorni di coltura dell'espianto del ganglio della radice dorsale, 30.000 cellule di Schwann sono state aggiunte a un espianto di ganglio della radice dorsale in un mezzo contenente acido ascorbico. I primi segni di mielinizzazione sono stati rilevati il giorno 10 della cocoltura, attraverso segnali sparsi per la proteina basica della mielina nella colorazione immunocitochimica. Dal giorno 14 in poi, le guaine mieliniche si sono formate e propagate lungo gli assoni. La mielinizzazione può essere quantificata dalla colorazione delle proteine basiche della mielina come rapporto tra l'area di mielinizzazione e l'area assone, per tenere conto delle differenze nella densità assonale. Questo modello offre opportunità sperimentali per studiare vari aspetti della mielinizzazione periferica in vitro, che è cruciale per comprendere la patologia e le possibili opportunità di trattamento per la demielinizzazione e la neurodegenerazione nelle malattie infiammatorie e neurodegenerative del sistema nervoso periferico.
Introduzione
Nel sistema nervoso periferico (PNS), la rapida trasduzione dell'informazione è mediata da assoni avvolti dalla mielina. La mielinizzazione degli assoni è essenziale per consentire la rapida propagazione degli impulsi elettrici, poiché la velocità di conduzione delle fibre nervose è correlata al diametro dell'assone e allo spessore della mielina1. La segnalazione sensoriale dalla periferia al sistema nervoso centrale (SNC) si basa sull'attivazione di neuroni sensoriali di primo ordine che risiedono negli allargamenti della radice dorsale, chiamati gangli della radice dorsale (DRG). Per la formazione e il mantenimento della mielina, la comunicaz....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state eseguite in conformità con la direttiva del Consiglio delle Comunità europee per la cura e l'uso di animali da laboratorio.
1. Coltura cellulare di Schwann
- Rivestimento per coltura cellulare Schwann
- Rivestire i piatti di coltura cellulare in condizioni sterili. Applicare 2 ml di poli-L-lisina (PLL) allo 0,01% su due piatti di coltura tissutale (TC) da 60 mm ciascuno e incubare per una notte a 4 °C.
- Rimuovere il PLL, lavare le stoviglie TC 2x con acqua distillata e incubare con 2 ml di 1 μg/cm2 di laminina per una notte a 4 °C. Lavare i piatti TC 2 volte c....
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Risultati
La mielinizzazione nella cocultura è stata valutata nei giorni 10, 12, 14, 16, 18 e 20. Gli espianti DRG e le cellule di Schwann sono stati colorati per MBP, βIII-tubulina e DAPI. La rete assonale nella cocultura era densa e non cambiava visibilmente nel corso dell'osservazione. I primi segni di mielina, sotto forma di piccoli frammenti, erano rilevabili il giorno 10 e aumentavano il giorno 12 (Figura 2). Le aree MBP-positive sono aumentate nel tempo fino al giorno 20 della cultura. La mieli.......
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Discussione
Qui, presentiamo un protocollo rapido e facile per la generazione di mielinizzazione in vitro fondendo due colture di tipo cellulare separate, cellule di Schwann e espianti di ganglio della radice dorsale.
Un passaggio critico del protocollo è la coltivazione di espianti DRG, soprattutto nei primi giorni di coltura. I DRG sono molto fragili prima che venga costruita una forte rete assonale e devono essere maneggiati con molta attenzione, ad esempio, quando vengono estratti dall'incuba.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Prof. Dr. Ralf Gold e il PD Dr. Gisa Ellrichmann per i loro consigli e supporto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anti-MBP, coniglio | Novus Biologicals, Centannial, USA | ABIN446360 | |
| Anti-ß III-tubulina, topo | Biolegend, San Diego, USA | 657402 Acido | |
| ascorbico | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | A4403-100MG | |
| Integratore di B27 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | 17504-044 | |
| Puntale filtrante per biosfera, 100 &; micro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Puntale con filtro a biosfera, 1250 & micro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Puntale filtrante Biosfera, 20 &; micro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Ugello filtro Biosphere, 300 &; micro; L | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Albumina sierica bovina | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | 8076.4 | |
| Filtro cellulare, 100 &; micro; M | BD Bioscience, Heidelberg, Germania | 352360 | |
| Centrifuga 5810-R | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | 5811000015 | |
| CO2 Incubatore Heracell | Heraeus Instruments, Hanau, Germania | ||
| Vetrini coprioggetti 12 mm | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | P231.1 | |
| Pinze fini curve | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 11370-42 | |
| DAPI fluoromount-G(R) | Biozol, Eching, Germania | SBA-0100-20 | |
| Dispase II | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | ||
| Acqua distillata (sistema di purificazione dell'acqua) | Millipore, Molsheim, Francia | ZLXS5010Y | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania. | ||
| DPBS (no Ca2+ e no Mg2+) | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | D8537-6X500ML | |
| Etanolo | VWR, Radnor, Stati Uniti | ||
| FCS | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | F7524 | FCS deve essere testato per la coltura cellulare Schwann |
| Pinze fini (Dumont #5) | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 11252-20 | |
| Pinze | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 11370-40 | |
| Forskolin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | F6886-10MG | |
| Gelatina | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | G1393-20ML | |
| Gentamicina | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | 5710064 | |
| Capra anti-topo IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | A11036 | |
| Capra anti-coniglio IgG Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | A11001 | |
| HBSS (no Ca2+ e no Mg2+) | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | ||
| Incubatore HERAcell | Heraeus Instruments, Hanau, Germania | ||
| Heraguard ECO 1.2 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | ||
| Siero di cavallo | Pan-Biotech, Aidenbach, Germania | P30-0712 | |
| Image J Software | HIH, Bethesda, USA | ||
| Laminin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | L2020-1MG | |
| Leibovitz´ s L-15 Medium | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | ||
| L-Glutammina 200 mM | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | ||
| MACS Multistand | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130042303 | |
| Microscissors | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 15000-08 | |
| Microscopio | Motic, Wetzlar, Germania | Motic BA 400 | |
| Microscopio Axio observer 7 | Zeiss, Oberkochen, Germania | 491917-0001-000 | |
| Vetrino per microscopio | VWR, Radnor, USA | 630-1985 | |
| Separatore MiniMACS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130091632 | |
| colonne MS | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-042-201 | |
| Camera di conteggio Neubauer | Assistente, Erlangen, Germania | 40441 | |
| Neuregulin | Peprotech, Rocky Hill, USA | 100-03 | |
| Mezzo neurobasale | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | ||
| NGF | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | N1408 | |
| Siero di capra normale | Biozol, Eching, Germania | S-1000 | |
| Nunclon & Delta; multipiatti, 4 pozzetti | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | D6789 | |
| Paraformaldeide | Acros Organics, New Jersey, Stati Uniti | ||
| Penicillina/Streptomicina | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | 15140-122 | |
| Pipetboy | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | 4430000018 | |
| Pipette | Eppendorf AG, Amburgo, Germania | 2231300004 | |
| Poly-D-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | P6407-5MG | |
| Poly-L-Lysin | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | P4707-50ML | |
| Provette di reazione, 15 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Provette di reazione, 50 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Recipienti di reazione, 1,5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Armadio di sicurezza 72690001 S2020 1.8 | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | ||
| Forbici | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 14083-08 | |
| Pipetta sierologica, 10 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Pipetta sierologica, 25 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Pipetta sierologica, 5 mL | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Spatula | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 10094-13 | |
| Stereomicroscopio Discovery.V8 | Zeiss, Oberkochen, Germania | 495015-0012-000 | |
| Forbici chirurgiche | Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Germania | 14007-14 | |
| TC piatto 100, cella + | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| piatto TC 35, cella + | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| Piatto TC 60, cella + | Sarstedt, Nü mbrecht, Germania | ||
| 833901300 Thy-1 Microbeads (MACS Kit) | Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germania | 130-094-523 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | X100-500ML | |
| Soluzione blu di tripano 0,4% | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | ||
| tripsina (2,5%), senza rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania. | 15090-046 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenolo | Thermo Fisher Scientific, Schwerte, Germania | 25300-054 | |
| Tipo I Collagenase | Sigma Aldrich GmbH, Steinheim, Germania | C1639 | |
| Bagnomaria tipo 1008 | GFL, Burgwedel, Germania | Codice: 4285 |
Riferimenti
- Lee, K. H., Chung, K., Chung, J. M., Coggeshall, R. E. Correlation of cell body size, axon size, and signal conduction velocity for individually labelled dorsal root ganglion cells in the cat. The Journal of Comparative Neurology. 243 (3), 335-346 (1986).
- Taveggia, C.
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Ristampe e permessi
